抗炎剂

抗炎剂
1.相关申请
2.本技术要求澳大利亚临时申请au2019901968的优先权，在此将其全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
3.本发明涉及抗炎的肽、包含其的药物组合物及其用于治疗炎症的用途，所述炎症包括但不限于与免疫应答相关的炎症。


背景技术：

4.说明书中对任何现有技术的引用并不意味着承认或暗示该现有技术形成任何管辖权中的公知常识的一部分，或者该现有技术可以合理地预期为被本领域技术人员理解、认为是相关的和/或与其他现有技术组合。
5.炎症过程可能与免疫系统的异常活化相关或由免疫系统的异常活化引起，导致炎症和免疫活化的自身持续循环以及随后的免疫应答，这可能会使人非常虚弱。
6.这些过程可以是急性和慢性炎症的成因，包括在皮肤、肌肉骨骼、肠或肺部病症或疾病中观察到的炎症。
7.与包括异常巨噬细胞或树突细胞活化的异常免疫细胞应答相关或由其引起的过程引起特别关注。一个具体的实例是银屑病，这是一种特别棘手且不可治愈的病状，据估计影响1-4％的西方人群，其特征是存在表皮增生以及皮肤中出现过度炎性浸润。
8.其他炎性疾病或病症可以是特发性的，并怀疑伴有免疫参与，皮肤疾病的实例包括接触性和特应性皮炎、多形性日光疹和白癜风。
9.一些当前的治疗具有显著的免疫抑制副作用或其他不良事件。
10.需要提供预防或治疗炎症反应的疗法。
11.需要提供预防或治疗与免疫系统异常活化相关或由其引起的炎症反应的疗法。
12.发明简述
13.本发明试图解决上述限制或需要中的一者或多者。因此，在第一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗需要该预防或治疗的个体中炎症的抗炎的肽，该肽包含以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：
[0014]-氨基酸序列tvltvv(seq id no:1)或氨基酸序列llllltvltvv(seq id no:2)或其功能变体；
[0015]
其中该肽由少于21个氨基酸残基组成，优选地由6至20个氨基酸残基组成。
[0016]
在优选的实施方案中，本发明提供了一种由seq id no:1的氨基酸序列组成的肽。
[0017]
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种由seq id no:2的氨基酸序列组成的肽。
[0018]
在本发明的可选实施方案中，抗炎的肽包含以下各项、或由以下各项组成或基本上由以下各项组成：seq id no:30的氨基酸序列，或其功能变体或片段。更优选地，该肽由
seq id no:30的氨基酸序列组成。
[0019]
在本发明的另一方面，提供了一种多肽，该多肽包含：
[0020]-一种包含seq id no:1或seq id no:2的氨基酸序列或由其组成的肽；以及
[0021]-与seq id nos:1和2的序列相邻的一个或多个另外的氨基酸，条件是该一个或多个另外的氨基酸不限定与seq id no:1或2的序列相邻的n末端位置处的序列mtpgtqspff；或与seq id no:1或2的序列相邻的c末端位置处的序列tgsghasstp，
[0022]
其中该多肽包含至少20个氨基酸残基，优选地包含20至1000个残基。
[0023]
在本发明的又一方面，提供了一种抗炎的肽，该抗炎的肽包含：
[0024]-一种如本文所定义的肽，该肽优选地为包含seq id no:1和2(优选地为seq id no:3或30)中任一项的序列或其功能变体或片段的肽；
[0025]-任选地，一种或多种修饰物，该一种或多种修饰物选自以下各项：
[0026]
ο用于促进该肽在生物流体、组织或制剂中溶解的修饰物，
[0027]
ο用于促进肽进入细胞的部分，和
[0028]
ο用于使得能够检测该肽的修饰物或部分。
[0029]
在本发明这一方面的实施方案中，该肽优选包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:30的序列至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
[0030]
本发明提供了一种由根据seq id nos:1至65中任一项的序列或其功能变体或片段组成的肽。功能变体或片段通常表现出至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、70％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸同一性，并且保留它们在治疗或预防本文包括实施例中所述的炎症反应中的功能。
[0031]
在任何实施方案中，用于促进肽溶解的修饰物为促进肽溶解的氨基酸残基(或其系列)、聚合物或其他功能部分的形式。在某些实施方案中，用于促进肽溶解的修饰物包含不同长度的聚乙二醇(peg)。例如，peg可包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多个乙二醇单元。或者，peg可不包含乙二醇单元。
[0032]
在另一些的实施方案中，用于促进肽溶解的修饰物包含一个或多个带电荷的氨基酸残基，优选地为一个或多个阳离子氨基酸残基，更优选地为一个或多个赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)。
[0033]
应当理解，用于促进肽溶解的修饰物可以位于肽的n末端区域或c末端区域。优选地，该修饰物位于肽的n末端区域。
[0034]
可以使用用于促进肽溶解的一种或多种修饰物，例如聚合物和阳离子氨基酸残基的组合。
[0035]
在任何实施方案中，用于检测肽的部分为本领域已知的用于促进体内或体外检测
肽的任何标记物。标记物可以是荧光标记物，诸如gfp、yfp、bfp、cfp、y-fast、af594、mcherry或dsred。标记物可以是生物素。或者，标记物可以是金属标记物，诸如(gd)dota。
[0036]
在又一个实施方案中，本文所述的肽可以含有氨基酸残基的合成变体。在某些实施方案中，合成氨基酸变体为光致亮氨酸。
[0037]
在任何实施方案中，本文所述的肽可包含与n-或c-末端区域缀合的细胞穿透肽(cpp)以促进或帮助本文所述的任何肽进入细胞。细胞穿透肽的非限制性实例在现有技术中是公知的并且在本文中进一步描述。非限制性实例包括tat和基于tat的肽。
[0038]
在本发明的特别优选实施方案中，抗炎的肽包含如seq id no:12：kkkk-peg-mtpgtqspffllllltvltvv中定义的肽，或由其组成或基本上由其组成。更优选地，该肽如seq id no:12中所定义。
[0039]
在某些实施方案中，本发明的肽可进一步与本领域已知的任何抗炎的肽缀合。
[0040]
在本发明的任何实施方案中，本文所述的肽包含含有不同长度的甘氨酸或丝氨酸重复序列的接头。本发明的肽和接头可直接或间接连接。优选地，接头位于肽的n-末端，尽管应当理解接头也可位于肽的c-末端。在一个实施方案中，接头包含序列ggg，并且根据本发明的肽包含以下各项或由以下各项组成：kkkk-ggg-mtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:22)或其功能变体(包含kkkk-ggg-tpgtqspffllllltvltvv(seq id no:23))。
[0041]
抗炎的肽可包含本文表a-e中任一个表中所述的任何肽，或由其组成或基本上由其组成。
[0042]
在任何实施方案中，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的肽中的任一种肽(包括seq id no:1至66的肽中的任一种肽)或其功能变体，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，或其药学上可接受的盐。
[0043]
在某些实施方案中，药物组合物包含肽，该肽包含以下各项或由以下各项组成：seq id no:1、2、3、12或30的序列和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，或其药学上可接受的盐。
[0044]
在又一个实施方案中，任何肽或包含药学有效量的本文所述的肽中任一种肽或其功能变体或其药学上可接受的盐的组合物不包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。
[0045]
本发明还提供了一种包含本文所述的任何肽和另外的活性剂的组合物。另外的活性剂可以是抗炎剂、非甾体抗炎药物(nsaid)、缓解疾病的抗风湿药物(dmard)或用于治疗需要治疗的炎性病症的其他活性剂(例如，视情况而定，用于治疗牛皮癣、皮炎、类风湿性关节炎的药剂)。
[0046]
在某些实施方案中，抗炎剂是皮质类固醇。适用于本发明的皮质类固醇的非限制性实例包括曲安西龙、地塞米松、莫米松、可妥龙、曲安奈德、可的松、泼尼松、甲泼尼龙和二丙酸倍他米松。
[0047]
或者，该另外的抗炎剂是用于抑制促炎性分子活性的抗原结合蛋白。优选地，抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。通常，抗原结合蛋白是抗体，例如单克隆抗体。
[0048]
在某些实施方案中，用于抑制促炎性分子活性的抗原结合蛋白(例如单克隆抗体)与抗炎性分子结合，从而抑制该分子促进炎症反应的活性。抗原结合蛋白可以与促炎性分子的受体结合，从而抑制促炎性分子的活性。根据本发明使用的合适的抗原结合蛋白或单
克隆抗体的非限制性实例包括那些能够抑制促炎性分子活性的蛋白或抗体，该促炎性分子包括白介素-17(il-17)、白介素-12(il-12)、白介素-6(il-6)、白介素-22(il-22)、白介素-23(il-23)、白介素-36(il-36)和肿瘤坏死因子α(tnfα)。此类抗原结合蛋白或单克隆抗体的实例包括布罗达单抗、依奇珠单抗或苏金单抗(用于抑制il-17)、妥珠单抗或司妥昔单抗(用于抑制il-6)、古塞库单抗或替拉珠单抗或米吉珠单抗或布雷库单抗或瑞莎珠单抗或乌司奴单抗(用于抑制il-23)、非扎奴单抗(用于抑制il-22)、依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗(用于抑制tnfα的活性)。
[0049]
在另外的活性剂是dmard的实施方案中，dmard可以是沙利度胺、来那度胺、甲氨蝶呤。
[0050]
在又一些的实施方案中，另外的活性剂可以是已知用于治疗炎性病症的任何药剂，非限制性实例包括：钙泊三醇、阿那白尼、炎性抑制剂、巴瑞替尼、阿洛替尼、乌帕替尼(jak抑制剂)、托法替尼、鲁索利替尼、抗组胺剂、局部他克莫司(钙调磷酸酶抑制剂)和危并苯唑(磷酸二酯酶4(pde4)抑制剂)。
[0051]
包含本文所述的任何肽和另外的抗炎剂的组合物可提供比单独的肽所提供的效果更大的抗炎效果。例如，与单独的各个组分的作用相比，本文所述的任何肽和皮质类固醇的作用是协同的。因此，本发明还包括协同组合物，该协同组合物包含本文所述的肽和另外的抗炎剂，其中另外的抗炎剂优选地为皮质类固醇、dmard或用于结合以抑制促炎性分子活性的抗原结合蛋白。
[0052]
在任何实施方案中，包含本文所述的任何肽和另外的抗炎剂的组合物可被配制用于以片剂、糖浆或液体、吸入器或鼻喷雾剂、注射剂(包括用于皮内或皮下注射、中胚层疗法/微针疗法的制剂)、贴剂的形式施用或作为霜剂、软膏剂、喷雾剂、洗剂或凝胶。
[0053]
在另一个实施方案中，提供了编码的本文定义的肽的包含dna或rna序列的核酸或其片段，包括具有开放阅读框的核酸或其片段，该开放阅读框编码治疗性多肽，并且在适当条件下能够被表达为本发明的治疗性肽中的一种肽。或者，本发明提供了包含上述核酸或其片段的载体或质粒。
[0054]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗个体中炎症或炎性病症的方法，该方法包括向有需要的个体施用肽或药学上有效量的本文所述的组合物，从而预防或治疗个体中的炎症。
[0055]
炎症可位于选自皮肤或粘膜组织、肌肉骨骼、肺或肠组织的组织之中或之上。在某些优选的实施方案中，本发明的方法用于治疗真皮组织中的炎症。
[0056]
炎症可以是选自炎性皮肤病或病症、肌肉骨骼病或病症、肺病或病症、或肠疾病或病症的疾病或病状的症状。
[0057]
可通过使用本文所述的肽或组合物治疗或预防的炎性病症和相关病状包括但不限于类风湿性关节炎、支气管炎、接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病、脂溢性皮炎、湿疹、变应性皮炎、多形性日光疹、炎性皮肤病、毛囊炎、脱发、白癜风、毒葛、昆虫叮咬、痤疮炎症、由包括但不限于化学品、创伤、污染物(诸如香烟烟雾)和日光暴露的外在因素引起的刺激、由包括但不限于干燥病、角化过度、瘙痒、炎性后色素沉着过度、瘢痕形成、肺部炎性病状(包括流感)、狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病和硬皮病引起的第二病状、超敏性肺炎、伤口愈合和炎性肠病(包括结肠炎和克罗恩病)，或由移植引起的炎症(移植物抗宿主病，
gvhd)。
[0058]
在优选的实施方案中，当炎性病症和相关病状是炎性皮肤病症时，该病症可以是接触性皮炎、特应性皮炎、变应性皮炎或银屑病。在此类实施方案中，施用本文所述的肽或组合物使选自红斑、皮肤增厚、鳞屑和炎性水肿的一种或多种症状最小化。
[0059]
在另一个实施方案中，待治疗的炎症与tnf、il-6或il-17或il-12/23产生相关。因此，施用本文所述的肽或组合物可以使炎性细胞因子释放最小化，该炎性细胞因子优选地为tnf、il-6、il-17和il-12/23。
[0060]
在另一个实施方案中，施用本文所述的肽或组合物使淋巴细胞、嗜中性粒细胞或肥大细胞或抗原呈递细胞在炎症部位的活化最小化，该抗原呈递细胞优选地为巨噬细胞或树突细胞。
[0061]
在另一个实施方案中，提供了一种调节个体中免疫应答的方法，该方法包括向有需要的个体施用本文所述的肽或药学有效量的组合物，从而调节个体中的免疫应答。免疫应答的调节将被理解为在本文所证明的任何实施例中观察到的响应于本发明的肽或组合物的作用，或者被本领域技术人员所理解。
[0062]
在一个实施方案中，免疫应答是适应性免疫应答或先天性免疫应答。当免疫应答是先天性免疫应答时，先天性免疫应答与抗原呈递细胞的活化相关，该抗原呈递细胞优选地为巨噬细胞或树突细胞。
[0063]
在任何实施方案中，本发明的方法还可包括施用另外的活性剂，包括抗炎剂、非甾体抗炎药物(nsaid)、缓解疾病的抗风湿药物(dmard)或用于治疗需要治疗的炎性病症的其他活性剂(例如，视情况而定，用于治疗银屑病、皮炎、类风湿性关节炎的药剂)或施用另外的治疗方案(例如使用光疗)。
[0064]
在某些实施方案中，该方法包括施用皮质类固醇形式的另外的抗炎剂。适用于本发明方法的皮质类固醇的非限制性实例包括曲安西龙、地塞米松、莫米松、可妥龙、曲安奈德、可的松、泼尼松、甲泼尼龙和二丙酸倍他米松。
[0065]
或者，该方法可包括施用抗炎剂，该抗炎剂是用于抑制促炎性分子活性的抗原结合蛋白。优选地，抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。通常，抗原结合蛋白是抗体，例如单克隆抗体。抗原结合蛋白(例如单克隆抗体)可以是能够抑制促炎性分子活性的任何抗原结合蛋白或单克隆抗体，该促炎性分子包括白介素-17(il-17)、白介素-12(il-12)、白介素-6(il-6)、白介素-22(il-22)、白介素-23(il-23)、白介素-36(il-36)和肿瘤坏死因子α(tnfα)。此类抗原结合蛋白或单克隆抗体的实例包括布罗达单抗、依奇珠单抗或苏金单抗(用于抑制il-17)、妥珠单抗或司妥昔单抗(用于抑制il-6)、古塞库单抗或替拉珠单抗或米吉珠单抗或布雷库单抗或瑞莎珠单抗或乌司奴单抗(用于抑制il-23)、非扎奴单抗(用于抑制il-22)、依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗(用于抑制tnfα的活性)。
[0066]
在另外的活性剂是dmard的实施方案中，dmard可以是沙利度胺、来那度胺、甲氨蝶呤。
[0067]
在又一些的实施方案中，另外的活性剂可以是已知用于治疗炎性病症的任何药剂，非限制性实例包括：钙泊三醇、阿那白尼、炎性抑制剂、巴瑞替尼、阿洛替尼、乌帕替尼(jak抑制剂)、托法替尼、鲁索利替尼、抗组胺剂、局部他克莫司(钙调磷酸酶抑制剂)和危并
苯唑(磷酸二酯酶4(pde4)抑制剂)。
[0068]
在另一个实施方案中，提供了一种本文所述的肽在制备药物中的用途，该药物用于：
[0069]-预防或治疗炎症，该炎症优选地为与异常免疫活化相关的炎症，任选地为接触性皮炎、特应性皮炎、变应性皮炎或银屑病；
[0070]-调节免疫应答，该免疫应答优选地为先天性免疫应答；
[0071]-降低tcrαβ

