抗体的制作方法

抗体
1.本技术是申请日为2016年8月9日、中国专利申请号为201680058931.4且发明名称为“抗体”的中国专利申请的分案申请，并且本技术要求享有申请号为2015
‑
158414的日本技术的优先权。
技术领域
2.本发明公开了一种新抗体及其用途等。


背景技术：

3.多发性骨髓瘤是导致浆细胞肿瘤性生长的疾病的典型实例，约占所有癌症的1％，占所有恶性血液肿瘤的10％以上。多发性骨髓瘤是一种骨髓中存在的浆细胞发生癌变并进行单克隆生长的疾病。在多发性骨髓瘤中，异常浆细胞(骨髓瘤细胞)扩散到整个身体的骨髓，并在整个身体的骨髓的每个部分中生长。当异常浆细胞生长时，会出现各种症状，包括骨折。骨髓瘤细胞产生为异常免疫球蛋白的m蛋白，从而增加了血液中m蛋白的浓度，因此血液变得粘稠。m蛋白不能像通常的抗体那样发挥功能(正常抗体识别诸如病原体等侵入身体的异物)，从而降低免疫能力。这些现象影响许多器官并导致各种症状。典型症状是骨痛和骨骼损伤、高钙血症、肾病和肾衰竭、贫血等。
4.目前主要应用的多发性骨髓瘤的治疗是蛋白酶体抑制剂imid(如沙利度胺及其衍生物，特别是来那度胺)、使用例如美法仑与泼尼松组合的化学疗法以及造血干细胞移植。然而，在大多数情况下，骨髓瘤细胞最终获得对这些治疗剂的抗性。因此，现实情况是，在目前的治疗方法中，骨髓瘤患者预后并不乐观，发病后平均生存期是3年至5年。此外，还产生了一个问题，这些治疗剂并不仅仅特异地作用于靶肿瘤细胞。因此，所述药剂对正常细胞也显示出毒性，由此引起严重的副作用。
5.已经尝试通过使用单克隆抗体开发用于多发性骨髓瘤的治疗方法。例如，仅最近就在临床上应用了抗cs1抗体(专利文献1)和抗cd38抗体(专利文献2)。
6.文献列表
7.非专利文献
8.非专利文献1:lonial et al.,official journal of the american society of clinical oncology,2012jun 1；30(16):1953
‑
1959。
9.非专利文献2:de weers et al.,journal of immunology,2011feb 1；186(3):1840
‑
1848。
10.非专利文献3:j immunol.2009nov 1；183(9):5563
‑
74。
11.非专利文献4:n engl j med.2014oct 16；371(16):1507
‑
17。
12.非专利文献5:nat biotechnol.2002jan；20(1):70
‑
5。


技术实现要素：

13.技术问题
14.抗cs1抗体对骨髓瘤细胞显示出相对高的特异性，但单独使用该抗体不一定显示出高水平的抗骨髓瘤效果。该抗体作为单一药物的功效尚未在临床试验中得到证实。发现抗cs1抗体与来那度胺的组合使用增加了抗cs1抗体的抗肿瘤效果，并且美国fda批准将抗
‑
cs1抗体用于该组合使用。虽然抗cd38抗体也被fda批准，但是由于cd38在正常血细胞(包括许多cd34阳性造血祖细胞)中的表达，作为多发性骨髓瘤治疗靶标的cd38是表现出低特异性的抗原。鉴于这种现状，本发明的一个目的是提供一种更有效的手段来治疗涉及浆细胞的肿瘤性生长的疾病，如多发性骨髓瘤。
15.解决问题的方案
16.本发明人为实现该目的而进行了广泛的研究，并提出了新的观点：即使蛋白不是骨髓瘤细胞所特有的，如果蛋白的翻译后修饰是骨髓瘤细胞所特有的，则识别它的抗体对骨髓瘤具有特异性。然后发明人预期通过分离与骨髓瘤细胞和骨髓瘤祖细胞特异性结合的抗体并鉴定抗体识别的蛋白，将能够揭示蛋白是否是骨髓瘤细胞所特有的，或者尽管蛋白不是骨髓瘤细胞所特有的，但揭示抗体是否仅识别具有一些骨髓瘤特有的翻译后修饰的蛋白。他们进一步认为，最终，将有可能获得如上所述的抗体，该抗体仅识别具有骨髓瘤细胞和骨髓瘤祖细胞所特有的翻译后修饰的蛋白。
17.基于这一概念，本发明人使用多发性骨髓瘤细胞系制备了10,000个以上与这些细胞系结合的单克隆抗体的克隆，从克隆中选择不与正常血细胞结合的抗体，并鉴定出被该抗体识别的蛋白。结果如后述的实施例所示，鉴定出r8h283抗体，并揭示了r8h283抗体结合的抗原为cd98hc。尽管cd98hc在正常血细胞中表达，但确认了r8h283抗体特异性识别骨髓瘤细胞，因为r8h283抗体所针对的表位存在于cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域中，并且n
‑
聚糖在骨髓瘤细胞(包括骨髓瘤浆细胞和骨髓瘤祖细胞)中的附着方式与在正常血细胞中的附着方式不同。另外，本发明人证实了r8h283抗体具有细胞毒活性，通过向移植了骨髓瘤细胞的动物施用该抗体可以抑制骨髓瘤细胞的增殖，并且除了骨髓瘤细胞之外，r8h283抗体还识别各种其他肿瘤细胞。在基于这些发现进一步研究和详尽考虑后，发明人提出了由以下主题表示的发明。
18.1.抗体
19.第1
‑
1项
20.抗人cd98hc抗体，当去除结合至人cd98hc的糖链时，所述抗人cd98hc抗体对人cd98hc的亲和力增加。
21.第1
‑
1.5项
22.抗人cd98hc抗体，当用衣霉素处理表达人cd98hc的细胞时，所述抗人cd98hc抗体对所述细胞的亲和力增加。
23.第1
‑
2项
24.抗人cd98hc抗体，其对cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当，在所述cd98hc变体中，人cd98hc的395
‑
397位上的氨基酸残基被所述小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代。
25.第1
‑
3项
26.抗人cd98hc抗体，其对cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当，在所述cd98hc变体中，人cd98hc的400
‑
401位上的氨基酸残基被所述小鼠来源的cd98hc
的氨基酸残基取代。
27.第1
‑
4项
28.抗体，其识别包含人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的表位。
29.第1
‑
5项
30.抗体，其表位存在于人cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域内。
31.第1
‑
6项
32.抗体，其包含选自第1
‑
1项至第1
‑
5项中的至少2项所记载的特征。
33.第1
‑
7项
34.根据第1
‑
5项或第1
‑
6项所述的抗体，其中所述区域是人cd98hc上的seq id no:24的氨基酸序列。
35.第1
‑
8项
36.根据第1
‑
5项或第1
‑
6项所述的抗体，其中所述区域是人cd98hc上的seq id no:22的氨基酸序列。
37.第1
‑
9项
38.根据第1
‑
9项所述的抗体，其中所述区域是人cd98hc上的seq id no:23的氨基酸序列。
39.第1
‑
10项
40.根据第1
‑
1项至第1
‑
9项中任一项所述的抗体，其表位存在于seq id no:24的氨基酸序列的区域内。
41.第1
‑
11
42.抗体，其表位存在于人cd98hc的seq id no:24的氨基酸序列的区域内。
43.第1
‑
12项
44.根据第1
‑
1项至第1
‑
11项中任一项所述的抗体，其表位存在于seq id no:22的氨基酸序列的区域内。
45.第1
‑
13项
46.抗体，其表位存在于人cd98hc的seq id no:22的氨基酸序列的区域内的。
47.第1
‑
14项
48.根据第1
‑
1项至第1
‑
13项中任一项所述的抗体，其表位存在于seq id no:23的氨基酸序列的区域内。
49.第1
‑
15项
50.抗体，其表位存在于人cd98hc的seq id no:23的氨基酸序列的区域内。
51.第1
‑
16项
52.根据第1
‑
1项至第1
‑
15项中任一项所述的抗体，其表位与r8h283抗体所针对的表位相同。
53.第1
‑
17项
54.根据第1
‑
1项至第1
‑
16项中任一项所述的抗体，其对不具有n
‑
聚糖的人cd98hc的亲和力高于其对具有n
‑
聚糖的人cd98hc的亲和力。
55.第1
‑
18项
56.根据第1
‑
1项至第1
‑
17项中任一项所述的抗体，其包含：
57.重链可变区，所述重链可变区包含：
58.包含含有氨基酸序列seq id no:1的氨基酸序列的重链cdr1，
59.包含含有氨基酸序列seq id no:2的氨基酸序列的重链cdr2，和/或
60.包含含有氨基酸序列seq id no:3的氨基酸序列的重链cdr3；和/或
61.轻链可变区，所述轻链可变区包含：
62.包含含有氨基酸序列seq id no:5的氨基酸序列的轻链cdr1，
63.包含含有氨基酸序列seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr2，和/或
64.包含含有氨基酸序列seq id no:7的氨基酸序列的轻链cdr3。
65.第1
‑
19项
66.根据第1
‑
1项至第1
‑
18项中任一项所述的抗体，其包含：
67.包含氨基酸序列seq id no:4的重链可变区，和/或
68.包含氨基酸序列seq id no:8的轻链可变区。
69.第1
‑
20项
70.根据第1
‑
1项至第1
‑
19项中任一项所述的抗体，其为fv、scfv、双体抗体、三体抗体、四体抗体或它们的组合。
71.第1
‑
21项
72.根据第1
‑
1项至第1
‑
20项中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。
73.第1
‑
22项
74.根据第1
‑
1项至第1
‑
7项和第1
‑
21项中任一项所述的抗体，其包含恒定区。
75.第1
‑
23项
76.根据第1
‑
1项至第1
‑
19项和第1
‑
21项中任一项所述的抗体，其为嵌合抗体。
77.第1
‑
24项
78.根据第1
‑
1项至第1
‑
23项中任一项所述的抗体，其为人源化抗体。
79.第1
‑
25项
80.根据第1
‑
1项至第1
‑
24项中任一项所述的抗体，其为人抗体。
81.第1
‑
26项
82.根据第1
‑
1项至第1
‑
19项和第1
‑
21项至第1
‑
25项中任一项所述的抗体，其为免疫球蛋白、fab、f(ab)
′
、微抗体、scfv
‑
fc或它们的组合。
83.第1
‑
27项
84.根据第1
‑
1项至第1
‑
19项和第1
‑
21项至第1
‑
26项中任一项所述的抗体，其为iga、igd、ige、igg或igm。
85.第1
‑
28项
86.根据第1
‑
1项至第1
‑
19项和第1
‑
21项至第1
‑
27项中任一项所述的抗体，其包含：
87.含有氨基酸序列seq id no:5的重链，和/或
88.含有氨基酸序列seq id no:10的轻链。
89.第1
‑
29项
90.根据第1
‑
1项至第1
‑
19项以及第1
‑
21项至第1
‑
28项中任一项所述的抗体，其具有细胞毒活性。
91.第1
‑
30项
92.根据第1
‑
1项至第1
‑
29中任一项所述的抗体，其具有与其结合的细胞毒素。
93.第1
‑
31项
94.根据第1
‑
1项至第1
‑
30中任一项所述的抗体，其为多特异性抗体。
95.第1
‑
32项
96.多核苷酸，其编码第1
‑
1项至第1
‑
31项中任一项所述的抗体。
97.第1
‑
33项
98.宿主细胞，其包含第1
‑
33项所述的多核苷酸。
99.第1
‑
34项
100.根据第1
‑
33项所述的宿主细胞，其为t细胞。
101.2.嵌合抗原受体
102.第2
‑
1项
103.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其对人cd98hc的亲和力通过除去结合至人cd98hc的糖链而增加。
104.第2
‑
1.5项
105.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其对表达人cd98hc的细胞的亲和力通过用衣霉素处理细胞而增加。
106.第2
‑
2项
107.一种抗人cd98hc嵌合抗原受体，其对cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当，在所述cd98hc变体中，人cd98hc的395
‑
397位上的氨基酸残基被所述小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代。
108.第2
‑
3项
109.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其对cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当，在所述cd98hc变体中，人cd98hc的400
‑
401位上的氨基酸残基被所述小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代。
110.第2
‑
4项
111.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其识别包含人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的表位。
112.第2
‑
5项
113.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其包含选自第2
‑
1项至第2
‑
4项中的至少2项中记载的特征。
114.第2
‑
6项
115.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其表位存在于人cd98hc的seq id no:24的氨基酸序列的区域内。
116.第2
‑
7项
117.根据第2
‑
1项至第2
‑
5项中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体，其表位存在于人cd98hc的seq id no:24的氨基酸序列的区域内。
118.第2
‑
8项
119.根据第2
‑
1项至第2
‑
5项中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体，其表位存在于
人cd98hc的seq id no:22的氨基酸序列的区域内。
120.第2
‑
9项
121.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其表位存在于人cd98hc的seq id no:22的氨基酸序列的区域内。
122.第2
‑
10项
123.根据第2
‑
1项至第2
‑
9项中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体，其表位存在于seq id no:23的氨基酸序列的区域内。
124.第2
‑
11项
125.抗人cd98hc嵌合抗原受体，其表位存在于人cd98hc的seq id no:23的氨基酸序列的区域内。
126.第2
‑
12项
127.根据第2
‑
1项至第2
‑
11项中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体，其表位与r8h283抗体所针对的表位相同。
128.第2
‑
13项
129.根据第2
‑
1项至第2
‑
12项中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体，其对不具有n
‑
聚糖的人cd98hc的亲和力高于其对具有n
‑
聚糖的人cd98hc的亲和力。
130.第2
‑
14项
131.根据第2
‑
1项至第2
‑
13项中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体，其包含：
132.重链可变区，所述重链可变区包含：
133.包含含有氨基酸序列seq id no:1的氨基酸序列的重链cdr1，
134.包含含有氨基酸序列seq id no:2的氨基酸序列的重链cdr2，和
135.包含含有氨基酸序列seq id no:3的氨基酸序列的重链cdr3；和/或
136.轻链可变区，所述轻链可变区包含：
137.包含含有氨基酸序列seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr1，
138.包含含有氨基酸序列seq id no:7的氨基酸序列的轻链cdr2，和
139.包含含有氨基酸序列seq id no:8的氨基酸序列的轻链cdr3。
140.第2
‑
15项
141.根据第2
‑
1项至第2
‑
14项中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体，其包含：
142.含有氨基酸序列seq id no:4的重链可变区，和/或
143.含有氨基酸序列seq id no:9的轻链可变区。
144.第2
‑
16项
145.多核苷酸，其编码第2
‑
1项至第2
‑
15中任一项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体。
146.第2
‑
17项
147.宿主细胞，其包含第2
‑
16项所述的多核苷酸。
148.第2
‑
18项
149.根据第2
‑
17项所述的宿主细胞，其为t细胞。
150.第2
‑
19项
151.根据第2
‑
18项所述的宿主细胞，其为嵌合抗原受体t细胞或嵌合抗原受体nk细胞。
152.3.药物组合物和治疗方法
153.第3
‑
1项
154.药物组合物，其包含选自第1
‑
1项至第1
‑
34中任一项所述的抗体、第2
‑
19项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体t细胞和第2
‑
19项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体nk细胞中的至少一种成分。
155.第3
‑
2项
156.根据第3
‑
1项所述的药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤。
157.第3
‑
3项
158.根据第3
‑
1项或第3
‑
2项所述的药物组合物，其用于治疗或预防引起浆细胞肿瘤性生长的疾病。
159.第3
‑
4项
160.一种方法，其包括向需要治疗疾病的患者施用第3
‑
1项所述的药物组合物。
161.第3
‑
5项
162.根据第3
‑
4项所述的方法，其中所述患者患有癌症。
163.第3
‑
6项
164.根据第3
‑
5项所述的方法，其中所述患者患有导致浆细胞肿瘤性生长的疾病。
165.第3
‑
7项
166.选自第1
‑
1项至第1
‑
34项中任一项所述的抗体、第2
‑
19项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体t细胞和第2
‑
19项所述的抗人cd98hc嵌合抗原受体nk细胞中的至少一种成分用于生产药物组合物的用途。
167.第3
‑
8项
168.根据第3
‑
7项所述的用途，其中所述药物组合物用于治疗或预防肿瘤。
169.第3
‑
9项
170.根据第3
‑
8项所述的用途，其中所述药物组合物用于治疗或预防导致浆细胞肿瘤性生长的疾病。
171.4.筛选方法
172.第4
‑
1项
173.有效治疗或预防肿瘤的物质的筛选方法，所述方法包括从候选物质组中选择与含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点的区域特异性结合的物质，所述区域通过抑制n连接糖基化而暴露。
174.第4
‑
2项
175.根据第4
‑
1项所述的方法，其还包括筛选具有细胞毒活性的物质。
176.5.诊断方法
177.第5
‑
1项
178.用于诊断肿瘤的方法，所述方法包括使从测试个体收集的样品与第1
‑
1项至第1
‑
34项中任一项所述的抗体接触。
179.第5
‑
2项
180.根据第5
‑
1项所述的方法，所述方法包括当检测到与抗体结合的细胞时，诊断肿瘤的存在。
181.第5
‑
3项
182.根据第5
‑
1项或第5
‑
2项所述的方法，其中所述样品是血液或骨髓液。
183.第5
‑
4项
184.用于诊断肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含第1
‑
1项至第1
‑
34项中任一项所述的抗体。
185.发明的有益效果
186.因为上述抗体特异性识别骨髓瘤祖细胞、骨髓瘤浆细胞和其他肿瘤细胞，所以该抗体能够有效治疗诸如恶性肿瘤的疾病，而不靶向正常细胞。
附图说明
187.图1显示了：(a)通过流式细胞术从候选抗体中选择结合cd45
‑
cd38 cd138 骨髓瘤浆细胞和cd45
‑
cd38 cd138
‑
骨髓瘤祖细胞但不结合cd45 血细胞的抗体的过程；(b)通过facs证实的结果，即r8h283抗体结合cd45
‑
cd38 cd138 骨髓瘤浆细胞和cd45
‑
cd38 cd138
‑
骨髓瘤祖细胞但不结合cd45 血细胞。
188.图2显示了r8h283抗体与源自多发性骨髓瘤患者的骨髓瘤祖细胞、骨髓瘤浆细胞和cd45阳性白细胞的结合。
189.图3显示了通过facs分选将r8h283抗体结合的baf3细胞(最初小于0.1％)浓缩的过程，并鉴定了结合的抗原cd98hc。
190.图4显示了由facs证实的结果，即r8h283抗体结合u266细胞但不结合cd98hc缺陷型u266细胞。mem
‑
108是抗人cd98抗体。
191.图5显示r8h283抗体和mem
‑
108抗体与来自健康个体的外周血细胞(a)和骨髓细胞(b)的细胞级分结合的facs分析结果。
192.图6显示了研究结果，在所述研究中将不同浓度的r8h283抗体和mem
‑
108抗体与来自健康个体外周血的b淋巴细胞和t淋巴细胞结合并用抗小鼠igg
‑
pe抗体染色，随后进行facs分析。横轴表示抗体浓度，纵轴表示荧光强度。与mem108不同，即使抗体浓度增加，r8h283也完全不与淋巴细胞结合。
193.图7显示了r8h283抗体和mem
‑
108抗体与正常血管内皮细胞(huvec细胞)结合的facs分析结果。
194.图8显示了r8h283抗体与各种癌细胞系结合的facs分析结果。
195.图9显示了r8h283抗体、抗cs1抗体、cd38抗体和抗bst2抗体与来自健康个体的外周血细胞的各种细胞级分结合的facs分析结果。
196.图10显示了(a)r8h283抗体和mem
‑
108抗体与骨髓瘤细胞系rpmi8226和髓细胞性白血病细胞系u937结合的facs分析结果，和(b)研究结果，在所述研究中，使不同浓度的r8h283抗体和mem
‑
108抗体与骨髓瘤细胞系rpmi8226和髓细胞性白血病细胞系u937结合，并用抗小鼠igg
‑
pe抗体染色，然后进行facs分析。横轴表示抗体浓度，纵轴表示荧光强度。与mem108不同，即使抗体浓度增加，r8h283几乎不与u937结合。
197.图11显示了(a)r8h283和mem
‑
108与用衣霉素(2.5μg/ml)处理48小时的u937细胞和未处理的u937细胞的结合的facs分析结果。数值表示r8h283结合的平均荧光强度(通过用平均荧光强度(mfi)除以同种型对照的mfi得到的校正值)。图11还显示了(b)r8h283抗体或mem
‑
108与用毒胡萝卜素(1mm)处理48小时的u937细胞和未处理的u937细胞的结合facs
分析结果。
198.图12显示了研究结果，在所述研究中，对用毒胡萝卜素(1mm)处理48小时的u937细胞溶解物或用毒胡萝卜素(1mm)处理48小时的thp1细胞的细胞溶解物以及未处理细胞的细胞溶解物各自进行sds
‑
page凝胶电泳，然后使用多克隆抗cd98抗体(h300：圣克鲁斯生物技术公司(santa cruz biotechnology,inc.))进行蛋白印迹实验。通过由毒胡萝卜素处理导致的对内质网功能的抑制，cd98的分子量降低，表明可能表达不完全的糖基化。
199.图13显示了：(a)r8h283抗体与用硼替佐米(10nm)处理16小时的mm1s骨髓瘤细胞和未处理的mm1s细胞的结合的facs分析结果；(b)r8h283抗体和mem
‑
108抗体与用硼替佐米(2nm)处理48小时的骨髓细胞和源自骨髓瘤患者的未处理的细胞的结合的facs分析结果。图13显示了r8h283抗体和mem
‑
108抗体与cd138阳性cd38强阳性骨髓瘤细胞(mm)和cd3阳性t细胞的结合的facs分析结果。
200.图14显示了人/小鼠嵌合体cd98hc蛋白的构建以及r8h283抗体或mem
‑
108抗体与瞬时表达蛋白的cho细胞的结合的存在或不存在(上图)，以及r8h283抗体和mem
‑
108抗体与瞬时表达人/小鼠嵌合体cd98hc蛋白的cho细胞的结合的facs分析结果(下图)。
201.图15显示了人/小鼠嵌合体cd98hc蛋白的构建以及r8h283抗体与瞬时表达蛋白的cho细胞的结合的存在或不存在(上图)以及r8h283抗体与瞬时表达人/小鼠嵌合体cd98hc蛋白的cho细胞结合的facs分析结果(下图)。
202.图16显示(a)和(b)：由r8h283抗体引起的抗体依赖性细胞毒性的存在或不存在，并且显示(c)和(d)：由r8h283抗体引起的补体依赖性细胞毒性的存在或不存在。u266、opm2、nci
‑
h929和rpmi8226都是骨髓瘤细胞系。在(b)和(d)中显示其结果的测试中，加入每种抗体以达到10μg/ml的终浓度。
203.图17显示(a)和(c)：由皮下移植到scid小鼠中的骨髓瘤细胞系opm2形成的肿瘤块体积的变化，以及(b)：在第21天对照小鼠的肿瘤大小以及使用r8h283抗体的小鼠的肿瘤大小。箭头指示肿瘤的宽度。
204.图18显示了(a)用于确认r8h283抗体对通过静脉循环移植到nog小鼠中的骨髓瘤细胞系u266的治疗效果的实验设计(左)和第14天的骨髓分析结果的实例(右)。图18显示了(b)证实r8h283抗体具有剂量依赖性地清除骨髓中移植的u266细胞的能力的结果，以及(c)在施用5mg/kg的抗体后第40天通过ivis观察到的u266细胞的扩散。
205.图19显示了(a)用于确认r8h283抗体对移植到brgs
‑
小鼠骨髓中的骨髓瘤细胞系u266的治疗效果的治疗实验设计和(b)通过萤光素酶表达检测的在施用抗体或硼替佐米(bor)之前和之后骨髓中肿瘤体积的结果。图19还显示(c)各治疗组的肿瘤体积的变化。
206.图20的上图显示人/鼠嵌合体cd98hc的结构。“m328h427”是指cd98hc的328
‑
427位氨基酸残基是人源cd98hc的氨基酸残基，其余氨基酸残基是小鼠起源的氨基酸残基。这同样适用于其他嵌合体cd98hc。图20的下图显示了r8h283抗体与瞬时表达人/小鼠嵌合体cd98hc的293t细胞的结合强度。纵轴的mfi表示r8h283抗体的结合强度；数值越高，结合越强。
207.图21显示了人cd98hc和小鼠cd98hc的第365
‑
409位氨基酸序列。虚线包围的区域表示当这些区域中的氨基酸残基被小鼠来源的氨基酸残基取代时，r8h283抗体不会与这些序列结合。箭头所示的氨基酸残基是在人cd98hc和小鼠cd98hc之间不同的氨基酸残基。
208.图22显示了r8h283抗体与表达人cd98hc、小鼠cd98hc或7种类型的人cd98hc变体的293t细胞的结合强度。上图显示流式细胞术的结果，下图直观地示出mfi。
具体实施方案
209.1.定义
[0210]“骨髓瘤祖细胞”是处于分化成骨髓瘤浆细胞之前的阶段的祖细胞。尽管骨髓瘤祖细胞高水平表达cd38，但该细胞的特征在于不存在cd138表达，cd138表达是成熟浆细胞特有的标记。因此，骨髓瘤祖细胞也可以被称为“cd38 cd138
‑
细胞”或“cd19
‑
cd38 cd138
‑
细胞”。
[0211]“骨髓瘤浆细胞”通常也称为“骨髓瘤细胞”，其产生m蛋白，m蛋白为异常免疫球蛋白。在骨髓瘤浆细胞中，除了高水平的cd38表达外，cd138也被表达。因此，骨髓瘤浆细胞也可以称为“cd38 cd138 细胞”或“cd19
‑
cd38 cd138 细胞”。
[0212]“骨髓瘤祖细胞”和“骨髓瘤浆细胞”还分别指在除了多发性骨髓瘤以外的、引起浆细胞肿瘤性生长的疾病中的肿瘤祖细胞和肿瘤浆细胞。