t细胞水平；
[0072]-降低tcrγδ t细胞水平；
[0073]-增加调节性细胞，该调节性细胞优选地为cd4

t调节性细胞；或
[0074]-抑制嗜中性粒细胞、肥大细胞或抗原呈递细胞在炎症部位的活化，该抗原呈递细胞优选地为巨噬细胞或树突细胞。
[0075]
在另一个实施方案中，该药物还可包含用于预防或治疗炎症反应的抗炎剂，该抗炎剂优选地为皮质类固醇。在又一个实施方案中，该药物还可包含用于与促炎分子结合的抗原结合蛋白，该促炎分子优选地选自白介素-17(il-17)、白介素-12(il-12)、白介素-6(il-6)、白介素-23(il-23)、白介素-36(il-36)和肿瘤坏死因子(tnf)。
[0076]
在又一个实施方案中，提供了：
[0077]-一种本文所述的肽在制备第一药物中的用途；以及
[0078]-一种用于预防或治疗炎症反应的皮质类固醇在制备第二药物中的用途；或
[0079]-一种用于抑制促炎性分子活性的抗原结合位点在制备第二药物中的用途，该促炎性分子优选地选自白介素-6(il-6)、白介素-17(il-17)、白介素-12(il-12)、白介素-23(il-23)、白介素-36(il-36)和肿瘤坏死因子(tnf)，
[0080]
上述药物用于：
[0081]-预防或治疗炎症，该炎症优选地为与异常免疫活化相关的炎症，更优选地为接触性皮炎、特应性皮炎、变应性皮炎或银屑病；
[0082]-调节免疫应答，该免疫应答优选地为先天性免疫应答；
[0083]-降低tcrαβ

t细胞水平；
[0084]-降低tcrγδ t细胞水平；
[0085]-增加调节性细胞，该调节性细胞优选地为cd4

t调节性细胞；或
[0086]-抑制嗜中性粒细胞、肥大细胞或抗原呈递细胞在炎症部位的活化，该抗原呈递细胞优选地为巨噬细胞或树突细胞。
[0087]
在另一个实施方案中，提供了如上文所述的肽或药学有效量的组合物，其用于预防或治疗炎症，该炎症优选地为与异常免疫活化相关的炎症。
[0088]
在任何实施方案中，本文所述的肽或组合物适于通过皮内、关节内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外施用、口服、舌下、脑内、淋巴结内、气管内、阴道内、经皮、直肠、经吸入或局部施用，特别是施用至耳、鼻、眼或皮肤。在优选的实施方案中，本文所述的肽或组合物通过局部、鼻内或经吸入施用。
[0089]
如本文所用，除非上下文另有要求，术语“包括”或其变型，例如“包含”和“含有”，不旨在排除另外的添加物、组分、整体或步骤。
[0090]
根据通过举例并参考附图给出的以下描述，本发明的其他方面和在前述段落中描
述的各个方面的其他实施方案将变得显而易见。
附图说明
[0091]
图1-施用肽会引起皮肤肿瘤加速生长。在uv13-1肿瘤细胞转移前21天和7天，对小鼠皮下注射含有5nmol肽rp23(seq id no:12)(实线)、pbs或脂质体对照(虚线)的混合物。如果肽rp23包含在疫苗制剂中，则肿瘤生长更快(a)且小鼠更早死于肿瘤(b)。使用对数秩检验统计分析存活差异。
[0092]
图2-施用肽缓解了接触性皮炎小鼠模型中的炎症并减少了骨髓炎性浸润。(a)dnfb诱导的接触性皮炎的实验概述。(b)经肽rp23(seq id no:12)处理的小鼠的耳厚度，该处理过程重复3次。(c)在dnfb(d15)刺激后72小时，通过流式细胞术表征耳内炎性浸润，并证明单核细胞/巨噬细胞群(cd11b

)的改变。数据表示为平均值
±
标准误。通过(b)多重t检验和(c)anova结合dunnett多重比较试验确定统计显著性差异，其中*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001。
[0093]
图3-肽效应取决于肽序列和剂量。(a)在c57bl/6小鼠(n＝5)腹部用dnfb致敏七天前皮下注射pbs、加扰肽或肽muc1sp(mtpgtqspffllllltvltvv；seq id no:3)。dnfb刺激后，确定了耳部上的炎症，这证明该作用对seq id no:3序列是特异性的。(b)比较肽rp23(seq id no:12)和肽muc1sp(seq id no:3)的免疫抑制作用。(c)seq id no:12以剂量依赖性方式抑制免疫。(d)向seq id no:12注射液中添加gm-csf消除了免疫抑制。得到的数据是平均值
±
标准误。
[0094]
图4-施用肽降低了银屑病小鼠模型中的局部疾病严重程度。(a)实验概述(b)与每天(0-4天)局部施用糖皮质激素至背部和耳部相比，接受pbs或肽rp23(seq id no:12)注射的小鼠的临床评分。(c)测量局部到肽rp23注射位点的疾病。使用无偏度的红斑计测量发红并使用手动测径器测量皮肤厚度。(d)第5天的脾重量作为全身免疫抑制的量度。耳厚度测量值表明肽rp23在远端位点不抑制疾病。数据表示为平均值
±
标准误。通过anova结合dunnett多重比较试验确定统计显著性差异，其中*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001、****p《0.0001。
[0095]
图5-施用肽降低了促炎树突细胞和巨噬细胞的活化。(a)用lps
±
肽rp23(seq id no:12)刺激c57bl/6鼠脾细胞，通过流式细胞术评估树突细胞上活化标记的表达。(b)用肽rp23孵育骨髓衍生的鼠巨噬细胞(30分钟)并用lps刺激(过夜)。阳性对照仅用lps进行刺激。未对阴性对照进行刺激。通过elisa法评估炎性细胞因子的产生。(c)从人血液中分离cd14 细胞并使用人血清将其培养分化成巨噬细胞。使用肽rp23孵育细胞(30分钟)，然后用lps(左图)或咪喹莫特(右图)刺激过夜。通过elisa法评估炎性细胞因子(il-6或il-12/23)的产生。数据代表6个供体。数据表示为平均值
±
标准误。通过anova结合dunnett多重比较试验确定统计显著性差异，其中*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001。
[0096]
图6-施用肽对鼠和人巨噬细胞/单核细胞不存在细胞抑制性或细胞毒性。在过夜孵育后，(a)通过wst-1测定法评估肽rp23(seq id no:12)在raw和thp-1细胞系中的细胞抑制/细胞毒性作用(得到的数据是2个重复测定值的平均值)；(b)通过ldh测定法评估肽rp23(seq id no:12)在原代鼠bmdm或人mdm中的细胞抑制/细胞毒性作用(得到的数据是平均值
±
标准误)。
[0097]
图7-施用肽降低了人皮肤中自发性骨髓细胞的活化。(a)将肽rp23(seq id no:12)皮内注射到健康人皮肤移植物中。过夜孵育后评估骨髓细胞活化。(b)肽rp23对皮肤中骨髓细胞亚群上活化标记的自发上调作用。数据代表6个供体。
[0098]
图8-肽变体对炎症反应的作用。在小鼠腹部皮下注射一次pbs或下列肽之一(10nmol)：(a)肽rp23(seq id no:12)、肽af594-rp23(seq id no:21)、肽k4-g3-muc1sp(seq id no:22)或muc1sp c片段(seq id no:2)。五天后，用dnfb刺激小鼠的耳部远端位点。72小时内测量耳厚度。
[0099]
图9-不含有n末端甲硫氨酸的另外的肽变体对接触性皮炎模型中炎症反应的作用。在小鼠腹部皮下注射一次pbs、rp23(seq id no:12)(10nmol)或表中所示的包含本文所述的seq id no:32和35(rp23的等摩尔量)的肽变体之一。在指示的位置，光致亮氨酸代替亮氨酸，这些分子用于光交联研究。七天后，用接触刺激物(dnfb)致敏腹部皮肤，并于五天后，用dnfb刺激小鼠的耳部远端位点。(a)耳厚度在72小时内增加明显，得到的数据是平均值
±
标准误(n＝6)。通过anova结合dunnett多重比较试验确定仅注射pbs对照的统计显著性差异，其中**p《0.01。(b)刺激后24小时耳厚度增加明显。得到的数据是平均值
±
标准误(n＝6)。通过t检验确定相关对照的统计显著性差异，如图中所示，*p《0.05，**p《0.01，ns＝不显著。
[0100]
图10.rp23和局部类固醇在咪喹莫特诱导的银屑病鼠模型中的治疗协同作用。将aldara霜剂(5％的咪喹莫特，57.5mg)每天(第0-4天)施用于c57bl/6雌性小鼠的背部以诱导银屑病。与仅在第-1天注射pbs相比，(a)于第-1天在小鼠背部注射pbs或rp23，并于第0天在其背部局部施用或不施用糖皮质激素(0.05％的二丙酸倍他米松，“bd”，30mg)；(b)于第1天在小鼠背部注射pbs或rp23，并在第1天局部施用糖皮质激素，得到临床评分(pasi；修正的银屑病皮损面积和严重程度指数)。得到的数据是平均值
±
标准误(n＝5)。通过anova结合dunnett多重比较试验确定仅注射pbs对照的统计显著性差异，其中*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001、****p《0.0001。
[0101]
图11.在咪喹莫特诱导的银屑病模型中，rp23处理减少了背部皮肤中的β

t细胞并增加了小鼠淋巴结中的cd4

t调节性细胞。于第-1天对c57bl/6雌性小鼠注射pbs或rp23，然后将aldara霜剂(5％的咪喹莫特，57.5mg)每天(第0-4天)施用于小鼠背部以诱导银屑病。于第15天，通过流式细胞术分析皮肤和腹股沟淋巴结以定量(a)银屑病背部皮肤中占总白细胞(cd45

)比例一部分的t细胞亚群，以及定量(b)皮肤引流淋巴结(腹股沟)中cd3

cd4

tcrαβt细胞的数目，并结合转录因子染色，以鉴定具有表型的调节性细胞(foxp3

)。得到的数据是平均值
±
标准误(n＝4-5)。通过多重t检验确定统计显著性差异，其中*p《0.05。
[0102]
图12.局部施用rp23可穿透人皮肤。将储备乳液中的rp23
af594
局部施用于全厚度人皮肤外植体并培养24小时。通过荧光显微镜分析冷冻切片。在表皮组织(e)和基底膜(线)下的真皮组织(d)中均可检测到rp23
af594
(其与dapi 细胞的结合在图中如箭头所示)。
[0103]
图13.rp23处理缓解了特应性皮炎鼠模型中的炎症。对c57bl/6雌性小鼠的耳部和剃后的背部致敏(第0天)并局部施用刺激剂噁唑酮或仅施用媒介物进行刺激(第7、10、14、17、19、21、23、25和27天)。于第-1天，或于第-7天和第-1天对小鼠注射rp23，与仅注射pbs(第-7天和第-1天)或在每次施用恶唑酮时在小鼠背部局部施用类固醇(0.01％的二丙酸倍他米松，30mg)进行比较。使用手动测径器测量耳厚度。得到的数据是平均值
±
标准误(n＝
5)。
[0104]
图14.rp23与皮肤和肺部中先天性免疫细胞的相互作用。在c57bl/6小鼠给药后24小时，通过流式细胞术鉴定af594-rp23

细胞。(a)在下背部皮下注射rp23。背部皮肤中的rp23

白细胞(cd45

)主要是嗜中性粒细胞(cd11b

ly6g

)或cd11b

髓样细胞亚群。(b)通过鼻内滴注将rp23递送到肺部。图中示出了肺部免疫细胞亚群中总rp23

白细胞的百分比分布情况。得到的数据是平均值
±
标准误(n＝4)。
[0105]
图15.rp23粘膜递送至肺部降低了肺部和支气管肺泡间隙中抗原呈递细胞的活化。(a)通过鼻内滴注对c57bl/6小鼠(n＝5)注射pbs或rp23，或(b)通过鼻内滴注对c57bl/6小鼠(n＝4)注射pbs、倒频rp23肽或rp23，然后24小时后鼻内施用pam2cys-sk
4-peg(oh)以诱导炎症状态。24小时后，收集来自支气管肺泡灌洗液和灌注肺中的细胞。通过流式细胞术测定cd11c

树突细胞上mhcii的平均荧光强度。得到的数据是平均值
±
标准误。通过(a)t检验(***p《0.001)和(b)anova结合dunnett多重比较试验确定pbs对照的统计显著性差异(*p《0.05)。
具体实施方式
[0106]
发明人在本文中鉴定了一类可用于抑制、预防或治疗炎症的肽。特别地，发明人已经确定本文表征的肽具有抑制、预防或治疗不适当的炎症反应的能力。在一个实施方案中，该肽可用于抑制与免疫系统活化相关的炎症反应。在另一个实施方案中，本文所述的肽可用于在不伴随免疫系统活化的情况下抑制炎症反应。
[0107]
本文所述的肽已被证明可用于许多模型中，这些模型通常用于评估包括皮炎和银屑病的炎症反应的活化。这些模型在本领域中被充分表征为包括急性炎症和/或慢性炎症的发作。因此，发明人认识到所定义的肽在多种伴随炎症的疾病或病症中的用途，其中所公开的那些仅是一些实例。
[0108]
本文所述的肽在抑制红斑中具有特别的效用，其中红斑是炎症反应过程中的一个关键特征。在一个方面，这通过抑制单核细胞/巨噬细胞或其他吞噬细胞浸润患病区域来实现。特别地，该肽能够减少炎性趋化因子或细胞因子的分泌以及促炎免疫细胞的表面活化标记的表达。非限制性实例包括cd86、mhcii和il-6、il-12/il-23、tnf-α和mcp-1的水平。发明人还取得了令人惊讶的发现，即抑制炎症反应的效果对细胞没有任何细胞抑制作用或细胞毒性作用。本文所述的肽令人惊讶地可以降低抗原呈递细胞的活化，降低真皮树突细胞的自发性活化，降低tcrαβ