[0213]“造血祖细胞”是能够分化成各种血细胞的细胞。造血祖细胞的特征在于cd34的表达。因此，如本文所用的“造血祖细胞”可以被称为“cd34 细胞”。
[0214]
在本说明书中，虽然“包含”、“含有”，“包括”和“具有”是开放式语言术语，但这些术语包括封闭式语言术语“由......组成”的概念，并且在实施例中可被“由......组成”替换。
[0215]
2.抗体
[0216]
在一个实施方案中，提供了一种抗体，该抗体识别含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n连接糖基化而暴露的表位。cd98(或“4f2”)是约120kda的异二聚体蛋白，其在细胞膜上表达并且已知作为氨基酸转运蛋白发挥功能。cd98hc是约80kda的ii型跨膜蛋白，其构成cd98并且可以称为“4f2hc”或“slc3a2”。尽管人cd98hc存在几种同种型(例如b、c、e和f)，但是这些同种型的胞外结构域具有共同的氨基酸序列。序列表以seq id no:21显示了同种型f的氨基酸序列，其为典型的人cd98hc。在人cd98hc的结构中，n
‑
聚糖可结合至氨基酸序列seq id no:21的264位、280位、323位和405位。尽管本说明书中引用了人cd98hc的同种型f的氨基酸序列作为典型实例，但本领域技术人员将理解，在其他同种型中存在相应的序列和相应的序列氨基酸残基，并且功能相同。
[0217]
如后面所述的实施例所示，认为骨髓瘤细胞、骨髓瘤祖细胞及其他肿瘤细胞中cd98hc上的n
‑
聚糖发生了变化(例如n连接糖基化失败)。这可能是因为骨髓瘤细胞、骨髓瘤祖细胞和其他肿瘤细胞总是经受内质网应激，并且n连接糖基化受到抑制。这表明在其他正常细胞中抗体不能接近的cd98hc的氨基酸序列暴露于骨髓瘤细胞、骨髓瘤祖细胞或其他肿瘤细胞的表面，因此抗体可以接近该氨基酸序列。在本说明书中，将骨髓瘤细胞和骨髓瘤祖细胞所特有的该cd98hc区域称为“含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的区域”或“受到n
‑
聚糖的存在影响的区域”。因为表位存在于该区域中，抗体可以特异性识别骨髓瘤细胞或骨髓瘤祖细胞。该区域的大小可以是任意大小，没有特别限制。例如，该区域由40个以下的氨基酸残基、35个以下的氨基酸残基、30个以下的氨基酸残基、25个以下的氨基酸残基、20个以下的氨基酸残基、15个以下的氨基酸残基或10个以下的氨基
酸残基组成。在一个实施方案中，表位可能不含人cd98hc的n
‑
糖基化位点。
[0218]“人cd98hc的n
‑
糖基化位点”是指构成人cd98hc的氨基酸残基中与n
‑
聚糖结合的氨基酸残基。在一个实施方案中，n
‑
糖基化位点是氨基酸序列seq id no:21的264位、280位、323位或405位处的天冬酰胺残基。在优选的实施方案中，n
‑
糖基化位点是氨基酸序列seq id no:21的405位处的天冬酰胺残基。
[0219]
在一个实施方案中，抗人cd98hc抗体优选具有通过抑制n
‑
聚糖与细胞中表达的cd98hc的结合而使其对cd98hc的亲和力增加的特性。例如，通过用衣霉素、毒胡萝卜素或硼替佐米处理表达cd98hc的细胞，可以抑制n
‑
聚糖与cd98hc的结合。因此，如果与未经处理的细胞相比，通过用这些药剂处理表达人cd98hc的细胞(例如，u937细胞)增加了抗体与人cd98hc的结合量，则证实该抗体通过抑制n
‑
聚糖与人cd98hc的结合而对人cd98hc具有增加的亲和力或证实该抗体识别通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的表位。该方法还可以确定抗体针对的表位是否存在于受n
‑
聚糖的存在影响的区域内。具体而言，如果与未对细胞进行处理的情况相比，通过用药剂对表达人cd98hc的细胞进行处理而改变了抗体对人cd98hc的结合能力，则确定该抗体针对的表位存在于受n
‑
聚糖的存在影响的区域。
[0220]
在一个实施方案中，抗体优选是抗人cd98hc抗体，其对人cd98hc的亲和力通过除去与人cd98hc结合的糖链而增加。可以通过任何技术来确认一种抗体是否具有这种特性。例如，可以将抗体对在糖链与人cd98hc结合的条件下表达的人cd98hc的亲和力与抗体对在糖链的结合受到抑制或降低的条件下表达的人cd98hc的亲和力进行比较；然后确认抗体是否具有通过除去与人cd98hc结合的糖链而使其对人cd98hc的亲和力增加的特性。例如，通过如上所述用衣霉素、毒胡萝卜素或硼替佐米处理表达cd98hc的细胞，可以抑制或降低糖链与人cd98hc的结合。只要能使糖链的结合受到抑制或减少，对用衣霉素、毒胡萝卜素或硼替佐米处理表达人cd98hc的细胞的具体条件没有特别限制。例如，该条件可以符合后面描述的实施例中使用的条件。所使用的表达cd98hc的细胞例如是u937细胞。可以使用在流式细胞术分析中由抗体结合引起的荧光强度(平均荧光强度)的增加作为指标来测定亲和力的增加，流式细胞术分析按照后面所述的实施例中使用的条件进行。荧光强度的增加程度没有特别限制。例如，使用u937细胞时，荧光强度的增加程度优选为处理前荧光强度的1.5倍以上、1.7倍以上或2倍以上。使用thp
‑
1细胞时，荧光强度的增加程度优选为例如处理前荧光强度的3倍以上、4倍以上、5倍以上或6倍以上。
[0221]
在一个实施方案中，抗人cd98抗体优选是如下的抗人cd98hc抗体：其对cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当，其中在所述cd98hc变体中人cd98hc的395
‑
397位上的氨基酸残基被所述小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代。人cd98hc的395
‑
397位上的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代而形成的cd98hc变体是其中人cd98hc的395位上的f、396位上的p和397位上的d分别被i、f和h取代的人cd98hc变体。抗人cd98hc抗体对人cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的人cd98hc的亲和力相当，这意味着抗人cd98hc抗体基本不结合人cd98hc变体。
[0222]
在一个实施方案中，抗人cd98抗体优选是如下的抗人cd98hc抗体：其对cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当，其中在所述cd98hc变体中人cd98hc的400
‑
401位上的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代。人cd98hc的400
‑
401位上的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代而形成的cd98hc变体是人cd98hc
的400位上的g和401位上的a分别被r和p取代的人cd98hc变体。抗人cd98hc抗体对人cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的人cd98hc的亲和力相当，这意味着抗人cd98hc抗体基本不结合人cd98hc变体。
[0223]
对人cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当意味着：用流式细胞仪在相同条件下测量小鼠来源的cd98hc的结合强度和cd98hc变体的结合强度；由它们之间的平均荧光强度(mfi)表示的结合强度比(cd98hc变体的结合强度/小鼠来源的cd98hc的结合强度)为1.1至0.9，优选为1.05至0.95。
[0224]
具有这种特性的抗体可以通过以下步骤获得。首先，按照后面所述的实施例的方法，使用已表达人cd98hc的小鼠细胞作为抗原，得到抗人cd98hc抗体。接下来，用得到的抗体将表达cd98hc变体的cho细胞染色，并进行流式细胞术分析，其中所述cd98hc变体是根据实施例的方法将人cd98hc的395
‑
397位上的氨基酸残基取代为小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基而制备的(在后面所述的实施例中的构建体f395i/p396f/d397h)。同时，表达小鼠cd98hc的cho细胞也被染色，并通过流式细胞术分析。最终，通过选择对人cd98hc变体的亲和力与对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当的抗体可以获得如下的抗人cd98hc抗体：其对cd98hc变体的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当，其中在所述cd98hc变体中人cd98hc的395
‑
397位上的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代。相当的亲和力是指在相同条件下用流式细胞仪测量的小鼠来源的cd98hc的结合强度与cd98hc变体的结合强度的比率(cd98hc变体的结合强度/小鼠来源的cd98hc的结合强度)为1.1
‑
0.9，优选为1.05
‑
0.95(结合强度以平均荧光强度(mfi)表示)。
[0225]
在一个实施方案中，通过抑制人cd98hc的n连接糖基化而暴露的表位优选存在于人cd98hc上对应于seq id no:21的203
‑
427位的区域中。在优选的实施方案中，抗体所针对的表位优选存在于人cd98hc上对应于seq id no:21的365
‑
427位的区域中。在另一个优选的实施方案中，抗体所针对的表位优选存在于人cd98hc上对应于seq id no:21的365
‑
409位的区域中。此处之所以使用短语“对应于”是因为在除了同种型f以外的人cd98hc中，所述的两个区域不一定是365
‑
427位和365
‑
409位(将n端的氨基酸残基作为1位)。seq id no:21的365
‑
427位氨基酸序列如下：fsygdeigldaaalpgqpmeapvmlwdessfpdipgavsanmtvkgqsedpgsllslfrrlsdqr(seq id no:22)。seq id no:21的365
‑
409位的氨基酸序列如下：fsygdeigldaaalpgqpmeapvmlwdessfpdipgavsanmtvk(seq id no:23)。因此，在优选的实施方案中，通过抑制人cd98hc的n连接糖基化而暴露的表位优选存在于人cd98hc的seq id no:22的氨基酸序列的区域中，更优选存在于seq id no:23的氨基酸序列的区域中。在序列表中seq id no:21的203
‑
427位的氨基酸序列显示为seq id no:24。
[0226]
在一个实施方案中，抗人cd98hc抗体所针对的表位优选存在于人cd98hc的365
‑
376位区域和395
‑
409位区域中。在一个实施方案中，抗人cd98hc抗体所针对的表位优选含有人cd98hc的374、375、395、396、397、400和401位上的氨基酸残基。如本文所用，除非另有说明，否则人cd98hc的氨基酸残基的位置是seq id no:21的氨基酸序列上的位置。
[0227]
可以通过以下步骤确认抗体所针对的表位是否存在于由seq id no:23表示的氨基酸序列的区域中。具体而言，构建多核苷酸；该多核苷酸编码人/小鼠嵌合体cd98hc，其中由seq id no:23表示的氨基酸序列以外的区域被小鼠来源的cd98hc的氨基酸序列取代。然后将多核苷酸在合适的细胞中强制表达。另外，制备了小鼠cd98hc被强制表达的同种细胞。
测量抗体与这些细胞的结合。当抗体与表达嵌合体cd98hc的细胞结合但不与表达小鼠cd98hc的细胞结合时，确定表位存在于该区域中。在此，以seq id no:23的氨基酸序列为例进行说明，对于其他区域或位点，也可以以同样地方式进行测定。
[0228]
识别含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的表位通过抑制n
‑
聚糖与人cd98hc的结合而增加对人cd98hc的亲和力的抗体的实例是在后面所述的实施例中得到的r8h283抗体。因此，在一个实施方案中，抗体所针对的表位优选与r8h283抗体所针对的表位相同。在另一个实施方案中，抗体优选是r8h283抗体。
[0229]
在一个实施方案中，抗体可以具有任何结构，只要抗体显示出上述特性即可。抗体优选具有与选自r8h283抗体的三个重链互补决定区(cdr
‑
h1、cdr
‑
h2和cdr
‑
h3)和三个轻链互补决定区(cdr
‑
l1、cdr
‑
l2和cdr
‑
l3)的至少一个互补决定区相同的互补决定区。r8h283抗体的重链高变区和轻链高变区的氨基酸序列如下表1所示。
[0230]
表1
[0231][0232][0233]
在一个实施方案中，抗体含有至少一个选自r8h283抗体的cdr
‑
h1、cdr
‑
h2、cdr
‑
h3、cdr
‑
l1、cdr
‑
l2和cdr
‑
l3的cdr，优选至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，优选全部6个cdr。在一个实施方案中，抗体优选至少含有r8h283抗体的cdr
‑
h3和/或cdr
‑
l3。
[0234]
在一个实施方案中，抗体的重链可变区优选具有与r8h283抗体的重链可变区(seq id no:4)相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体的轻链可变区优选具有与r8h283抗体的轻链可变区(seq id no:9)相同的氨基酸序列。抗体优选具有与r8h283抗体的重链可变区(seq id no:4)相同的氨基酸序列，以及具有与r8h283抗体的轻链可变区(seq id no:9)相同的氨基酸序列。如本文所用，“相同”的含义不仅包括氨基酸序列的完全匹配，而且还包括在一个或多个(例如15个或更少，优选10个或更少，优选5个或更少，优选3个或更少，优选2个)氨基酸残基不同的情况下，具有与r8h283抗体的表位基本相同的表位。