细胞水平并增加cd4

t调节性细胞。这些数据表明肽在抑制各种炎性病状中的炎症中的潜在作用，这些炎性病状包括由tnf-α和其他促炎细胞因子介导的任何炎性病状或由调节性细胞如cd4

t调节性细胞诱导抑制的任何炎性病状。
[0109]
发明人获得的数据表明，本发明的肽通过在许多不同刺激下参与炎症刺激的先天性免疫细胞抑制促炎反应，包括自身炎症、组织损伤、癌症或感染。使用特征性th1型炎症模型或il-17/th17驱动模型，发明人认为本发明的肽可缓和(降低)th1/th17型反应的刺激，并且/或者可促进调节性反应(foxp3

cd4

t细胞)。因此，这些数据表明本发明的肽可能适用于治疗炎性病症，包括适应症，诸如牛皮癣、皮炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、移植排斥/耐受(移植物抗宿主病，gvhd)。
[0110]
因此，本文表征的肽可用于抑制、治疗或预防炎症反应，该炎症反应的特征在于以
下中的一种或多种：
[0111]
1.红斑；
[0112]
2.单核细胞浸润/巨噬细胞浸润；
[0113]
3.细胞因子和/或趋化因子水平升高；
[0114]
4.炎症细胞上细胞受体/标记的活化；
[0115]
5.树突细胞的活化；和/或
[0116]
6.淋巴细胞的活化。
[0117]
发明人还发现所描述的肽可用于以避免不必要的免疫系统抑制的方式减少局部炎症。这点是重要的，因为大多数临床开出的免疫抑制药物会引起全身性免疫抑制。因此，本文所述的肽提供了以前没有认识到的优点。
[0118]
炎症反应
[0119]
本文所述的肽可用于治疗或抑制伴随或不伴随免疫应答的急性或慢性炎症反应。或者，本文所述的肽可抑制与免疫应答相关的不适当的急性炎症反应，该免疫应答可以是先天性应答、适应性免疫应答或二者皆是。
[0120]
术语抑制不适当的炎症反应或治疗不适当的免疫应答是指减少炎症的一种或多种症状，包括具有炎症病状特征性的红斑(发红)、水肿(肿胀)、疼痛和瘙痒。这也可以理解为一种或多种促炎性细胞因子和/或趋化因子，诸如tnf-a、il-6、cxcl1、cxcl2、il-1β、前列腺素e2和il-23/il-17以及本领域已知的其他趋化因子/细胞因子的减少。
[0121]
在一个实施方案中，本文所述的肽可用于治疗或抑制伴随或不伴随免疫应答的急性炎症反应。在一个实施方案中，该肽可抑制与先天性免疫应答相关的急性炎症反应。
[0122]
急性炎症被理解为响应于组织损伤而发生的短期过程，通常在几分钟或几小时内出现。急性炎症具有五大症候：疼痛、发红、无法移动(功能丧失)、肿胀和发热。急性炎症反应包括血液白细胞的招募，组织驻留细胞(肥大细胞、树突细胞、成纤维细胞、巨噬细胞)的活化，以及一系列介质(包括il-1和tnf-α)的产生。其结果可包括炎症过程的最终消退、引起细胞再生或伤口愈合的触发事件、或炎症反应的进展，后者可被表征为慢性炎症。
[0123]
在一个实施方案中，本文所述的肽可用于治疗或抑制伴随或不伴随免疫应答的慢性炎症反应。在一个实施方案中，所述肽可抑制与适应性免疫应答相关的慢性炎症反应。
[0124]
慢性炎症被理解为持续数月至几年时间的缓慢且长期的炎症。慢性炎症可由许多不同因素引起，包括：(1)不能消除引起急性炎症的物质，诸如包括结核分枝杆菌、原生动物、真菌和其他寄生虫的感染性生物，其可以抵抗宿主防御并在组织中停留较长时间；(2)暴露于低水平的不能通过体内酶分解或吞噬作用消除的特定刺激物或外来物质；(3)自身免疫疾病，其中免疫系统对身体的正常组成部分敏感；(4)急性炎症的反复发作；或(5)引起氧化应激和线粒体功能障碍的炎性和生化诱导物。
[0125]
应当理解，慢性炎症过程可以通过本领域许多已知测试中的一种测试来诊断。这些测试包括(1)血清蛋白电泳(spe)，其显示伴随的低白蛋白血症和所有γ球蛋白的多克隆增加(多克隆丙种球蛋白病)；(2)血清高灵敏度c反应蛋白(hscrp)和纤维蛋白原(男性hscrp的正常血清水平低于0.55mg/l，女性hscrp的正常血清水平低于1.0mg/l，纤维蛋白原的正常水平为200-300mg/dl)的测定；以及检测促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素-1β(il-1β)、白介素-6(il-6)、白介素-8(il-8)、白介素-17(il-17)和白介素12/23
(il-12/23)。
[0126]
适应性免疫应答和先天性免疫应答
[0127]
本文所述的肽可用于抑制与适应性免疫应答或先天性免疫应答相关的炎症过程。
[0128]
适应性免疫或获得性免疫涉及体液(b淋巴细胞)和细胞介导的(t淋巴细胞)免疫应答。体液免疫涉及b细胞及其产物，包括抗体。细胞介导的免疫涉及吞噬细胞、抗原特异性cd4 t淋巴细胞和抗原特异性cd8 t淋巴细胞的活化，以及响应于抗原的各种细胞因子的释放。细胞介导的免疫引起抗原特异性细胞毒性t细胞的活化，这些抗原特异性细胞毒性t细胞能够在其表面上展示外源抗原表位的细胞中引起凋亡，诸如病毒感染的细胞或具有细胞内细菌的细胞。细胞介导的免疫应答，特别是cd4 辅助应答，也涉及b细胞的活化。细胞介导的免疫应答还涉及巨噬细胞和先天淋巴细胞(例如自然杀伤细胞)通过识别和分泌细胞毒性颗粒(对于自然杀伤细胞)和吞噬作用(对于巨噬细胞)来破坏病原体，以及刺激细胞分泌细胞因子。细胞介导的免疫主要由t细胞驱动、利用辅助性(cd4 )和细胞毒性(cd8 )亚型进行，并且参与对病毒感染、移植排斥、慢性炎症和肿瘤免疫的应答。活化的t细胞在暴露于新抗原后可能需要几天来启动细胞介导的攻击，但是如果通过先前的暴露来激发记忆t细胞，则记忆t细胞会产生快速应答。本文所述的肽可用于治疗与本领域已知的和本文所述的适应性免疫应答相关的慢性炎症过程。
[0129]
相反，先天性免疫系统由感染屏障(皮肤上皮、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道)、抗菌肽和蛋白质、体液成分(即补体和调理素)和细胞成分(即肥大细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和先天性淋巴细胞)组成。作为宿主防御的前沿，先天性免疫在耐受正常宿主菌群的同时，也在预防感染中起到重要作用。先天性免疫系统指导适应性免疫应答的后续发展。
[0130]
应当理解，本文所述的肽可用于抑制与身体中此类屏障层内的先天性免疫应答相关的不适当的炎症反应，该屏障层包括皮肤、胃肠、关节和呼吸道。
[0131]
本领域技术人员还将理解，不适当的炎症反应可能与适应性免疫应答和先天性免疫应答的活化相关。
[0132]
gm-csf
[0133]
在一个实施方案中，肽或包含药学有效量的本文所述肽或其药学上可接受的盐的药物组合物不包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。
[0134]
gm-csf是由巨噬细胞、t细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的单体糖蛋白，作为细胞因子发挥作用。已知gm-csf具有促炎作用，主要是由于其作为粒细胞、巨噬细胞和单核细胞以及树突细胞群的生长和分化因子发挥作用。因此，可阻断gm-csf或其受体的药剂已用作抗炎疗法。
[0135]
因此，设想本文所述的在抑制、治疗或预防不适当的炎症反应中具有效用的肽将不与促进炎症过程的生长因子、细胞因子、趋化因子等联合使用，因为这可能会影响本文所述的任何肽的治疗效果。这在本文实施例中得到例证，其中gm-csf消除了本发明的肽的抑制作用(图3)。
[0136]
对可促进炎症的这类生长因子、细胞因子、趋化因子等的测定完全在本领域技术人员的知识范围内并且可包括gm-csf、tnf-α、il-6、il-12、il-17、il-1β、mcp-1、mip-1、ifn-γ、il-18、il-23、ccl-2、ccl-3、ccl-4和ccl-5。
[0137]
适于使用所定义的肽治疗的病状
[0138]
本发明提供了一种在有需要的个体中治疗或预防不适当的免疫应答的方法，该方法包括向需要治疗的个体施用包含治疗有效量的本文所述的肽或其药学上可接受的盐的药物组合物，从而在该个体中治疗不适当的免疫应答。因此，发现本发明的肽在治疗广泛的炎性病症中具有效用。
[0139]
术语“个体”或“患者”或“受试者”在本文中是指正在治疗炎性病状和/或具有可见症状的炎性病症的哺乳动物或人。优选地，该个体是人。
[0140]
本文所用的“治疗有效量”是指当应用于组织的患病区域时将表现出抗炎作用的包含该肽的组合物制剂的任何量。单次施用本发明的制剂可能就足够了，或者可在一段时间内重复施用该制剂，例如一天数次，持续数天或数周。活性成分的量将随所治疗的病状、病状的发展阶段、宿主的年龄和类型以及所施用制剂的类型和浓度而变化。在任何给定情况下，适当的量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者能够通过常规实验确定。
[0141]
术语受试者的“治疗”包括向受试者施用或给予本发明的化合物(或向受试者的细胞或组织施用或给予本发明的化合物)，目的是延迟、减缓、稳定、治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、较少恶化、改善、改良或影响疾病或病状、疾病或病状的症状或疾病或病状的风险(或易感性)。术语“治疗”是指在治疗或改善损伤、病理或病状方面的任何成功迹象，包括任何客观或主观参数，诸如减轻；缓解；降低恶化率；减轻疾病的严重程度；稳定、减轻症状或使受试者对损伤、病变或病状更耐受；减缓退化或衰退的速率；使退化末期人不那么虚弱；或改善受试者的身体或精神健康。
[0142]
如本文所用，术语“预防”包括施用本发明的肽或组合物，从而停止或阻碍炎性病状中至少一种症状的发展。该术语还涵盖治疗缓解中的受试者以预防或阻止复发。
[0143]
可通过使用本文所述的肽治疗或预防的炎性病症和相关病状包括但不限于以下各项：类风湿性关节炎、支气管炎、接触性皮炎、特应性皮炎、牛皮癣、脂溢性皮炎、湿疹、变应性皮炎、疱疹样皮炎、多形性日光疹、炎性皮肤病、毛囊炎、脱发、白癜风、毒葛、虫咬、痤疮炎症、移植排斥/耐受(移植物抗宿主病，gvhd)、由包括但不限于化学品、创伤、污染物(诸如香烟烟雾)和日光暴露的外在因素引起的刺激、由包括但不限于干燥病、角化过度、瘙痒、炎症后色素沉着过度、瘢痕形成等炎症引起的继发病状。
[0144]
可使用本文所述的肽治疗或预防的炎性病症和相关病状还包括引起过度肺炎(包括由病毒或微生物感染引起的炎症)、狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病和硬皮病、过敏性肺炎的那些炎性病症和相关病状。
[0145]
可使用本文所述的肽治疗或预防的炎性病症和相关病状还包括在伤口愈合期间存在的那些炎性病症和相关病状以及包括溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎性肠病。
[0146]
优选地，可使用本发明的方法治疗或预防的炎性病症和相关病状包括接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病、病毒和微生物感染、伤口和炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肌肉骨骼炎性病状(包括例如类风湿性关节炎)和移植排斥/耐受(移植物抗宿主病，gvhd)。
[0147]
银屑病、皮炎和其他炎性皮肤病
[0148]
本领域技术人员将熟悉用于鉴定需要预防或治疗包括银屑病和皮炎的炎性皮肤病症的个体的方法，以及熟悉用于确定治疗此类病状功效的方法。
[0149]
如本文所用，皮炎可指接触性皮炎、特应性皮炎或疱疹样皮炎。
[0150]
特应性皮炎可以是选自内生性湿疹、弯曲湿疹、婴儿湿疹的湿疹形式，也可以被称为“贝尼耶素质性痒疹”、“神经性皮炎”或“结节性痒疹”。
[0151]
当该病状是特应性皮炎并且所施用的肽是局部施用时，与本发明的肽接触的皮肤区域可包括破裂的皮肤和未破裂的皮肤。
[0152]
银屑病是一种免疫介导的炎性皮肤病，其特征在于皮肤增厚、出现红斑和干燥鳞屑。银屑病可由许多因素触发，包括损伤、创伤、感染和药物治疗。用银屑病皮损面积和严重程度指数(pasi)等级临床评价该疾病，其中pasi等级对红斑(发红)、硬结(增厚)和脱屑(鳞屑)的严重程度分级。研究参数包括皮肤的活体临床评价、皮肤切片的组织病理学评价和任选的皮肤和/或内部免疫器官中的细胞因子分析。该疾病具有某些独特但重叠的临床表型，包括慢性斑块损伤、皮疹和脓疱损伤。有几种类型的银屑病，包括脓疱性银屑病、滴状银屑病、牛皮癣和红皮病型银屑病。本领域技术人员将理解，本文所述的肽适用于治疗或预防所有类型的银屑病。
[0153]
在组织学方面，该疾病的特征在于由于角化过度引起的表皮增厚、真皮组织和表皮组织中免疫细胞的浸润、角化不全和血管新生。咪喹莫特(imq)也会引起与人类疾病相关的组织病理学变化，包括：来自角质形成细胞过度增殖和分化改变的表皮变化，il-23增加，免疫细胞浸润(t细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)，以及血管形成改变。
[0154]
咪喹莫特诱导的银屑病模型特别适用于临床，因为它具有许多人类疾病的重要标志物，包括病变的组织病理学和免疫系统的强活化。咪喹莫特(imq)是tlr的配体，例如免疫细胞(包括巨噬细胞、单核细胞和类浆细胞树突状细胞)的tlr-7(toll样受体)，因此有助于免疫系统的强活化。该疾病在人类中的一个特点是涉及il-23/il17细胞因子轴。这种咪喹莫特诱导的银屑病模型化了人斑型银屑病，其中il-23/il-17细胞因子轴起关键作用。
[0155]
目前治疗银屑病的选择包括煤焦油制剂、皮质类固醇、去炎松(丙酮化合物，曲安奈德)、氯倍他索(丙酸氯倍他索)、合成形式的维生素d，诸如钙泊三烯和骨化三醇(vectical)、类视黄醇，诸如罗肤格(他扎罗汀，avage)、钙调磷酸酶抑制剂，诸如他克莫司(普特皮)和吡美莫司(elidel)、药物，诸如氨甲喋呤、阿曲汀、环孢菌素和钙泊三醇，以及紫外光疗法。
[0156]
因此，设想本文所述的肽可与上文所述的或本领域已知的用于治疗银屑病的治疗方案联合施用于有需要的患者。
[0157]
可通过使用银屑病皮损面积和严重程度指数(pasi)等级对红斑(发红)、硬结(增厚)和脱屑(鳞屑)的严重程度分级，通过上文所述的方法，或通过本领域已知的其他方法，评估银屑病的一种或多种症状的改善情况，来确定对治疗的成功反应。例如，在具有阳性反应的受试者中，红斑、硬结或脱屑中的一种或多种症状有所缓解。这种对治疗产生的阳性反应可以通过皮肤的临床评价、皮肤切片的组织病理学评价和任选的皮肤和/或内部免疫器官中的细胞因子分析来确定。用于评估阳性反应的其他手段将在本领域技术人员的知识范围内。
[0158]
炎性肠病
[0159]
炎性肠病(ibd)是发生在消化道的一组慢性炎性病症。它可以发展成溃疡性结肠炎，引起大肠和直肠内层产生长期炎症和溃疡，或发展成克罗恩病，其特征在于消化道(特
别是小肠和大肠)内层的炎症分散到患病组织，诸如口部、食管、胃部和肛门中。
[0160]
克罗恩病是一种以消化系统内层的慢性炎症为特征的病状。可能有一小块炎症，也可能炎症沿着肠道扩散至很远，或者可能在不同位置有几块炎症。典型的症状包括复发性腹泻，其特征为经常着急入厕，并且经常想入厕却无排泄物，腹痛和痉挛(通常在进食后更严重)，极度疲劳(疲乏)和/或体重减轻。结肠镜检查用于通过在显微镜下检查经取样的小组织样本(活检)进行诊断。
[0161]
溃疡性结肠炎是一种慢性炎症，通常发生在直肠(大肠中正好位于肛门内部的部分)和结肠的下部，但也可能影响整个大肠(结肠)。结肠发炎，如果这种炎症变得严重，结肠内层破裂并可能形成溃疡。可以通过以下方法诊断溃疡性结肠炎：用于检查炎症、贫血和蛋白水平的血液检测、检查粪便样品以确定是否感染、用于帮助评估病情严重程度的x-射线、用于检查直肠和结肠下部炎症严重程度的乙状结肠镜检查，和/或用于检查整个结肠内部的结肠镜检查。
[0162]
病毒感染
[0163]
本文所述的肽和组合物可用于治疗或预防任何引起炎症的病毒感染，包括呼吸道感染。与炎症反应相关的这类病毒感染包括普通感冒、流感、咳嗽和支气管炎、水痘、艾滋病、脑膜炎、肺炎、疱疹、轮状病毒、严重急性呼吸综合征(sars)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)和中东呼吸综合征(mers)。
[0164]
本领域技术人员将熟悉用于鉴定需要治疗病毒感染的个体的方法，以及熟悉用于确定给定病毒感染治疗功效的方法。例如，患有病毒感染的个体可能具有发热、肌肉疼痛、咳嗽、咽喉痛和头痛中的一种或多种症状。因此，对用本文所述的任何肽或组合物治疗产生的阳性反应包括这些症状中的一种或多种得到改善。例如，在对用本文所述的任何肽或组合物治疗具有阳性反应的个体中，发热、肌肉疼痛、咳嗽、喉咙痛或头痛症状减轻，或者这些症状可能已经完全消失。
[0165]
流行性感冒(通常称为“流感”)是一种由正粘病毒科家族的rna病毒(流感病毒)引起的感染鸟类和哺乳动物的传染病。该疾病最常见的症状是寒战、发热、咽喉痛、肌肉痛、严重头痛、咳嗽、虚弱/疲乏和全身不适。
[0166]
流感感染涉及多层事件序列。第一层是气道和肺泡上皮的病毒感染及其在这些细胞中的复制，在此期间限制病毒进入或复制的策略可以预防或减轻感染的严重程度。第二层是先天性免疫应答，接着是对病毒的适应性免疫应答，这对于病毒清除是重要的，但也可以引起肺泡上皮和内皮的严重损伤。第三层是对感染病毒株的长期免疫的发展过程，伴随着浸润消退和受损肺组织再生，在此期间对继发性细菌感染的易感性增加。
[0167]
流感病毒构成了正粘病毒科家族五个属中的三个。甲型流感病毒和乙型流感病毒在季节性病毒流行期间共同传播，并且可能引起严重的流感感染。丙型流感病毒感染不太常见，但可能引起严重的流感传播并在局部流行。
[0168]
基于对这些病毒的抗体应答，甲型流感病毒可被细分为不同的血清类型或亚型。基于病毒表面上的两种蛋白质，甲型流感病毒被分成以下亚型：血凝素(h)和神经氨酸酶(n)。有18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型。(h1至h18以及n1至n11)在人类中已经确认的亚型是h1n1、h1n2、h2n2、h3n2、h5n1、h7n2、h7n3、h7n7、h9n2和h10n7。
[0169]
在任何实施方案中，需要治疗、预防或抑制炎症反应的流感感染是选自甲型流感
病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒感染的病毒感染。
[0170]
皮炎
[0171]
皮炎也称为湿疹，是一组引起皮肤炎症的疾病，包括特应性皮炎、变应性接触性皮炎、刺激性接触性皮炎和郁积性皮炎。尽管每种类型的皮炎具有不同的症状，但是它们都具有某些共同的征兆，包括皮肤发红、肿胀、瘙痒和有时渗血和结疤的皮肤损伤。
[0172]
特应性皮炎是一种慢性炎症，表现为红色、发痒的皮疹，最常见于皮肤弯曲的地方-肘部内侧、膝盖后侧和颈部前侧。皮疹抓伤处可渗液结痂。患有特应性皮炎的人可能经历症状缓解，然后突然发作。
[0173]
接触性皮炎是急性或慢性炎性皮肤病，可分为刺激性类型和过敏性类型。它发生在身体中与刺激皮肤或引起过敏反应的物质诸如毒常春藤、肥皂和精油接触的区域。红疹可能有灼热感、刺痛或瘙痒。可能出现水泡。
[0174]
二硝基氟苯(dnfb)是一种已知的可产生变应性接触性皮炎的刺激物。作为半抗原，它会诱导细胞介导的应答并引起角质形成细胞活化，产生化学介质诸如tnf-α、il-1β和前列腺素e2，引起皮肤树突细胞的迁移和成熟。然后这些细胞因子激活血管内皮细胞以表达粘附分子(即icam-1和p/e选择蛋白)，这些粘附分子引导t细胞从血液迁移到组织。
[0175]
半抗原诸如dnfb也激活肥大细胞和角质形成细胞以产生嗜中性粒细胞募集趋化因子诸如cxcl1和cxcl2，引起嗜中性粒细胞募集和先天性免疫应答。然后，这些树突细胞(即抗原呈递细胞)的活化引起细胞介导的免疫诱导和t细胞的浸润，引起ifn-γ和il-17的产生。treg细胞通过抑制白细胞流入和降解atp来调节接触性皮炎。上述过程还涉及b细胞及其产物(特别是igm抗体)，特别是在诱导期。
[0176]
皮炎治疗包括氢化可的松乳膏、凝胶或软膏、钙调磷酸酶抑制剂、缓解严重瘙痒的抗组胺剂和单克隆抗体治疗，包括用抑制il4/il-13、il-33和tslp活性的抗体治疗。设想本文所述的肽可与上文所述的或本领域已知的用于治疗皮炎的治疗方案联合施用于有需要的患者。
[0177]
类风湿性关节炎
[0178]
类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，其由于人的免疫系统攻击自身组织而引起关节疼痛和肿胀。类风湿性关节炎是一种慢性疾病，其特征在于关节中的炎症和疼痛症状。这些症状和征兆发生在称为发作或恶化的时期。其他时间段被称为缓解期，在此期间症状完全消失。虽然类风湿性关节炎症状可影响体内的几个器官，但类风湿性关节炎的关键症状包括关节疼痛、关节肿胀、关节僵硬和关节功能丧失和畸形。
[0179]
用于治疗类风湿性关节炎的药物分为两大类。第一类药物降低了攻击和损伤健康关节的免疫系统的活性。这些药物被称为缓解疾病的抗风湿药物(dmard)，包括甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、泼尼松和羟氯喹。第二类药物治疗疼痛和/或炎症，包括药物(如扑热息痛)和抗炎药(如布洛芬或塞莱昔布)。
[0180]
本发明的肽可单独使用或与已知的用于治疗类风湿性关节炎的药物联合使用。