[0235]
在一个实施方案中，抗体的重链可变区的氨基酸序列与seq id no:4的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、优选至少98％、优选至少99％的同一性。在一个实施方案中，抗体的轻链可变区与seq id no:9的氨基酸序列具有至少95％、优选至少98％、优选至少99％的同一性。通过后面描述的技术测量氨基酸序列的同一性。
[0236]
只要抗体识别含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的表位，抗体可以具有任何结构，并且抗体不一定需要含有恒定区。例如，抗体的结构可以是选自fv、scfv、双体抗体、三体抗体、四体抗体及它们的任何组合的任何结构。
[0237]“fv”被认为是抗体的最小结构单元，并具有通过非共价、分子间相互作用而聚集的重链可变区和轻链可变区。在fv中，存在于重链可变区中的半胱氨酸残基的巯基和存在于轻链可变区中的半胱氨酸残基的巯基可以通过二硫键键合。
[0238]“scfv”具有重链可变区的c末端与轻链可变区的n末端通过接头结合的结构，也称为“单链抗体”。scfv可以具有重链可变区的n端和轻链可变区的c端通过接头结合的结构。
[0239]“双体抗体”、“三体抗体”和“四体抗体”分别指由上述scfv形成的二聚体、三聚体和四聚体，并且各自是通过例如可变区域的非共价、分子间相互作用聚集并使结构稳定的结构，与fv一样。
[0240]
可以通过选择本领域已知的任何方法来制备具有这种结构的抗体。例如，可以通过使用基因遗传工程技术构建表达载体，并使其在适于产生抗体的宿主细胞或无细胞表达系统中表达来获得抗体。宿主细胞可以是任何类型，并且对类型没有特别限制。例如，宿主细胞可以适当地选自原核细胞(例如大肠杆菌(escherichia coli)和放线菌)和真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)。通过对表达的抗体实施任何纯化技术可以获得高纯度抗体。
[0241]
在一个实施方案中，抗体优选具有恒定区。已知重链具有三种类型的恒定区，即ch1、ch2和ch3，轻链具有一种类型的恒定区cl。含有ch2和ch3的区域也称为“fc结构域”。抗体可以含有选自ch1、ch2、ch3和cl的至少一个恒定区，并且可以含有全部恒定区。
[0242]
取决于抗体的来源和种类，恒定区的氨基酸序列在某种程度上是恒定的。恒定区可以是任何来源的恒定区。例如，恒定区可以源自人、源自小鼠、源自大鼠、源自兔、源自猴或源自黑猩猩。恒定区的来源可以根据目的来选择，所述目的例如大量生产或使对人的免疫原性降低。
[0243]
在一个实施方案中，抗体优选是嵌合抗体。嵌合抗体可以通过例如用人源恒定区取代小鼠抗体的恒定区来获得。嵌合抗体可以根据已知的方法制备。
[0244]
在一个实施方案中，抗体优选是人源化抗体。人源化抗体可以通过例如用人抗体的氨基酸序列不仅取代小鼠抗体的恒定区的氨基酸序列而且还取代存在于可变区中的除高变区以外的区域中的氨基酸序列而获得。存在于可变区域中的、高变区以外的区域称为“fr”。可变区中在n末端与cdr1之间的fr1区、cdr1与cdr2之间的fr2区、cdr2与cdr3之间的fr3区以及cdr3与羧基末端(c末端)之间的fr4区在重链可变区和轻链可变区两者中均存在。可以通过人源化这些区域中的至少一个区域或全部区域来获得人源化抗体。通常人源化抗体的约90％以上的氨基酸序列是源自人的，但百分比不限于此。人源化抗体可以按照已知方法制备。
[0245]
在一个实施方案中，抗体优选是人抗体。人抗体是指整个结构(包括可变区)源自人的抗体。人抗体也可以称为“完全人源化抗体”。人抗体可以通过例如使用噬菌体展示的人抗体基因克隆法、涉及用eb病毒对人型转基因小鼠进行免疫和对产生人抗体的细胞进行永生化的制备方法或融合配偶体与人外周血单核细胞融合的方法。
[0246]
在一个实施方案中，抗体优选含有恒定区。包含恒定区的抗体的结构可以是任何
结构。例如，抗体可以为两种结构的组合物的免疫球蛋白，所述两种结构各自由具有重链可变区和重链恒定区的单个重链以及具有轻链可变区和轻链恒定区的单个轻链组成；或抗体也可具有称为“fab”、“f(ab
′
)
2”、“微抗体”、“scfv
‑
fc”或其任何组合的结构。在一个实施方案中，抗体可以是后面描述的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞、嵌合抗原受体nk细胞等。
[0247]“fab”包含含有重链可变区和在重链恒定区中的ch1的重链片段以及含有轻链可变区和轻链恒定区(cl)的轻链，并且重链可变区和轻链可变区通过上述非共价、分子间相互作用聚集，或通过二硫键相互结合。在fab中，ch1和cl可以通过各自半胱氨酸残基的巯基二硫键结合。
[0248]“f(ab
′
)
2”是指含有一对fab的结构，其中一个fab的ch1与另一fab的ch1通过各自半胱氨酸残基的巯基二硫键结合。
[0249]“微抗体”是指两个片段通过非共价、分子间相互作用在ch3
‑
ch3之间聚集的结构，其中所述两个片段各自含有与构成scfv的重链可变区结合的ch3。
[0250]“scfv
‑
fc”是指与微抗体一样，通过非共价、分子间相互作用而使各自含有scfv、ch2和ch3的2个抗体片段在ch3
‑
ch3之间聚集的结构，所述片段通过各ch3中含有的半胱氨酸残基的巯基二硫键结合。
[0251]
含有这些恒定区的各种抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，如同上述不含有这些恒定区的抗体一样。fab也可以通过例如使用蛋白酶(如木瓜蛋白酶)分解igg(免疫球蛋白)来获得。f(ab
′
)2也可以通过使用蛋白酶(如胃蛋白酶)分解igg来获得。
[0252]
在一个实施方案中，抗体优选是免疫球蛋白。对免疫球蛋白的种类没有特别限制。实例包括iga、igd、ige、igg和igm及其亚类。在一个实施方案中，抗体优选为igg。例如，如果抗体是小鼠来源的igg，则在四个亚类中igg2是优选的。
[0253]
含有恒定区的抗体的结构的实例包括具有seq id no:5的氨基酸序列的重链和/或具有seq id no:10的氨基酸序列的轻链。seq id no:5的氨基酸序列为含有r8h283抗体的重链可变区和igg抗体的重链恒定区的氨基酸序列。seq id no:10的氨基酸序列为含有r8h283抗体的轻链可变区和igg抗体的轻链恒定区的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体含有具有seq id no:5的氨基酸序列的重链和具有seq id no:10的氨基酸序列的轻链。
[0254]
当抗体含有选自seq id no:1
‑
10的至少一个氨基酸序列时，所述至少一个氨基酸序列可以含有任何突变，只要该抗体针对的表位存在于人cd98hc上受到n
‑
聚糖存在影响的区域内即可。在一个实施方案中，优选在抗体的高变区或互补决定区中没有突变。这是因为通常认为高变区或互补决定区中的突变会影响表位。因此，在一个实施方案中，可变区中的突变优选存在于重链fr区和轻链fr区中。通过将突变插入恒定区也可以调节抗体的adcc活性和/或cdc活性。
[0255]
对引入到选自seq id no:1
‑
10的至少一个氨基酸序列中的突变(氨基酸残基转换)的数目没有特别限制。在一个实施方案中，突变引入之前的氨基酸序列与突变引入后的氨基酸序列的同一性为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少约98％，并且优选至少99％。同一性百分比通过四舍五入确定。
[0256]
氨基酸的同一性可以用市售的分析工具或通过互联网可获得的分析工具(例如fasta、blast、psi
‑
blast或ssearch等软件)来计算。例如，通常应用于blast搜索的主要初
始条件如下所述。具体而言，氨基酸序列与其他序列的同一性的值(％)可以通过使用blastp程序在advanced blast 2.1上进行搜索来计算，将期望值设置为10，所有滤波器关闭，矩阵使用blosum62，将空位存在罚分(gap existence cost)、每残基空位罚分(per residue gap cost)和λ比分别设置为11、1和0.85(默认值)，并且将其他各参数也设置为默认值。
[0257]
引入到上述氨基酸序列中的突变例如是取代、缺失或插入。具体的突变引入不受特别限制，只要可以使用常规方法实现即可。氨基酸的取代优选为保守取代。保守取代是指一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，其中所述另一个氨基酸残基具有与被取代的氨基酸残基的侧链相似的侧链。
[0258]
具体的保守氨基酸取代包括：在各自具有碱性侧链的氨基酸残基(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)之间进行的取代；在各自具有酸性侧链的氨基酸残基(例如天冬氨酸和谷氨酸)之间进行的取代；在各自具有不带电荷的极性侧链的氨基酸残基(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)之间进行的取代；在各自具有非极性侧链的氨基酸残基(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)之间进行的取代；在各自具有β分支侧链的氨基酸残基(如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)之间进行的取代；以及在各自具有芳香族侧链的氨基酸残基(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)之间进行的取代。
[0259]
在一个实施方案中，抗体优选具有细胞毒活性。细胞毒活性是指抗体与细胞结合以杀死细胞(或阻止其增殖)的活性，其机理不受特别限制。例如，细胞毒活性由补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞毒性(adcc)、细胞凋亡诱导作用或通过阻断配体键进行的存活信号传导抑制作用产生，或通过这些作用中的两种或多种产生。
[0260]
adcc活性是指这样的活性：通过该活性具有细胞毒活性的细胞(例如表达对抗体恒定区有特异性的受体的nk细胞)被募集到抗体附近以通过该细胞的作用等破坏与抗体结合的另一细胞。cdc活性是指这样的活性：抗体通过该活性募集补体至其附近以通过补体的作用破坏与抗体结合的细胞。可以通过向抗体的恒定区添加突变来调节adcc活性和cdc活性。
[0261]
例如，如果恒定区是人igg1，则可以通过引入至少一个以下突变(取代)来增加adcc活性：s239d、i332e、s239d/i332e、s239d/i332e/a330l、s298a、k334a、s298a/k334a、s298a/e333a/k334a等。通过引入这些突变可以增加adcc活性。这里，“s239d”表示恒定区239位的丝氨酸(s)被天冬氨酸(d)取代。这同样适用于其他替代。
[0262]
当恒定区是人igg1时，例如通过引入至少一个以下突变(取代)可以降低adcc活性：v234a/g237a、h268q/v309l/a330s/p331s。
[0263]
关于cdc活性，当恒定区是人igg1时，例如通过引入至少一个下列突变(取代)，可以增加cdc活性：s267e、h268f、s324t、s267e/h268f、s267e/s324t、h268f/s324t和s267e/h268f/s324t。
[0264]
adcc活性测量方法
[0265]
可以根据brunner k.t.等人的方法测量adcc活性(brunner，k.t.等，immunology，1968.14：181
‑
96)。例如，将骨髓瘤细胞在含有10％fcs的rpmi1640培养基中培养，将细胞数调整为0.5
×
104至1.0
×
104。然后向其中加入适量的na
251
cro4，并在37℃下反应1小时，然后
用
51
cr标记细胞。然后将清洗后得到的细胞用作靶细胞。可用的效应细胞包括通过将scid小鼠的骨髓细胞在含有10％fbs、10ng/ml小鼠gm
‑
csf和40iu/ml人il2的rpmi1640中培养6天而获得的效应细胞等。将测试抗体或作为对照的其同种型抗体加入到96孔板中以达到0.05
‑
10μg/ml的终浓度，进一步向其中添加靶细胞(1.0
×
104)和效应细胞(5
×
105)。反应在37℃下进行4小时，离心后，用γ计数器测定释放到上清液中的
51
cr。adcc活性可以由下式确定。
[0266]
adcc活性＝{([从靶细胞释放的
51
cr]
‑
[在不存在抗体的情况下自发释放的
51
cr])/([通过加入1％triton x
‑
100获得的最大
51
cr释放量]
‑
[在不存在抗体的情况下自发释放的
51
cr])}
×
100
[0267]
cdc活性测量方法
[0268]
也可以根据brunner k.t.等人的方法测量cdc活性(brunner，k.t.等人，immunology，1968.14：181
‑
96)。例如，将作为靶细胞的骨髓瘤细胞在含有10％fcs的rpmi1640培养基中培养，将细胞数调整为0.5
×
104至1.0
×
104。然后向其中加入适量的na
251
cro4，并在37℃下反应1小时，然后用
51
cr标记细胞。然后将清洗后得到的细胞用作靶细胞。将悬浮于添加了胎牛血清的rpmi1640培养基中的测试抗体或作为对照的其同种型抗体添加至96孔板中以得到0.5
‑
50μg/ml的终浓度。随后，将靶细胞和补体加入其中，然后反应1.5小时。离心分离反应液，用γ计数器测定释放到上清液中的
51
cr。cdc活性可以由下式确定。
[0269]
cdc活性＝{([从靶细胞释放
51
cr]
‑
[在不存在抗体的情况下自发释放的
51
cr])/([通过加入1％triton x
‑
100获得的最大
51
cr释放量]
‑
[在不存在抗体的情况下自发释放的
51
cr])}
×
100
[0270]
可以通过使用上述方法评估细胞毒活性的存在或不存在并选择具有该活性的抗体来获得具有细胞毒活性的抗体。
[0271]
具有细胞毒活性的抗体是有用的，因为这种抗体可以单独用于治疗疾病(例如恶性肿瘤)。
[0272]
在一个实施方案中，抗体可以是多特异性抗体，其表位存在于cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域中，并且可以特异性结合其他抗原。其他抗原可以根据目的自由选择，没有特别的限制。
[0273]
可以使用本领域已知的方法适当地制备多特异性抗体。例如，可以通过以下方法获得多特异性抗体。
[0274]
(1)制备产生抗体的杂交瘤细胞，所述抗体的表位存在于cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域中。
[0275]
(2)用抗体产生细胞(例如从用另一种抗原免疫的动物获得的b细胞)分别制备杂交瘤细胞。
[0276]
(3)通过将这两种杂交瘤细胞进行细胞融合来制备杂交瘤细胞(双特异性抗体也称为“四源杂交瘤细胞(quadroma)”)。
[0277]
(4)从步骤(3)中制备的杂交瘤细胞中筛选产生靶多特异性抗体的杂交瘤细胞。
[0278]
双特异性抗体也可以通过以下方法获得。
[0279]
(a)制备f(ab
′
)2形式的抗体，其表位存在于cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区
no:22(优选氨基酸序列seq id no:23)的区域成为用于免疫动物的外源蛋白，并有效诱导了将该区域作为表位识别的抗体。
[0289]
参考各种动物的cd98hc的已知氨基酸序列和基因序列的信息，可以通过任何技术获得人/动物嵌合体cd98hc。在一个实施方案中，用作免疫原的cd98hc优选不具有添加于其上的n
‑
聚糖。例如，该cd98hc可以通过将cd98hc用于n
‑
聚糖结合的天冬酰胺残基(例如405位的天冬酰胺残基)用另一种氨基酸残基(例如谷氨酰胺)取代而获得。在一个实施方案中，用于获得抗体的免疫原优选为表达人/动物(例如小鼠)嵌合体cd98hc或其片段的细胞。细胞可以是任何类型的细胞，没有特别的限制；然而，细胞优选来自与免疫动物相同的动物物种。这可防止免疫动物中的细胞被识别为外源细胞，因此有效地诱导将seq id no:22的氨基酸序列区域(优选seq id no:23的氨基酸序列)作为一个表位进行识别的抗体。
[0290]
通常每3
‑
10天进行多次免疫以制备免疫动物。免疫一次使用的细胞数量可以是任何数量。但是，通常施用103‑
108个细胞。在使用蛋白或其片段作为免疫原时，通常用1
‑
100μg免疫动物。从经过多次免疫的免疫动物的脾脏或淋巴结收集产生抗体的细胞，克隆产生目标抗体的细胞，从而获得单克隆抗体。可以通过将产生抗体的细胞与合适的细胞系(例如骨髓瘤细胞)融合以制备杂交瘤细胞并测量杂交瘤细胞产生的抗体的所需结合能力来进行克隆。可以使用诸如facs、elisa、ria、eia的公知方法测量结合能力。
[0291]
以这种方式获得的抗体特异性识别人cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域，从而特异性识别骨髓瘤细胞、骨髓瘤祖细胞和其他肿瘤细胞。因此，抗体可用于治疗或预防肿瘤等。对肿瘤的类型没有特别限制，肿瘤是恶性肿瘤，包括实体癌和血癌。实体癌的实例包括肺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑肿瘤、胃癌、肝癌、舌癌、甲状腺癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、骨肉瘤、软骨肉瘤和横纹肌肉瘤。血癌的实例包括白血病、涉及浆细胞肿瘤性生长的疾病(例如多发性骨髓瘤)和恶性淋巴瘤。在一个实施方案中，白血病优选为淋巴细胞性白血病。
[0292]
3.多核苷酸
[0293]
提供了编码上文第2部分中描述的抗体(以下可称为“抗体a”)的多核苷酸。术语“多核苷酸”是指由线性聚合的核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)组成的高分子化合物。多核苷酸可以是单链或双链。
[0294]
编码r8h283抗体的高变区、可变区、重链和轻链的氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列如seq id no:11
‑
20所示。下表2显示了这些序列的对应关系。
[0295]
表2
[0296][0297]
在一个实施方案中，多核苷酸包含选自seq id no:11
‑
20的至少一个碱基序列(两个或更多个序列的组合可以是任何组合)。在优选的实施方案中，多核苷酸包含选自seq id no:11
‑
13的至少一个碱基序列(优选2个或更多个，更优选全部)和/或选自seq id no:16
‑
18的至少一个碱基序列(优选2个或更多个，更优选全部)。在优选的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:11
‑
13的碱基序列和seq id no:16
‑
18的碱基序列。在优选的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:14的碱基序列和/或seq id no:19的碱基序列。在另一个优选的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:15的碱基序列和/或seq id no:20的碱基序列。
[0298]
只要多核苷酸编码抗体a，多核苷酸的碱基序列不一定与seq id no:11
‑
20完全匹配。例如，多核苷酸的碱基序列与seq id no:11
‑
20的同一性可以为至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少98％、优选至少99％。可以使用市售的分析工具或通过电信线路(互联网)可获得的工具计算同一性。具体而言，例如，可以通过使用blastp程序在advanced blast 2.1上进行搜索，并将各种参数设置为默认值来计算核苷酸序列的同源性的值(％)。取决于载体或表达多核苷酸的细胞的类型，可优化多核苷酸的密码子使用频率。
[0299]
对多核苷酸的状态没有特别限制；例如，多核苷酸可以是分离的多核苷酸或掺入载体中的多核苷酸。对载体的类型和用途没有特别的限制。例如，载体可以是质粒载体或病毒载体(例如腺病毒或逆转录病毒)。载体可以是例如用于克隆或用于表达的载体。用于表达的载体包括用于原核细胞(如大肠杆菌和放线菌)的载体，以及用于真核细胞(如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的载体。多核苷酸可以具有任何修饰；例如，多核苷酸可以合适地在5
′
末端具有编码信号肽的碱基序列。
[0300]
4.宿主细胞
[0301]
提供了包含上述编码抗体a的多核苷酸的宿主细胞。对宿主细胞含有的多核苷酸的形式没有特别限制。例如，宿主细胞可以含有载体形式的多核苷酸或可以含有整合至宿主生物体的细胞内基因组dna中的多核苷酸。
[0302]
宿主细胞可以是任何类型且没有特别限制。例如，宿主细胞可以是真核细胞，如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，以及原核细胞，如大肠杆菌和放线菌。在一个实施方案中，宿主细胞优选为真核细胞；例如，宿主细胞优选是t细胞或nk细胞。
[0303]
例如可以通过将多核苷酸(例如以载体的形式)整合到宿主细胞中来获得上述包含编码抗体的多核苷酸的宿主细胞。
[0304]
5.嵌合抗原受体
[0305]
本发明提供了识别含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的表位的嵌合抗原受体(car)、其表位存在于人cd98hc上受n
‑
聚糖的存在影响的区域内的嵌合抗原受体、通过除去与人cd98hc结合的糖链而增加对人cd98hc的亲和力的抗人cd98hc嵌合抗原受体、对cd98hc变体(在该cd98hc变体中人cd98hc的395
‑
397位的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代)的亲和力与对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当的抗人cd98hc嵌合抗原受体、对cd98hc变体(在该cd98hc变体中人cd98hc的400
‑
401位的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代)的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当的抗人cd98hc嵌合抗原受体等。嵌合抗原受体典型地是t细胞受体(tcr)样人工蛋白，被称为构建的蛋白，其中在t细胞的细胞膜上表达的抗原识别位点(对应于细胞外结构域)被所需的抗原识别位点替代，使得可以更有效地产生诸如细胞毒活性的t细胞功能。嵌合抗原受体的由与重链可变区串联在一起的轻链可变区组成单链抗体(scfv)在n端侧，其t细胞受体(tcr)ζ链在c端侧。表达嵌合抗原受体的t细胞等识别在其scfv结构域中的抗原，然后通过ζ链细胞内转移识别信号。嵌合抗原受体优选在scfv和ζ链之间含有共刺激分子(例如cd28和/或4
‑
1bb)以增加t细胞的活化。
[0306]
以下特征全部通过对抗体a的描述来解释：“含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n
‑
连接糖基化而暴露的表位”、“人cd98hc上受n
‑
多糖的存在影响的区域”、“通过除去与人cd98hc结合的糖链而增加对人cd98hc的亲和力”、“对cd98hc变体(在该cd98hc变体中人cd98hc的395
‑
397位的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代)的亲和力与对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当”以及“对cd98hc变体(在该cd98hc变体中人cd98hc的400
‑
401位的氨基酸残基被小鼠来源的cd98hc的氨基酸残基取代)的亲和力与其对小鼠来源的cd98hc的亲和力相当”。因此，在一个实施方案中，嵌合抗原受体所针对的表位优选存在于cd98hc的由seq id no:22表示的氨基酸序列的区域中。在另一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体所针对的表位优选存在于由seq id no:23表示的氨基酸序列的区域中。在一个实施方案中，嵌合抗原受体所针对的表位优选存在于人cd98hc的365
‑
376位处的区域和395
‑
409位处的区域中。在一个实施方案中，嵌合抗原受体所针对的表位优选含有人cd98hc的374、375、395、396、397、400和401位的氨基酸残基。
[0307]
在另一个实施方案中，嵌合抗原受体所针对的表位优选与r8h283抗体所针对的表位相同。因此，嵌合抗原受体的scfv优选含有上述抗体的重链可变区和轻链可变区。更具体而言，嵌合抗原受体的scfv优选具有以下结构：
[0308]
重链可变区，其包含：
[0309]
包含含有氨基酸序列seq id no:1的氨基酸序列的重链cdr1，
[0310]
包含含有氨基酸序列seq id no:2的氨基酸序列的重链cdr2，和/或
[0311]
包含含有氨基酸序列seq id no:3的氨基酸序列的重链cdr3，和/或
[0312]
轻链可变区，其包含：
[0313]
包含含有氨基酸序列seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr1，
[0314]
包含含有氨基酸序列seq id no:7的氨基酸序列的轻链cdr2，和/或
[0315]
包含含有氨基酸序列seq id no:8的氨基酸序列的轻链cdr3。
[0316]
在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体的scfv包含含有氨基酸序列seq id no:
4的重链可变区和/或含有氨基酸序列seq id no:9的轻链可变区。
[0317]
嵌合抗原受体优选具有的结构为以下片段从n末端依次排列：上述由抗体的轻链可变区和重链可变区串联结合组成的scfv结构域；间隔序列；跨膜结构域；共刺激因子；和tcr的胞内结构域。
[0318]
scfv结构域可以包含在重链可变区和轻链可变区之间的例如约10
‑
25个氨基酸残基的间隔序列。这种间隔序列可以与在scfv结构域和跨膜结构域之间提供的间隔序列相同或不同。
[0319]
在scfv结构域和跨膜结构域之间提供的间隔序列的长度和构成该间隔序列的氨基酸残基的类型不受限制，只要嵌合抗原受体的功能不受阻碍即可。例如，间隔序列可以设计为含有约10
‑
25个氨基酸残基。
[0320]
对跨膜结构域的种类没有限制，只要嵌合抗原受体的功能不受阻碍即可。例如，可以使用在t细胞或其他细胞中表达的cd28、4
‑
1bb等。只要嵌合抗原受体的功能不受阻碍，就可以适当地将突变引入这些跨膜结构域中。
[0321]
共同刺激因子不受特别限制，只要它是包含在t细胞等中的共刺激因子即可。例如，可以使用从ox40、4
‑
1bb和cd28中适当选择的至少一种。只要嵌合抗原受体的功能没有受到阻碍，就可以将突变适当地引入这些共刺激分子中。
[0322]
tcr的胞内结构域可以是例如源于cd3的胞内结构域，其也可以被称为tcrζ链。只要嵌合抗原受体的功能不受阻碍，就可以将突变适当地导入cd3。在cd3中引入突变时，优选引入突变使得cd3含有itam(免疫受体酪氨酸活化基序)。
[0323]
可以参照例如非专利文献2
‑
4中公开的方法来制备嵌合抗原受体。
[0324]
提供了编码嵌合抗原受体的多核苷酸。多核苷酸的碱基序列可以是任何序列，没有特别限制，只要该序列编码嵌合抗原受体即可。对多核苷酸的状态没有特别限制，例如，多核苷酸可以是分离的多核苷酸或掺入载体中的多核苷酸。对编码抗体的多核苷酸的描述也适用于编码嵌合抗原受体的多核苷酸。