[0181]
肽和合适的修饰物
[0182]
本发明确定了一大类肽在抑制、治疗或预防可能伴随或不伴随免疫应答的不适当炎症反应中的用途。在第一个实施方案中，该肽包含：
[0183]-氨基酸序列tvltvv(seq id no:1)或氨基酸序列llllltvltvv(seq id no:2)或
其功能变体；
[0184]
其中该肽由少于21个氨基酸残基组成，优选地由6至20个氨基酸残基组成，优选地由7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个残基组成。
[0185]
如本文所述，发明人认为具有氨基酸序列tvltvv或氨基酸序列llllltvltvv的肽对炎症症状具有抗炎作用并具有免疫抑制应答，如通过修饰巨噬细胞和树突细胞活化、细胞表面标记表达和促炎细胞因子谱的变化所示。在一些实施方案中，tvltvv和llllltvltvv也可各自称为“抗炎结构域”或“aid”。根据本发明的实施方案，该肽可由序列tvltvv或llllltvltvv组成，或者该肽可包含tvltvv或llllltvltvv，并且还包含另外的氨基酸残基，条件是肽的长度以氨基酸数目计小于21个氨基酸。
[0186]
如本文进一步所述，另外的氨基酸(即除tvltvv或llllltvltvv之外的氨基酸)可以是诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的残基。这些残基可以聚赖氨酸、聚精氨酸或聚组氨酸的形式提供。这些残基可位于tvltvv或llllltvltvv的n末端(或者位于tvltvv或llllltvltvv的c末端)。这些残基可有助于促进该肽在生物流体或组织或生物相容性制剂中溶解。此类肽的实例示于表a中。
[0187]
表a
[0188][0189][0190]
在第二个实施方案中，该肽包含：
[0191]-一种包含seq id no:1或seq id no:2的序列的肽；
[0192]-与seq id no:1或seq id no:2的序列相邻的一个或多个另外的氨基酸，条件是该一个或多个另外的氨基酸不限定与seq id no:1或seq id no:2的序列相邻的n末端位置处的序列mtpgtqspff或与seq id no:1或seq id no:2的序列相邻的c末端位置处的序列tgsghasstp，
[0193]
其中该肽包含至少12个氨基酸残基，优选地包含20至100个残基。
[0194]
根据本实施方案，该肽通常不由序列tvltvv或llllltvltvv组成。相反，该肽包含tvltvv或llllltvltvv，并且还包含除了那些限定与seq id no:1或2相邻的n末端位置处的序列mtpgtqspff或与seq id no:1或2相邻的c末端位置处的序列tgsghasstp以外的另外的氨基酸残基。
[0195]
因此，这种肽的最小长度可以是12个氨基酸残基，尽管该肽可以更长并且具有至少13个、至少14个、至少15个氨基酸残基或至少20个、30个、40个、50个或多达1000个残基的
长度。另外的氨基酸(即除了tvltvv或llllltvltvv之外的氨基酸)可以是阳离子氨基酸残基，诸如上文所述的赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
[0196]
任选地，该肽还可以包含“溶解结构域”或促进该肽在生物流体、组织等中溶解的修饰物。这种经改善的溶解作用可以使肽在生物流体、组织或细胞中的数量更多，从而提高肽的抗炎和/或免疫抑制作用。发明人通过利用聚阳离子氨基酸序列已经建立了此类作用。如本文进一步所述，溶解作用也可包括不同长度的聚乙二醇(peg)。
[0197]
此外，该肽还可以包含本文所述的标记物形式的分子(诸如生物素或缀合至该肽以帮助其检测的分子)。
[0198]
包含用于提高溶解度的修饰物的肽或用于使得能够检测该肽的部分的实例示于表b中。
[0199]
表b
[0200][0201][0202]
在另一个实施方案中，该肽包含：
[0203]-一种抗炎的肽，该抗炎的肽包含以下各项或由以下各项组成：seq id nos:1和2中任一项的序列(优选地为seq id no:3或30)或其功能变体或片段；
[0204]-任选地，用于促进该肽在生物流体、组织或制剂中溶解的修饰物；和/或荧光标记物。
[0205]
根据本实施方案，该肽通常不由tvltvv或llllltvltvv组成。相反，该肽包含
tvltvv或llllltvltvv，并且还包含另外的氨基酸残基以提供长度通常大于20个氨基酸的肽。其他另外的氨基酸可包括序列mtpgtqspff和/或tgsghasstp(或可另选地包括序列tpgtqspff)。
[0206]
因此，在一个实例中，该肽包含seq id no:3的序列(mtpgtqspffllllltvltvv)或由其组成，或包含seq id no:30的序列(tpgtqspffllllltvltvv)或由其组成，并包含其功能变体和片段。
[0207]
该肽可具有多达1000个残基或更长的长度。在本实施方案中，另外的氨基酸(即除了tvltvv或llllltvltvv之外的氨基酸)可以是阳离子氨基酸残基，诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸。这些氨基酸可形成或包含在如上所述的溶解结构域中促进该肽在生物流体、组织或制剂中溶解。如本文进一步描述的，溶解作用可包括不同长度的聚乙二醇(peg)。该肽还可包含与其缀合以帮助检测的荧光标记物形式的分子。这类肽的实例示于表c中。
[0208]
表c
[0209]
肽序列seq id no:44kkkk-seq id no:64seq id no:45peg-seq id no:64seq id no:46kkkk-peg-seq id no:64seq id no:47af594-seq id no:64seq id no:48af594-peg-seq id no:64seq id no:49af594-kkkk-peg-seq id no:64seq id no:6kkkk-mtpgtqspffllllltvltvvseq id no:9peg-mtpgtqspffllllltvltvvseq id no:12kkkk-peg-mtpgtqspffllllltvltvvseq id no:15af594-mtpgtqspffllllltvltvvseq id no:18af594-peg-mtpgtqspffllllltvltvvseq id no:21af594-kkkk-peg-mtpgtqspffllllltvltvv
[0210]
在一个实施方案中，根据本发明的肽可包含含有不同长度的甘氨酸或丝氨酸重复序列的接头。本发明的肽和接头可直接或间接地连接到该肽的n末端区域或c末端区域。优选地，该接头位于肽的n末端。在一个实施方案中，该接头包含序列ggg，并且根据本发明的肽包含以下各项或由以下各项组成：kkkkgggmtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:22)或kkkkgggtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:23)，或其功能变体。
[0211]
本文所用的术语“肽”是指由d-或l-氨基酸的单链或d-和l-氨基酸的混合物通过肽键连接而组成的化合物。通常，肽含有至少两个氨基酸残基，长度小于约50个氨基酸。
[0212]
如本文所用的术语“蛋白质”是指由通过肽键连接的线性排列的氨基酸组成的化合物，但与肽相反，具有明确的三级结构。与肽相反，蛋白质通常由50个或更多个氨基酸的链组成。
[0213]
本文所用的“多肽”是指至少两个氨基酸残基的聚合物，其含有一个或多个肽键。“多肽”包含肽和蛋白质，无论多肽是否具有明确的构象。
[0214]
应当理解，在任何实施方案中，本发明的抗炎的肽可以序列tvltvv或llllltvltvv的“功能变体”、“生物活性片段”或“类似物”的形式提供。变体、片段或类似物是能够复制本
文实施例中所示肽tvltvv或llllltvltvv所例举的部分或全部抗炎作用和/或免疫抑制作用的化合物。本发明的肽的功能变体或类似物通常将表现出与肽的氨基酸序列中的全部或部分序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、70％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸同一性。用于在dnfb和咪喹莫特模型中测定本文所述的生物活性片段和类似物治疗炎性病状的能力的方法是本领域技术人员已知的，并且包括本文所述的那些方法。
[0215]
在一个实施方案中，形成抗炎的肽的seq id no:1的功能变体可如表d中所述。
[0216]
表d
[0217]
肽序列seq id no:50tvltaaseq id no:51tlvtllseq id no:52taitiiseq id no:53svltvvseq id no:54svlsvvseq id no:55svltvvseq id no:56tvltvv
[0218]
在一个实施方案中，形成抗炎的肽的seq id no:2的功能变体可如表e中所述。
[0219]
表e
[0220]
肽序列seq id no:57vvvvvtvvtvvseq id no:58aaaaatvatvvseq id no:59iiiiitvitvvseq id no:60llllltlltllseq id no:61lllllsvltvvseq id no:62lllllsvlsvvseq id no:63llllltvltvv
[0221]
在另一个实施方案中，根据本发明的肽可包含本文所述的任何肽的反向-翻转肽。在此类序列中，d-氨基酸代表天然l-氨基酸的构象镜像。
[0222]
本发明的肽包含任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包含天然存在的氨基酸、编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的氨基酸、衍生的或设计的氨基酸、氨基酸类似物、肽模拟物和缩肽，以及具有修饰的、环状的、双环的、缩环的或缩双环的肽主链的多肽。它们包含单链蛋白质以及多聚体。它们还包含缀合蛋白、融合蛋白，包括但不限于谷胱甘肽s-转移酶(gst)融合蛋白、具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白、具有或不具有n末端甲硫氨酸残基的融合蛋白、聚乙二醇化蛋白和免疫标记蛋白，或his标记蛋白。本发明的多肽还包含天然存在的蛋白质变体，其中此类变体与天然存在的蛋白质以及来自不同物种的相应同源物同源或基本上相似。与本发明的多肽相比，多肽序列的变体包含插入、添加、缺失或取代。本发明的多肽还包含肽适体。