[0325]
提供了包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的宿主细胞。对包含编码抗体的多核苷酸的宿主细胞的描述也适用于包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的宿主细胞。宿主细胞可以是任何类型的；然而，具有细胞毒活性的细胞是优选的。具有细胞毒活性的细胞的实例包括t细胞、nk细胞和k细胞，优选杀伤t细胞(也称为“细胞毒性t细胞”或“ctl”)。
[0326]
宿主细胞可以处于表达编码嵌合抗原受体的多核苷酸的状态，或处于不表达多核苷酸的状态。当编码嵌合抗原受体的多核苷酸在宿主细胞中正在被表达时，构成嵌合抗原受体的scfv结构域优选暴露于细胞外，并且优选地tcr的跨膜结构域、共刺激分子和胞内结构域存在于细胞膜中或细胞内。
[0327]
当scfv结构域识别其表位时，scfv结构域通过跨膜结构域和共刺激因子胞内激活用于唤起细胞毒活性的信号。与此相关的是，细胞嵌入并攻击表达该表位的其他细胞或组织或对该细胞或组织发挥其细胞毒活性。
[0328]
当具有这种功能的细胞是ctl时，该细胞被称为“嵌合抗原受体t细胞”(“car
‑
t细胞”)。当有潜力表现出这种细胞毒活性的细胞(如nk细胞)的scfv结构域与其表位结合时，如嵌合抗原受体t细胞一样，这些细胞也表现出细胞毒活性。
[0329]
因此，包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的宿主细胞(特别是具有细胞毒活性的
宿主细胞)可用作药物组合物的活性成分。可以参考例如非专利文献2
‑
4中公开的方法来产生包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的宿主细胞(例如car
‑
t细胞)。
[0330]
这些car
‑
t细胞识别含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n连接糖基化而暴露的表位，从而特异性识别骨髓瘤细胞，骨髓瘤祖细胞和其他肿瘤细胞。因此，这些car
‑
t细胞可用于治疗或预防肿瘤等。对肿瘤的类型没有特别限制，包括实体癌和血癌。实体癌的实例包括肺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑肿瘤、胃癌、肝癌、舌癌、甲状腺癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、骨肉瘤、软骨肉瘤和横纹肌肉瘤。血癌的实例包括白血病、涉及浆细胞肿瘤性生长的疾病(例如多发性骨髓瘤)和恶性淋巴瘤。在一个实施方案中，白血病优选为淋巴细胞性白血病。
[0331]
6.药物组合物和治疗方法
[0332]
本发明提供包含抗体a、car
‑
t细胞、car
‑
nk细胞等的药物组合物以及使用抗体a、crt
‑
t细胞、car
‑
nk细胞等治疗或预防疾病的方法。
[0333]
可以考虑目标疾病的类型、预期的治疗效果、给药方法、治疗时间、患者年龄、患者体重等适当决定药物组合物中的抗体或细胞的含量。例如，将整个药物组合物按100重量份计，抗体在药物组合物中的含量可以为约0.001
‑
10重量份。药物组合物中细胞的含量可以是例如约1
‑
104个细胞/ml。
[0334]
对药物组合物的给药形式没有特别限制，只要达到所需的效果即可。可通过口服给药或肠胃外给药(例如静脉内注射、肌内注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药和局部给药)的给药途径将组合物施用至包括人在内的哺乳动物。因为活性成分是抗体或细胞，优选的给药形式是肠胃外给药，更优选静脉注射。用于口服给药或非口服给药的组合物的剂型和生产方法对本领域技术人员来说是公知的，并且任何剂型的药物组合物都可以按照常规方法通过将抗体或细胞与药学上可接受的载体等混合一起使用来制备。
[0335]
用于肠胃外给药的组合物的剂型包括可注射药物(例如滴注药物、静脉内注射药物、肌内注射药物、皮下注射药物和皮内注射药物)、外用药物(例如软膏、泥敷剂和洗剂)、栓剂、吸入剂、滴眼剂、眼用软膏、滴鼻剂、滴耳剂和脂质体药物。例如，可以通过将抗体或细胞溶解在注射用蒸馏水中来制备注射药物；可以任选地向其中加入增溶剂、缓冲剂、ph调节剂、张力剂、舒缓剂、防腐剂、稳定剂等。药物组合物可以是冻干制剂的形式，会在使用时对其进行配制。
[0336]
该药物组合物可以进一步包含有效治疗或预防疾病的其他药剂。药物组合物还可以任选含有诸如灭菌剂、消炎剂、细胞兴奋剂、维生素和氨基酸的组分。
[0337]
对于用于制备药物组合物药物的载体，可以使用本领域通常使用的赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂和调味剂；并且也可以任选使用稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、ph调节剂、杀菌剂、抗氧化剂、填充剂、水分保持剂、表面活性剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、舒缓剂等。
[0338]
对使用药物组合物治疗或预防的疾病类型没有特别限制，只要可以实现治疗或预防即可。具体目标疾病的实例包括肿瘤。对肿瘤的类型没有特别限制，包括实体癌和血癌。实体癌的实例包括肺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑肿瘤、胃癌、肝癌、舌癌、甲状腺癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、骨肉瘤、软骨肉瘤和横纹肌肉瘤。血癌的实例包括白血病、涉及浆细胞肿瘤性生长的疾病(例如多发性骨髓瘤)和恶性淋巴瘤。在一个实施方案中，白血病优选
为淋巴细胞性白血病。在一个实施方案中，优选的疾病是引起浆细胞肿瘤性生长的疾病。“导致浆细胞肿瘤性生长的疾病”是以浆细胞异常的肿瘤性生长和浆细胞分泌的异常蛋白增加为特征的疾病。这些疾病的实例包括多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、浆细胞瘤、h链疾病和系统性al淀粉样变性。在一个实施方案中，优选的目标疾病是多发性骨髓瘤。
[0339]
药物组合物的给药对象(受试个体)例如是具有上述疾病的动物或有可能患上该疾病的动物。例如，可以通过后面描述的诊断方法来确定“患上这种疾病的可能性”。该动物例如是哺乳动物，优选人。
[0340]
考虑各种因素，例如给药途径、疾病类型、症状程度、患者年龄、性别、体重、疾病严重程度、药理学发现(如药代动力学和毒理学特征)、使用或不使用药物递送系统以及该组合物是否作为联用药物的一部分或与其他药剂联合施用，临床医生可以确定药物组合物的剂量。例如，当活性成分是抗体时，药物组合物的剂量可以是每天约1μg/kg(体重)至10g/kg(体重)。当活性成分是细胞(vi)时，剂量可以是约104个细胞/kg(体重)至109个细胞/kg(体重)。通过考虑与确定剂量时所需考虑的因素相同的因素，也可以确定药物组合物的给药方案。例如，所述组合物可以按照上述的每日剂量每天施用一次至每月施用一次。
[0341]
如上所述，抗体、car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞可用于生产药物组合物。
[0342]
7.筛选方法
[0343]
提供了用于治疗或预防肿瘤的药物组合物的活性成分的筛选方法。该方法包括从化合物文库(候选物质组)选择与cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域特异性结合的物质。肿瘤的类型如在上面针对药物组合物所描述的。
[0344]
对化合物文库没有特别的限制，可以使用现有的文库。化合物文库优选为抗体文库，优选用作使用抗体产生细胞(例如从用所期望的抗原免疫的动物获得的b细胞)制备的文库杂交瘤细胞。对期望的抗原没有特别限制，例如优选为cd98hc或其片段(含有cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域的片段)。
[0345]
用于选择特异性结合cd98hc上受到n
‑
聚糖存在影响的区域的物质的方法可以是任何方法，并且没有特别限制。例如，制备两种类型的细胞，即表达cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域的细胞和不表达该区域的细胞。除了存在或不存在该区域的表达之外，这两种类型的细胞是相同的。随后，将标记的测试物质(例如荧光标记)添加到两个细胞中，并且通过流式细胞术测量细胞与测试物质之间是否存在结合。仅与表达该区域的细胞结合的物质对该区域具有特异性亲和力，没有这种表现的抗体对该区域没有特异性亲和力或具有低特异性亲和力。可以基于在流式细胞术中检测到的荧光信号的强度来测量抗体对该区域的亲和力的程度。
[0346]
除了使用流式细胞术的方法之外，免疫测定也可以用于测量亲和力。在这种情况下，用纯化的所述区域涂布微量滴定板，并将测试物质加入到每个孔中，之后进行反应。随后，加入可识别所述物质并用酶标记的抗体、荧光物质、发光物质、放射性物质，生物素等以使抗体与所述物质反应。之后，可以用标记抗体作为指示剂测量测试物质对该区域的亲和力。
[0347]
对测试物质没有特别限制，只要其可以通过这些方法测量对cd98hc上受到n
‑
聚糖的存在影响的区域的亲和力即可，但测试物质优选为抗体。
[0348]
筛选方法可以包括选择具有细胞毒活性的物质的步骤。具有细胞毒活性的物质的
选择是可选的并且没有特别限制。例如，当候选物质是抗体时，可以使用上述adcc活性的测量方法和/或cdc活性的测量方法来进行选择。
[0349]
8.诊断方法
[0350]
提供了一种诊断个体是否患有肿瘤的方法。该方法包括使上述抗体与从个体收集的样品接触。肿瘤的类型如上面针对药物组合物所描述的。
[0351]
该抗体特异性结合含有人cd98hc的n
‑
糖基化位点并通过抑制n连接糖基化而暴露的表位，从而特异性识别骨髓瘤祖细胞、骨髓瘤浆细胞和其他肿瘤细胞。因此，可以通过使抗体作用于含有肿瘤性浆细胞的样品并检测与表达对应于该表位的区域的细胞结合的抗体来鉴定样品中的肿瘤性浆细胞。
[0352]
样品优选为从癌症患者收集的含有肿瘤性浆细胞的生物样品(例如骨髓、血液和肿瘤块)，更优选体液，更优选血液。为了容易地进行检测，优选对抗体进行标记(例如荧光染料或放射性同位素)。可仅使用该抗体或使用该抗体与另一种抗体的组合(例如抗人cd38单克隆抗体或抗cd48单克隆抗体)进行骨髓瘤浆细胞的鉴定。例如，通过将从患有骨髓瘤的患者的骨髓采集的样品与这些用荧光标记的抗体共同染色，并用流式细胞术分离样品中的细胞，可以容易地鉴定骨髓瘤细胞群。
[0353]
当以这种方式在样品中检测到骨髓瘤祖细胞和/或骨髓瘤浆细胞时，测试个体被诊断为患有癌症(或极有可能患有癌症)。
[0354]
9.试剂盒
[0355]
本发明提供了包含用于不同目的的抗体的试剂盒。例如，试剂盒可用于治疗或预防肿瘤或诊断癌症。肿瘤的类型如上面针对药物组合物所描述的。
[0356]
取决于预期的用途，试剂盒可以仅包含抗体，但也可以包含其他组分(例如，其他抗体、缓冲溶液和荧光染料)、仪器和手册。
[0357]
实施例
[0358]
以下参照实施例描述本发明。然而，本说明书中公开的发明不限于这些实施例。
[0359]
1.流式细胞术和分选
[0360]
在以下测试中，根据以下方法进行用于细胞选择的流式细胞术。将从获得知情同意的骨髓瘤患者的髂骨收集的骨髓单核细胞悬浮于ack溶液(150mm nh4cl，10mm khco3)中，并在4℃静置3分钟，随后去除血红细胞。用含有2％胎牛血清的pbs(磷酸盐缓冲盐水)洗涤所得物，在含有10％人ab血清的pbs中于4℃封闭20分钟，以防止抗体与其进行非特异性结合。之后，向其中加入用荧光染料标记的各抗体(参见下文)，并在4℃下染色30分钟，随后用pbs洗涤。将细胞悬浮在含有1μg/ml碘化丙啶(pi)的pbs中并进行流式细胞术分析。用facs aria细胞分选仪(becton dickinson immunocytometry system)进行分析和细胞分选。为了对细胞进行染色，适当选择和使用以下单克隆抗体。
[0361]
apc缀合的抗cd34抗体(bd pharmingen公司)、cy7
‑
pe缀合的抗cd34抗体(bd pharmingen公司)、cy7
‑
apc缀合的抗cd19抗体(biolegend公司)、fitc缀合的抗cd38抗体(ebioscience公司)、apc缀合的抗cd138抗体(biolegend)、cy7
‑
pe缀合的抗cd3抗体(biolegend)、fitc缀合的抗cd14抗体(bd pharmingen)、cy7
‑
pe缀合的人cd45抗体(biolegend)。
[0362]
2.与骨髓瘤细胞系结合但不与健康个体外周血结合的单克隆抗体文库的制备
[0363]
在多发性骨髓瘤的抗体治疗中，优选使用与骨髓瘤细胞结合但不与正常血细胞结合的抗体。因此，通过以下方法鉴定用于治疗多发性骨髓瘤的抗体。
[0364]
首先，根据以下技术制备10,000个或更多个与各种骨髓瘤细胞系结合的单克隆抗体克隆。用6种类型的人骨髓瘤细胞系(mm1s、rpmi8226、ina6、u266、opm2和kms121bm)作为抗原对balb/c小鼠的足跖进行接种免疫，每周两次，持续2
‑
3周。此后，取出膝下的淋巴结，制备细胞悬液，然后与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系进行细胞融合。通过使用聚乙二醇的方法(peg法)进行细胞融合。将细胞在次黄嘌呤
‑
氨基喋呤
‑
胸苷培养基(hat培养基)中培养以选择杂交瘤细胞。最后，用杂交瘤细胞的培养上清液使杂交瘤细胞与用于免疫的骨髓瘤细胞系融合，并通过流式细胞术选择含有与来自健康个体的外周血的单核细胞不结合的抗体的上清液。得到的骨髓瘤细胞特异性抗体候选物约有200个克隆，使这些克隆生长并将其冷冻保存。
[0365]