[0223]
可使用蛋白质工程来改善或改变本发明治疗性肽的特性。本领域技术人员已知的
重组dna技术可用于产生新的突变蛋白，这些突变蛋白包含单个或多个氨基酸取代、缺失、添加或融合蛋白。此类修饰的多肽可表现出所需的性质，诸如增强的活性或增加的稳定性。
[0224]
例如，本文的肽可包含一个或多个带正电荷的氨基酸。带正电荷的基团包含至少一个带正电荷的氨基酸，诸如精氨酸(r)、赖氨酸(k)或组氨酸(h)。此类实例包括kkkk-tvltvv(seq id no:4)、kkkk-llllltvltvv(seq id no:5)或kkkk-mtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:6)，或其功能性变体。
[0225]
在一个实施方案中，根据本发明的肽可包含增溶剂。本发明的肽和增溶剂可直接或间接连接。增溶剂的实例是聚乙烯(peg)，在本实施方案中，本发明的肽可以是聚乙二醇化的肽。此类肽的实例包括peg-tvltvv(seq id no:7)、peg-llllltvltvv(seq id no:8)、peg-mtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:9)、kkkk-peg-tvltvv(seq id no:10)、kkkk-peg-llllltvltvv(seq id no:11)、kkkk-peg-mtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:12)，或其功能变体。
[0226]
在一个实施方案中，peg可包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多个乙二醇单元。或者，peg可不包含乙二醇单元。
[0227]
在一个实施方案中，根据本发明的肽可包含荧光标签或标记物。本发明的肽和荧光标签或标记物可直接或间接连接，并且可位于肽的n末端。在一个实施方案中，荧光标签或标记物是gfp、yfp、bfp、cfp、y-fast、af594、mcherry和dsred。这类肽的实例包括af594-tvltvv(seq id no:13)或af594-llllltvltvv(seq id no:14)、af594-mtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:15)、af594-peg-tvltvv(seq id no:16)、af594-peg-llllltvltvv(seq id no:17)、af594-peg-mtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:18)、af594-kkkk-peg-tvltvv(seq id no:19)、af594-kkkk-peg-llllltvltvv(seq id no:20)、af594-kkkk-peg-mtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:21)，或其功能变体。
[0228]
在一个实施方案中，根据本发明的肽可包含含有不同长度的甘氨酸或丝氨酸重复序列的接头。本发明的肽和接头可直接或间接连接。优选地，该接头位于肽的n末端。在一个实施方案中，该接头包含序列ggg，并且根据本发明的肽包含以下各项或由以下各项组成：kkkkgggmtpgtqspffllllltvltvv(seq id no:22)或其功能变体(诸如具有相同修饰物和接头的tpgtqspffllllltvltvv，即seq id no:23：kkkkgggpgtqspffllllltvltvv)。
[0229]
此外，至少在某些纯化和储存条件下，这些蛋白质可以更高的产率纯化并显示出比相应的天然多肽更好的溶解性。对于许多蛋白，包括膜结合蛋白的胞外域或分泌蛋白的成熟形式，本领域已知可从n末端或c末端缺失一个或多个氨基酸而基本上不丧失生物学功能。
[0230]
然而，即使从蛋白质的n末端缺失一个或多个氨基酸引起该蛋白质的一种或多种生物学功能的修饰或丧失，其他生物学活性仍可得以保留。因此，当从n末端除去完整或成
熟蛋白质的少于大多数残基时，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整或成熟蛋白质的抗体的能力通常将得以保留。缺乏完整蛋白质n末端残基的特定多肽是否保留其所需活性可通过本领域已知的常规方法来确定。
[0231]
因此，本发明还提供了具有从分子氨基酸序列的氨基末端缺失的一个或多个残基的多肽。类似地，已知许多生物学功能性c末端缺失突变体的实例。
[0232]
然而，即使从蛋白质的c末端缺失一个或多个氨基酸引起该蛋白质的一种或多种生物学功能的修饰或丧失，其他生物学活性仍可得以保留。因此，当从c末端除去完整或成熟蛋白质的少于大多数残基时，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整或成熟蛋白质的抗体的能力通常将被保留。缺乏完整蛋白质c末端残基的特定多肽是否保留这种生物活性可通过本领域已知的常规方法来确定。
[0233]
除了上述蛋白质的末端缺失形式之外，本领域普通技术人员还将认识到，本发明治疗性多肽中的一些氨基酸序列可在不对蛋白质结构或功能产生显著影响的情况下进行改变。如果考虑到序列的这种差异，本领域技术人员将知道如何确定哪些结构域是保持蛋白质功能的关键区域。
[0234]
由于这类突变体所包含的缺失、插入、倒位、重复和类型取代是根据本领域已知的一般规则选择的，因此其对活性几乎没有影响。例如，在bowie et al.,(1990)science247:1306-1310中提供了关于如何进行表型沉默氨基酸取代的指南，书中作者指出有两大方法用于研究氨基酸序列对改变的耐受性。第一种方法依赖于进化过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。
[0235]
第二种方法使用遗传工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸变化，并选择或筛选以鉴定保持功能性的序列。这些研究报道了蛋白质对氨基酸取代有惊人的耐受性。已知某些氨基酸可能会在蛋白质的某个位置上产生变化。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链通常很少有特征是保守的。
[0236]
通常认为保守取代是脂肪氨基酸ala(a)、val(v)、leu(l)和ile(i)中一个氨基酸取代另一个氨基酸的取代；羟基残基ser(s)和thr(t)的交换，酸性残基asp(d)和glu(e)的交换，酰胺残基asn(n)和gln(q)之间的取代，碱性残基lys(k)和arg(r)的交换，以及芳族残基phe(f)和tyr(y)之间的取代。因此，多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代的片段、衍生物或类似物；此类取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基；(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基的片段、衍生物或类似物；(iii)其中成熟多肽与另一种化合物融合的片段、衍生物或类似物，诸如延长多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸与上述形式的多肽融合的片段、衍生物或类似物，诸如igg fc融合区肽、前导序列或分泌序列、用于纯化上述形式多肽的序列或前蛋白序列。此类片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员根据本文教导的范围内。
[0237]
因此，本发明的治疗性多肽可包含一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，它们来自自然突变或人工操作。如上所述，这些改变可以是微小的，诸如保守氨基酸取代，其不会显著影响蛋白质的折叠或活性。例如，该一个或多个氨基酸取代、缺失或添加将不影响本文所述的肽抑制、治疗或预防不适当的炎症反应的能力。
[0238]
保守氨基酸取代包含phe、trp和tyr的芳族取代；leu、iso和val的疏水取代；glu和
asp的极性取代；arg、lys和his的碱性取代；asp和glu的酸性取代；以及ala、ser、thr、met和gly的小氨基酸取代。
[0239]
对本发明治疗性多肽的功能至关重要的氨基酸可通过本领域已知的方法鉴定，诸如通过定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定。后一种方法引入了单一丙氨酸突变。然后测试所得突变分子的生物活性，诸如受体结合活性，或体内增殖活性或体外增殖活性。
[0240]
此外，用其他带电或中性氨基酸取代带电氨基酸，这可产生具有高度期望的改善特性的蛋白质，诸如聚集较少。蛋白质聚集不仅会降低活性，而且在制备药物制剂时也会产生问题，例如因为聚集体可能是免疫原性的。
[0241]
替换氨基酸也可改变配体与细胞表面受体结合的选择性。对配体-受体结合极其重要的位点也可通过结构分析诸如结晶、核磁共振或光亲和标记来确定。
[0242]
本发明还提供了编码本文定义的蛋白质的包含dna或rna序列的核酸或其片段，包含具有开放阅读框的核酸或其片段，该开放阅读框编码治疗性多肽，并且在适当条件下能够被表达为本发明的治疗性多肽之一。术语“核酸”还包含基因组dna、cdna、mrna、剪接变体、反义rna、rnai、包含一种或多种单核苷酸多态性(snp)的dna，以及包含本发明核酸序列的载体。该术语还包含与编码治疗性蛋白质的核酸同源或基本上相似或相同的核酸。因此，本发明提供了编码本发明蛋白质及其同源物的基因。
[0243]
本发明的多核苷酸或核酸是指任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物或衍生物。例如，核酸可以是天然存在的dna或rna，或者可以是本领域已知的合成类似物。本发明的多核苷酸还包含基因组dna、基因片段、外显子、内含子、调节序列或调节元素，诸如启动子、增强子、起始和终止区、其他控制区、表达调节因子和表达控制；包含一种或多种单核苷酸多态性(snp)的dna、等位基因变体、任何序列的分离dna，和cdna；mrna、trna、rrna、核酶、剪接变体、反义rna、反义缀合物、rnai和任何序列的分离rna；重组多核苷酸、异源多核苷酸、分支多核苷酸、标记的多核苷酸、杂交dna/rna、多核苷酸构建体、包含本发明核酸的载体、核酸探针、引物和引物对。
[0244]