3.特异性结合人多发性骨髓瘤患者骨髓中的骨髓瘤细胞的抗体r8h283的鉴定
[0366]
将来自骨髓瘤患者的骨髓细胞用上述第2部分中获得的约200个克隆的候选抗体染色，并通过facs进行分析。将每种抗体添加到源自多发性骨髓瘤患者的骨髓细胞中，并在4℃孵育30分钟，然后洗涤。向其中加入作为二抗的pe缀合的抗小鼠igg
‑
pe，并在4℃下进一步孵育30分钟。洗涤后，最终用apc缀合的抗cd138抗体(biolegend)、fitc缀合的抗cd38抗体(biolegend)或cy7
‑
pe缀合的抗cd45抗体(biolegend)对所得物进行染色。还制备了含有小鼠igg的样品作为同种型对照代替候选抗体。通过流式细胞术对这些抗体进行分析，并选择与cd45
‑
cd38 cd138 骨髓瘤浆细胞和cd45
‑
cd38 cd138
‑
骨髓瘤祖细胞结合但不结合cd45 血细胞的抗体。结果，r8h283抗体被鉴定为满足这些条件的抗体(图1和2)。在每个直方图中，y轴表示细胞数量，x轴表示r8h283抗体的结合强度。在许多情况下进行了检查，并且在许多情况下证实了r8h283抗体与cd45
‑
cd38 cd138 骨髓瘤浆细胞和cd45
‑
cd38 cd138
‑
骨髓瘤祖细胞的结合。然而，很明显r8h283抗体几乎不结合cd45 血细胞。
[0367]
4.鉴定r8h283抗体结合的抗原蛋白
[0368]
通过表达克隆法鉴定r8h283抗体结合的抗原蛋白。首先，使用用于cdna合成的上标选择系统(superscript choice system,invitrogen)从已知与r8h283抗体结合的rpmi8226细胞制备cdna文库，并使用bstxi接头(invitrogen)将其导入pmxs逆转录病毒载体(由东京大学医学科学院的toshio kitamura教授提供)。用逆转录病毒感染baf3细胞，该逆转录病毒通过将由此制备的cdna文库引入plat
‑
e细胞(由toshio kitamura教授提供)而获得，由此获得表达源自rpmi8226的cdna文库的baf3细胞。随后，用r8h283抗体染色这些细胞，重复用facs分选浓缩阳性细胞的操作(图3)。第三次分选后，大部分细胞是与r8h283结合的细胞。因此，通过pcr扩增细胞所具有的逆转录病毒的插入片段，然后通过测序鉴定。结果显示cd98hc是抗原蛋白。
[0369]
5.确认与r8h283抗体结合的抗原是cd98hc蛋白
[0370]
根据以下方法使用crispa
‑
cas9系统制备cd98hc缺陷型u266骨髓瘤细胞系，并确认r8h283抗体结合的抗原蛋白是cd98hc。首先，通过将双链dna序列(cd98hc
‑
特异性靶序列)插入到px330载体(adgene)中来制备载体。使用nucleofectorii(lonza)将获得的载体与作为用于选择药剂的载体的线性潮霉素抗性基因表达载体(clontech)一起导入u266细胞。之后，用mem
‑
108抗体(抗cd98抗体，biolegend)对生长在含有潮霉素的培养基中的克隆
中的cd98hc表达进行染色并通过facs进行分析，从而鉴定cd98hc缺陷型细胞(u266cd98hcko)。其次，将cd98hc缺陷型细胞用r8h283抗体染色并用facs进行分析。结果，在r8h283抗体与野生型u266细胞结合的同时，r8h283抗体与cd98hc缺陷型细胞系的结合完全丧失(图4)。这表明r8h283仅与cd98hc蛋白结合，因此确认cd98hc蛋白是r8h283抗体的抗原。
[0371]
6.对r8h283抗体在健康个体的外周血和骨髓细胞级分中的结合模式的测量
[0372]
使用市售的抗cd98抗体(mem
‑
108，biolegend)和r8h283抗体，测量这些抗体与健康个体外周血中和骨髓细胞的各种细胞级分的结合。在使用hes40从源自健康个体的外周血细胞中除去红细胞后，向其中加入fc受体阻断剂(miltenyi)以阻断显示非特异性结合的抗体。此后，向其中加入r8h283抗体、mem
‑
108抗体或小鼠igg2同种型对照，并在4℃孵育30分钟。洗涤后，向其中加入作为二抗的pe缀合的抗小鼠igg
‑
pe，并在4℃下进一步孵育30分钟。洗涤后，最终用cy7
‑
apc缀合的抗cd19抗体(biolegend)、fitc缀合的抗cd14抗体(biolegend)或cy7
‑
pe缀合的抗cd3抗体(biolegend)对所得物进行染色。通过流式细胞术对这些进行分析以测量每个级分中r8h283抗体或mem
‑
108抗体的结合(图5a)。另外，将1μl的外周血添加到100μl的edta
‑
pbs中，并以相同的方式用r8h283抗体或mem
‑
108抗体染色。最后，将所得物用太平洋蓝缀合的抗cd235抗体(bd pharmingen)染色以检查cd235阳性红细胞中每种抗体存在与否(图5a)。
[0373]
将来自健康个体的骨髓细胞也与外周血细胞一样用r8h283抗体或mem
‑
108抗体染色，最后用apc缀合的抗cd34抗体(bd pharmingen)、cy7
‑
apc缀合的抗cd19抗体(bd pharmingen)、cy7
‑
pe缀合的抗cd38抗体(ebioscience)、alexa647缀合的抗cd3抗体(bd pharmingen)或fitc缀合的抗cd14抗体(ebioscience)染色。通过流式细胞术对这些进行分析，并测量每个级分中r8h283抗体或mem
‑
108抗体的结合(图5b)。结果表明，尽管mem
‑
108抗体结合除红细胞外的所有血细胞，但r8h283不结合除了一小部分浆细胞和b细胞外的正常血细胞。
[0374]
另外，将来自健康个体的外周血的b细胞和t细胞用不同浓度的r8h283或mem
‑
108抗体染色，并通过facs测量每种抗体的结合。尽管mem
‑
108抗体表现出浓度依赖性的荧光强度(荧光强度表明抗体的结合量)的增加，但即使当抗体浓度增加至50μg/ml时，r8h283抗体也不显示与来自健康个体的淋巴细胞的结合(图6)。这表明cd98hc蛋白存在于淋巴细胞中，但是r8h283抗体不结合正常淋巴细胞。
[0375]
已知cd98蛋白在血液系统以外的器官中表达。对r8h283抗体或mem
‑
108抗体与huvec细胞的结合进行分析，huvec细胞为正常血管内皮细胞，并且是血液系统以外的正常细胞中可通过facs进行分析的细胞。结果表明，尽管mem
‑
108结合huvec，但r8h283几乎不结合huvec(图7)。
[0376]
以与上述相同的方式，分析了r8h283抗体与骨髓瘤以外的癌细胞系的结合。结果显示，如图8所示，r8h283抗体结合以下细胞中的任何一种：jurkat细胞和molt4细胞，它们是t细胞白血病/淋巴瘤细胞系；raji细胞和daudi细胞，它们是b细胞白血病/淋巴瘤细胞系；a549细胞，其为肺癌细胞系；dld
‑
1细胞，其为肠癌细胞系；tyk
‑
nu
‑
cpr细胞，其为卵巢癌细胞系；mcf
‑
7细胞，其为乳腺癌细胞系；和t98g细胞，其为脑肿瘤细胞系。这些结果表明r8h283抗体不与正常细胞结合，但特异性结合广泛的癌细胞。在癌细胞中，cd98hc上发生特
定的结构改变，并且r8h283抗体似乎特异性识别这种改变的结构。
[0377]
7.r8h283抗体对健康个体外周血细胞的结合能力与其他抗体的结合能力的比较
[0378]
将r8h283抗体对健康个体的外周血的结合与被报道用于治疗多发性骨髓瘤的其他抗体对这些细胞的结合进行比较。除此之外，使用抗cs1抗体(biolegend)、抗cd38抗体(biolegend)和抗bst2抗体(biolegend)作为一级抗体，以与上述相同的方式进行染色，然后进行facs分析(图9)。结果证实，r8h283抗体完全不结合正常t细胞，但抗cs1抗体结合一些正常t细胞。证实与r8h283抗体相比抗cd38抗体显著结合所有正常外周血细胞。证实与r8h283抗体相比抗bst2抗体显著结合正常t细胞和单核细胞。这些结果表明r8h283对包括骨髓瘤细胞在内的癌细胞具有更高的特异性。
[0379]
8.r8h283结合与cd98hc蛋白糖基化的关联分析
[0380]
通过facs分析r8h283抗体或mem
‑
108抗体与骨髓瘤细胞系rpmi8226或髓细胞性白血病细胞系u937的结合。染色方法与上述第6部分中使用外周血的试验相同。结果证实尽管cd98hc蛋白是它们两者的抗原，但是mem
‑
108抗体结合几乎所有细胞系，而r8h283抗体结合一些细胞系而不结合其他细胞系。例如，两种抗体都与rpmi8226(骨髓瘤细胞系)结合良好；然而，mem
‑
108抗体与u937(髓细胞性白血病细胞系)结合良好，但r8h283抗体几乎完全不结合u937(图10a)。用不同浓度的r8h283或mem
‑
108抗体对rpmi8226细胞和u937细胞进行染色，并通过facs测量每种抗体的结合。结果显示，尽管rpmi8226对于mem
‑
108抗体和r8h283抗体均表现出浓度依赖性的荧光强度增加，但即使当r8h283抗体的抗体浓度增加至50μg/ml时，u937细胞也几乎不显示与r8h283的结合(图10b)。
[0381]
这可能是由于cd98hc的翻译后修饰的差异，cd98hc在骨髓瘤细胞系和白血病细胞系中表达。cd98hc是一种蛋白，其经受相当高程度的n
‑
连接糖基化，且糖基化程度可能不同。因此，将n
‑
聚糖合成抑制剂衣霉素(2.5mg/ml)加入未与r8h283抗体结合的u937细胞或thp1细胞的培养液中24小时，并通过facs对r8h283抗体或mem
‑
108抗体进行分析。通过以下方法进行各抗体的染色。将1
×
105个细胞悬浮于50μl pbs 2％胎牛血清中，并向其中加入1μl fc封闭剂(miltenyi biotec，#130
‑
059
‑
901)。随后，加入r8h283或mem
‑
108以使终浓度为50μg/ml和2.5μg/ml，并将混合物在冰上放置30分钟。单独地，加入各自的同种型对照抗体从而获得与以相同方式制备的其他细胞悬液相同的浓度。用pbs 2％胎牛血清洗涤细胞两次，并再次悬浮于50μl在pbs 2％牛胎血清中稀释至1μg/ml的藻红蛋白(pe)缀合的山羊抗小鼠igg抗体中。将细胞进一步静置30分钟。之后，将细胞用pbs 2％胎牛血清洗涤两次，再次悬浮于含有1μg/ml碘化丙锭(pi)的pbs 2％胎牛血清中，随后通过facs canto ii(beckton dickinson)进行分析。在此阶段，从分析中排除pi阳性死细胞，并将与活细胞结合的抗体的量定量为pe的荧光强度的平均值(平均荧光强度(mfi))。表示r8h283抗体的结合量的mfi值(通过除以同种型对照(小鼠igg2a同种型对照，biolegend，#401502)的值得到的校正值)如下：在衣霉素处理前，u937细胞为1.5，thp
‑
1细胞为2.6；衣霉素处理后，u937细胞为3.0，thp
‑
1细胞为17.1；这表明衣霉素处理后r8h283抗体的结合增加(u937：2.0倍，thp
‑
1：6.6倍，就mfi而言)。然而，表示mem
‑
108抗体的结合量的mfi值(通过除以同种型对照(小鼠igg1同种型对照，biolegend，#400102)获得的校正值)如下：处理前，u937细胞为11.8，thp
‑
1细胞为29.4；处理后，u937细胞为8.3，thp
‑
1细胞为29.1；这表明r8h283的结合量没有增加(图11a)。这清楚地表明n连接糖基化的差异决定了r8h283抗体的结合量。
[0382]
由于衣霉素是一种n
‑
聚糖合成抑制剂，并且还会引起高内质网应激，因此衣霉素可用作引起内质网应激的药物。因为在骨髓瘤细胞中总是发生大量的蛋白合成，所以内质网应激始终位于骨髓瘤细胞上。本发明人推测cd98hc的糖基化可能在内质网应激下发生改变，由此使得r8h283抗体能够与cd98hc结合。因此，用毒胡萝卜素(1nm，内质网应激诱导剂)处理u937细胞或thp1细胞，毒胡萝卜素与衣霉素不同，其不直接抑制糖基化，并通过facs分析r8h283抗体或mem
‑
108抗体的结合。结果表明由于毒胡萝卜素处理r8h283抗体的结合出现(图11b)。此外，通过蛋白印迹来检测用毒胡萝卜素处理的细胞和未处理的细胞中的cd98hc的分子量，并且变得明显的是具有较低分子量的cd98hc或具有不完全糖基化的cd98hc在由毒胡萝卜素引起的内质网应激下得到表达(图12)。
[0383]
硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，也会在骨髓瘤细胞上产生高的内质网应激。接下来，用硼替佐米(10nm)处理mm1s，mm1s为r8h283以相对较弱的方式结合的骨髓瘤细胞系，并在r8h283结合的方面与未处理的细胞进行比较。结果，硼替佐米处理明显增加了r8h283的结合(图13a)。对源自骨髓瘤患者的骨髓细胞进行相同的实验。尽管在骨髓瘤细胞中mem
‑
108的结合量没有变化，但r8h283的结合量增加；然而，在未发生由硼替佐米引起的内质网应激增加的t淋巴细胞中，没有发生这种变化(图13b)。这些结果表明，由通常存在于骨髓瘤细胞中的高内质网应激引起的糖基化的改变可能与r8h283抗体结合的表位的出现相关。
[0384]
9.表位的鉴定
[0385]
为了鉴定r8h283识别的表位，使用如下所述的重叠pcr制备各种人/小鼠嵌合体cd98hc蛋白表达载体。所用引物的序列如下。
[0386]
ecorihcd98f，
[0387]
ccggaattcccaccatgagccaggacaccgaggtggatatga(seq id no:25)
[0388]
bamhihcd98r，
[0389]
aaaggatcctcatcaggccgcgtaggggaagcggagcagcagcc(seq id no:26)
[0390]
ecorimcd98f，
[0391]
ccggaattcccaccatgagccaggacaccgaagtggacatgaaa(seq id no:27)
[0392]
bamhimcd98r，cgcggatcctcatcaggccacaaaggggaactgta(seq id no:28)
[0393]
ccd98
‑
203f，tcattctggaccttactcccaactacc(seq id no:29)
[0394]
ccd98
‑
203r，ggtagttgggagtaaggtccagaatga(seq id no:30)
[0395]
ccd98
‑
365f，ttccggcggctgagtgac(seq id no:31)
[0396]
ccd98
‑
365r，gtcactcagccgccggaa(seq id no:32)
[0397]
ccd98
‑
427f，agctacggggatgagattggcct(seq id no:33)
[0398]
ccd98
‑
427r，aggccaatctcatccccgtagct(seq id no:34)
[0399]
ccd98
‑
370f，ttggcctggatgcagctgcccttcctggacagc(seq id no:35)
[0400]
ccd98
‑
370r，gctgtccaggaagggcagctgcatccaggccaa(seq id no:36)
[0401]
ccd98
‑
376f，tgcccttcctggacagcc(seq id no:37)
[0402]
ccd98
‑
376r，ggctgtccaggaagggca(seq id no:38)
[0403]
ccd98
‑
402f，ccagcttccctgacatcccaggggctgtaa(seq id no:39)
[0404]
ccd98
‑
402r，ttacagcccctgggatgtcagggaagctgg(seq id no:40)
[0405]
ccd98
‑
409f，ctgtaagtgccaacatgactgtgaag(seq id no:41)ccd98
‑
409r，
cttcacagtcatgttggcacttacag(seq id no:42)。
[0406]
使用插入了人或小鼠cd98hc cdna的mscv
‑
ires
‑
gfp载体作为模板进行pcr。使用prime star(宝生物工程株式会社)、kodfx(东洋纺生物科技有限公司)和accuprime taq(invitrogen)进行pcr。如下所述制备嵌合cdna(图14)。首先，使用cdna1作为模板，用f引物1和r引物1进行25个循环的pcr，并使用cdna2作为模板使用f引物2和r引物2单独进行25个循环的pcr，其中使用上面列出的任何pcr酶。将pcr产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后用qiaquick凝胶提取试剂盒纯化。在2.5μl的各pcr产物中加入5μl水，在下述条件下进行3个循环的pcr：94℃持续15秒、55℃持续30秒、68℃持续2分钟，然后在99℃孵育5分钟。然后用1μl的每种所得物作为模板，用f引物1和r引物2进行重叠pcr。通过在琼脂糖凝胶上进行电泳确认pcr产物后，使用ta克隆试剂盒(invitrogen)克隆产物。序列通过测序确认。此后，用ecori和bamhi切出插入片段，并将其插入mscv
‑
ires
‑
gfp载体中用作表达载体。表3显示了引物和模板的组合以及获得的表达载体的名称。
[0407]
表3
[0408][0409]
使用lipofectamine 2000(invitrogen)将表达载体分别导入cho细胞中，并用r8h283抗体和mem
‑
108抗体染色24小时，由此通过facs分析每种抗体在gfp阳性细胞(具有引入的载体)中的结合。染色方法与上面第3部分中的相同。
[0410]
结果显示，首先，形成被r8h283识别的抗原所必需的表位的氨基酸序列存在于人cd98hc的203
‑
427位的区域中。进一步的精确研究显示表位存在于人cd98hc的365位氨基酸和427位氨基酸之间的区域中。然而，mem
‑
108抗体识别的表位被认为存在于428位和c
‑
末端之间的区域中(图14)。进一步的精确研究证实表位存在于人cd98hc的365位至407位的区域(ygdeigldaaalpgqpmeapvmlwdessfpd ipgavsanmtvk(seq id no:23))(图15)。在该序列中，从c端开始的第五个n是n
‑
糖基化位点。
[0411]
10.确定r8h283抗体的抗体分子可变区的碱基序列
[0412]
使用分型试剂盒(roche)确认r8h283单克隆抗体的亚类，并确定该亚类为igg2sa。此外，确定了由杂交瘤细胞r8h283产生的抗体分子的可变区的碱基序列和氨基酸序列。使用smarter race cdna扩增试剂盒(clontech)进行序列的确定。具体而言，使用cdna(cdna由源自产生r8h283抗体的杂交瘤细胞的mrna制备)作为模板，通过pcr反应扩增h链和κ链可变区的cdna片段，并对碱基序列进行解码。表4和表5显示了解码的h链和l链(κ链)的可变区
和互补决定区(cdr1至cdr3)的氨基酸序列和碱基序列。
[0413]
表4
[0414][0415]
表5
[0416]
[0417][0418]
11.r8h283单克隆抗体的细胞毒活性的测量
[0419]
通过蛋白g(ge healthcare)检测从产生r8h283抗体的杂交瘤细胞培养物的上清液中纯化得到的r8h283单克隆抗体在体外是否具有细胞毒活性。通过用铬释放测定检测是否存在补体依赖的细胞毒(cdc)活性来进行测试。使用幼兔补体(cedarene)作为补体。对于骨髓瘤细胞，使用已知被r8h283抗体结合的u266、opm2、nci
‑
h929和rpmi8226。每个骨髓瘤细胞系用
51
cr标记2小时并洗涤三次。将标记的细胞(1
×
104个细胞)在96孔u形底板中在160μl rpmi1640培养基 胎牛血清中培养，所述培养基中添加有r8h283单克隆抗体或同种型对照以及25％的幼兔补体(1
×
104个细胞)。在使用u266的测试中，使用的每种抗体具有0.1mg/ml或1mg/ml的终浓度。在使用opm2、nci
‑
h929或rpmi8226的测试中，使用的每种抗体具有10μg/ml的终浓度。在37℃和5％co2下培养90分钟后，计数释放到上清液中的
51
cr。如下所述计算具体的细胞毒活性。
[0420]
cdc活性＝(从测试中使用的细胞中释放的
51
cr
‑
不存在抗体时自发释放的
51
cr)/(通过添加1％triton x
‑
100获得的最大
51
cr释放量
‑
不存在抗体时自发释放的
51
cr)
×
100
[0421]
图16c和16d显示了测量结果。证实r8h283单克隆抗体对所有检测的骨髓瘤细胞系具有明显的补体依赖性细胞毒性。
[0422]
此外，还检测了抗体依赖性细胞毒(adcc)活性。与补体依赖性细胞毒性的测量一样，用
51
cr标记靶细胞，并将在含有10％fbs、10ng/ml小鼠gm
‑
csf和40iu/ml人il2的rpmi1640培养基中培养6天的scid小鼠的骨髓细胞用作效应细胞。将r8h283抗体或其同种型抗体(对照)加入到96孔板中，向其中加入靶细胞(1.0
×
104)和效应细胞(5
×
105)。在使用u266的测试中，使用的每种抗体具有0.1mg/ml或1mg/ml的终浓度。在使用opm2、nci
‑
h929或rpmi8226的测试中，使用的每种抗体具有10μg/ml的终浓度。反应在37℃下进行4小时。通过离心分离后，用γ计数器测量释放到上清液中的
51
cr。根据以下等式确定adcc活性。
[0423]
adcc活性＝(从测试中使用的细胞中释放的
51
cr
‑
不存在抗体时自发释放的
51
cr)/(通过添加1％triton x
‑
100获得的最大
51
cr释放量
‑
不存在抗体时自发释放的
51
cr)
×
100
[0424]
图16a和图16b显示了测量结果。证实r8h283单克隆抗体对所有检测的骨髓瘤细胞
系具有明显的adcc活性。
[0425]
这些结果表明，r8h283单克隆抗体和识别与r8h283单克隆抗体识别的表位相同的表位的抗体可以作为用于治疗多发性骨髓瘤的活性成分。
[0426]
12.体内具有细胞毒活性的抗人cd98hc单克隆抗体对骨髓瘤细胞生长的抑制作用(皮下肿瘤模型)
[0427]
使用在上述第11部分中证实具有细胞毒活性的r8h283单克隆抗体检查体内对多发性骨髓瘤的治疗效果。向scid小鼠皮下移植骨髓瘤细胞系opm2(1
×
107)。当肿瘤体积超过30mm3时，将小鼠分为施用抗cd98hc抗体的组和施用igg的对照组；向各组施用10mg/kg的r8h283单克隆抗体或对照igg，每周两次。每周两次测量肿瘤体积，体积表示为以下近似值：最长直径
×
最短直径
×
高度/2。由移植的骨髓瘤细胞系opm2形成的肿瘤块的体积超过30mm3的时间点是第0天，图17a显示了从第0天开始的肿瘤体积的变化。图17b显示了在第21天对照小鼠(施用igg)和施用r8h283抗体的小鼠的肿瘤尺寸。箭头表示肿瘤的宽度。如图17a和17b所示，当施用对照igg时，骨髓瘤细胞以指数方式生长；然而，当施用具有细胞毒活性的r8h283单克隆抗体(r8h283)时，骨髓瘤细胞的生长几乎完全被抑制。随后，剂量降低至1mg/kg或0.1mg/kg，并进行完全相同的测试。结果表明即使施用1mg/kg也能提供足够的效果(图17c)。
[0428]
13.体内具有细胞毒活性的抗人cd98hc单克隆抗体对骨髓瘤细胞生长的抑制作用(肠胃外施用模型)
[0429]
为了检查在更符合生理条件的环境下对骨髓瘤细胞的作用，检测抗体对通过静脉循环转移并移植到骨髓中的骨髓瘤细胞的作用。将引入了萤光素酶表达载体的骨髓瘤细胞株u266的5
×
106个细胞移植到暴露于2.4gy辐射的nod/scidγc
‑
/
‑
(nog)小鼠的静脉中。7天和10天后，将r8h283抗体或对照igg腹膜内施用于小鼠。为了检查抗体的效果，在第14天分析小鼠骨髓中人骨髓瘤细胞的嵌合状态。在施用对照igg抗体的组的每只小鼠中清楚地观察到cd138 u266细胞在骨髓中的植入，发现在以10mg/kg和1mg/kg两种剂量施用r8h283抗体的小鼠组中骨髓瘤细胞消失。令人惊讶的是，即使在0.01mg/kg的极低剂量下，骨髓中u266细胞的数量也显著减少(图18a和18b)。另外，在抗体以5mg/kg的剂量施用的实验中，在第14天未对小鼠进行分析，但在第40天使用ivis进行肿瘤成像。在施用对照igg组的整个小鼠体内观察到肿瘤扩散，但在施用r8h283的组中没有检测到肿瘤，表明肿瘤看起来已经被治愈(图18c)。这些结果揭示了r8h283单克隆抗体(r8h283)和识别与r8h283相同的表位的抗体对表达cd98hc的骨髓瘤细胞具有有效的细胞毒活性。
[0430]
14.体内具有细胞毒活性的抗人cd98hc单克隆抗体对骨髓瘤细胞生长的抑制作用(骨髓移植模型)
[0431]
在大多数情况下，骨髓瘤细胞是一种肿瘤，仅在骨髓中生长，认为其能够从骨髓微环境获得巨大的生存支持。为了进一步研究在生理环境下对骨髓瘤细胞的作用，将骨髓瘤细胞直接移植到骨髓中，检查抗体对移植到骨髓中的大量骨髓瘤细胞的影响。将引入了萤光素酶表达载体的骨髓瘤细胞株u266的4
×
105个细胞移植到已经暴露于2.4gy辐射的b6
‑
rag2
‑
/
‑
γc
‑
/
‑
sirpa(brgs)小鼠的胫骨骨髓中。7天后，通过ivis确认表达萤光素酶的u266细胞移已植入胫骨骨髓。此后，在第7、10、14和17天，给小鼠腹膜内施用0.5mg/kg剂量的r8h283抗体或对照igg或1mg/kg剂量的硼替佐米。为了检查抗体和硼替佐米的效果，在第21
天用ivis进行萤光素酶表达成像。虽然在施用对照igg和施用硼替佐米的组中检测到表达萤光素酶的u266细胞，但在施用r8h283抗体的组未检测到肿瘤(图19)。这些结果揭示，即使当骨髓瘤细胞存在于骨髓中时，r8h283单克隆抗体(r8h283)和识别与r8h283的表位相同的表位的抗体对表达cd98hc的骨髓瘤细胞也具有有效的细胞毒活性。
[0432]
15.表位分析
[0433]
进一步详细研究上面第9部分对r8h283抗体所针对的表位的检测结果。制备图20所示的6种人/小鼠嵌合体cd98hc蛋白的表达载体，并通过脂质转染引入cho细胞。48小时后，通过facs分析是否存在r8h283抗体结合。
[0434]
结果证实，用源自小鼠的氨基酸残基取代cd98hc蛋白上365
‑
376或395
‑
409位氨基酸残基的区域导致r8h283抗体不与cd98hc蛋白结合(图20)。如图21所示，在由cd98hc蛋白的365
‑
409位的氨基酸残基构成的片段中，在源自人的cd98hc和源自小鼠的cd98hc之间不同的氨基酸残基为在以下位置的15个氨基酸残基：371位、374位、375位、376位、383位、384位、387位、389位、391位、395位、396位、397位、400位、401位和404位。因此，图20中显示的结果表明r8h283抗体识别位于371位、374位、375位、376位、395位、396位、397位、400位、401位和/或404位的氨基酸残基。
[0435]
因此，通过用小鼠来源的氨基酸序列取代人cd98hc 1
‑
4个位置上的氨基酸残基制备表达7种变体的载体(i371l、d374/a375q、a376g、d391n/f395i/p396f/d397h、f395i/p396f/d397h、g400r/a401p和a404l),并通过脂质转染引入cho细胞。使用primestar诱变基础试剂盒(宝生物工程株式会社)制备7种cd98hc变体蛋白的表达载体。使用的引物序列和用作模板的dna如下所示。
[0436]
表6
[0437]
[0438]
对于对照，人cd98hc和小鼠cd98hc也在cho细胞中表达。通过facs分析是否存在r8h283抗体与这些细胞的结合。如图22所示，结果表明r8h283抗体不与d391n/f395i/p396f/d397h、f395i/p396f/d397h和g400r/a401p结合(即，在通过流式细胞术测量荧光强度时，抗体与同种型对照(小鼠来源的cd98hc)的荧光强度之比小于1.05(平均荧光强度或mfi))。这些结果表明395
‑
397位的氨基酸和401位及402位的氨基酸是r8h283抗体与cd98结合所必需的。此外，在d374/a375q变体中观察到r8h283作用显著减弱，表明在374和375位的氨基酸也有助于r8h283的结合。