本发明的多核苷酸包含在主链、糖或杂环碱基中具有变化的经修饰的核酸分子，诸如甲基化的核酸分子、肽核酸和核酸分子类似物，如果它们在测定条件下显示出优异的稳定性和/或结合亲和力，则它们可作为例如探针。多核苷酸还包含单链、双链和三螺旋分子，它们是dna、rna或杂交dna/rna，并且可编码全长基因或其生物活性片段。
[0245]
本发明的多核苷酸包含单核苷酸多态性。单核苷酸多态性(snp)经常出现在真核基因组中。从一个物种个体测定的核苷酸序列可能不同于群体中存在的其他等位基因形式。本发明包含这样的snp。本发明的多核苷酸包含编码本说明书中所述多肽的变体的那些多核苷酸。因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸编码与本文所述的多肽相比包含插入、缺失或取代的变体多肽。保守氨基酸取代包含丝氨酸/苏氨酸、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、天冬酰胺/谷氨酰胺、谷氨酸/天冬氨酸等。
[0246]
在一些实施方案中，本文所述的蛋白质或其功能衍生物可被修饰以增强施用的适合性，即通过将任何类型的分子共价连接至组合物，使得共价连接不会影响组合物的活性。例如，但不作为限制，衍生物包含已经通过，尤其通过糖基化、脂质化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质连接等进行了修饰的组合物。许多化学修饰中的任何一种修饰可通过已知技术进行，
包括但不限于特定化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一个或多个非典型的氨基酸。
[0247]
在另外的实施方案中，可修饰本文所述的蛋白质或功能衍生物以添加效应物部分，诸如化学接头；可检测部分，诸如荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料和化学发光部分；或功能部分，诸如链霉亲和素、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性材料。
[0248]
在另一个实施方案中，本文所述的肽或功能衍生物可被修饰以添加金属离子标记物，诸如钆特酸，其是大环结构的基于钆的mri造影剂(gbca)(包含作为螯合剂的有机酸dota和钆(gd3 ))并以葡甲胺盐(钆特酸葡甲胺)的形式使用。这类标记物在本文中也描述为(gd)dota。
[0249]
在又一个实施方案中，本文所述的肽可含有氨基酸残基的合成变体，其具有用于观察和表征蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)的光反应性。非限制性实例是光致亮氨酸，其是用作其天然类似物的亮氨酸氨基酸的合成衍生物并且特征在于具有光反应性。本领域的技术人员将理解，当含有这种氨基酸的蛋白质在与另一种蛋白质相互作用的同时用紫外光照射时，由这两种蛋白质形成的复合物保持附着并可以被分离。
[0250]
在某些实施方案中，本文所述的任何肽可包含与n末端区域或c末端区域缀合的细胞穿透肽(cpp)以促进或帮助肽进入细胞。cpp通常是长度为约7至30个氨基酸残基的两亲性阳离子肽，有助于分子穿过细胞膜的快速易位。细胞穿透肽的非限制性实例包括tat和基于tat的肽，但本领域技术人员将认为存在许多可根据本发明使用的cpp。此类cpp的实例描述于文献中，例如habault和pocure，(2019年)《分子》，第24卷：第927页；boerrli等人，(2018年)《分子》，第23卷：第295页中所描述的内容，在此将其内容以引用方式并入本文。
[0251]
在某些实施方案中，本文所述的任何肽可在n末端区域或c末端区域脂质化，例如以促进或帮助本发明的肽进入细胞。
[0252]
编码本发明蛋白质的核酸可以是cdna或基因组dna或其片段。术语“基因”是指编码本发明特定蛋白质和多肽的开放阅读框、内含子，以及参与表达调节的相邻5'和3'非编码核苷酸序列，其长度超出编码区约20kb，但可能在任一方向上更远。可将基因导入合适的载体中用于染色体外维持或整合入宿主基因组。分离并获得基本纯的本发明多核苷酸，通常不同于完整染色体。通常，获得的dna基本上不含不包含本发明基因的序列或其片段的其他核酸序列，这些核酸序列一般至少约50％是纯的，通常至少约90％是纯的，并且通常是“重组的”，即dna两侧有一个或多个核苷酸，在天然存在的染色体上通常不与这些核苷酸相关。
[0253]
本发明提供了包含本发明的治疗性多核苷酸的质粒，即，可从一种生物体转移至另一种生物体的小型且独立复制的染色体外细胞质dna片段。质粒可被整合到宿主的基因组中或可以保持独立。人工构建的质粒通常用作克隆载体。本发明还提供了载体，即，可用于将dna序列从一种生物体转移至另一种生物体的质粒。
[0254]
表达载体可用于表达本发明的治疗性基因产物，并且通常包含限制性位点以提供编码异源蛋白或rna分子的核酸序列的插入。
[0255]
表达载体可用于将基因导入细胞。此类载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点以提供核酸序列的插入。可制备包含转录起始区、本发明基因或其片段和转录终止区的转录盒。转录盒可被导入多种载体，例如质粒；逆转录病毒，例如慢病毒；腺病
毒；腺伴随病毒等，其中载体能够在细胞中瞬时维持或稳定维持通常至少约一天的时间，更通常维持至少约数天至数周的时间。
[0256]
抗炎剂
[0257]
在本发明的一个方面，提供了一种包含本文所述的任何肽和用于预防或治疗炎症反应的另外的抗炎剂的组合物。本领域技术人员将能够容易地鉴定可与本文所述肽联合使用的不同类型的抗炎剂。这类抗炎剂的非限制性实例包括非选择性非甾体抗炎药物(nsaid)、选择性nsaid、皮质类固醇、表现出抗炎性质(例如通过抑制促炎分子活性)的抗体和技术人员已知的其他抗炎剂。
[0258]
非选择性nsaid的实例包括双氯芬酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲芬那酸、萘普生、吡罗昔康和舒林酸。选择性nsaid的实例包括塞莱昔布、艾托考昔、美洛昔康和塞莱昔布。
[0259]
在优选的实施方案中，提供了一种包含本文所述的任何肽和用于预防或治疗炎症反应的皮质类固醇的组合物。
[0260]
皮质类固醇是合成药物，其非常类似于皮质醇并且通过减少炎症发生和降低免疫系统活性而起作用。它们用于治疗多种炎性疾病和病状，包括银屑病、哮喘、炎性病状、慢性阻塞性肺病(copd)、花粉热、荨麻疹、湿疹、血管炎(血管炎症)和肌炎(肌肉炎症)、关节炎、炎性肠病(包括克罗恩病、类风湿性关节炎、狼疮、修格伦综合征和痛风)。皮质类固醇药物的实例包括如本文所用的曲安西龙、地塞米松、莫米松、可妥龙、曲安奈德、可的松、泼尼松、甲泼尼龙和二丙酸倍他米松。
[0261]
技术人员将理解，用于本发明的皮质类固醇可以下列形式之一存在：
[0262]
片剂、糖浆和液体-诸如泼尼松龙；
[0263]
吸入器和鼻喷雾剂-诸如倍氯米松和氟替卡松；
[0264]
注射剂(肌内、静脉内、关节内)-诸如甲泼尼龙；
[0265]
眼用药剂-诸如滴眼剂；以及
[0266]
乳膏、洗液和凝胶-诸如氢化可的松皮肤乳膏。
[0267]
本文所述或本领域已知的皮质类固醇是其施用的合适剂量。
[0268]
在一个实施方案中，皮质类固醇在本发明中的用途在治疗或预防炎症反应中起作用。因此，在本实施方案中，本文所述的肽与皮质类固醇联合使用可有效地治疗或预防炎症反应。在一个实施方案中，该作用可大于单独的肽所发挥的作用，并且在一些实施方案中，该作用可以是协同的。
[0269]
皮质类固醇可与本发明的肽同时施用，包括以相同或不同的制剂施用。或者，皮质类固醇和肽可在不同时间段以不同剂型(制剂)施用。当以不同制剂提供时，肽和皮质类固醇可通过相同或不同的施用途径施用。
[0270]
单克隆抗体
[0271]
本发明还提供了包含本文所述的任何肽和用于预防或治疗炎症反应的抗原结合蛋白的组合物。优选地，抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。通常，抗原结合蛋白是抗体，例如单克隆抗体。
[0272]
在某些实施方案中，用于抑制促炎性分子活性的抗原结合蛋白(例如单克隆抗体)与抗炎性分子结合，从而抑制该分子促进炎症反应的活性。抗原结合蛋白可以与促炎性分
子的受体结合，从而抑制促炎性分子的活性。根据本发明使用的合适的抗原结合蛋白或单克隆抗体的非限制性实例包括那些能够抑制促炎性分子活性的蛋白或抗体，该促炎性分子包括白介素-17(il-17)、白介素-12(il-12)、白介素-6(il-6)、白介素-22(il-22)、白介素-23(il-23)、白介素-36(il-36)和肿瘤坏死因子α(tnfα)。此类抗原结合蛋白或单克隆抗体的实例包括布罗达单抗、依奇珠单抗或苏金单抗(用于抑制il-17)、妥珠单抗或司妥昔单抗(用于抑制il-6)、古塞库单抗或替拉珠单抗或米吉珠单抗或布雷库单抗或瑞莎珠单抗或乌司奴单抗(用于抑制il-23)、非扎奴单抗(用于抑制il-22)、依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗(用于抑制tnfα的活性)。
[0273]
用于产生抗体的方法是本领域已知的和/或描述于harlow和lane(编辑者)《抗体：冷泉港实验室手册》(1988年)。通常，在此类方法中，向非人动物(例如小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪)施用任选地与任何合适的或所需的载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制的免疫原性片段或其表位或表达和展示该片段的细胞(即，免疫原)。免疫原可通过鼻内、肌内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或通过其他已知途径施用。
[0274]
多克隆抗体的产生可通过在免疫后的多个时间点采集免疫动物的血液样品来监测。如果需要达到所需的抗体滴度，可进行一次或多次进一步的免疫方案。重复强化和滴定过程，直到达到合适的滴度。当获得所需免疫原性水平时，将免疫动物放血，分离并储存血清，以及/或者使用动物产生单克隆抗体(mab)。
[0275]
单克隆抗体是本发明所考虑的抗体的一种示例性形式。术语“单克隆抗体”或“mab”是指能够结合相同抗原(例如，结合抗原内的相同表位)的同源抗体群。该术语不旨在限制抗体来源或其制备方式。
[0276]
根据本发明使用的合适的抗原结合蛋白可以是合成抗体。例如，抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、同人源化抗体、灵长类源化抗体或去免疫化抗体。
[0277]
抗原结合蛋白或抗体(诸如单克隆抗体)可以下列形式存在：
[0278]
(i)单链fv片段(scfv)；
[0279]
(ii)二聚体scfv(di-scfv)；
[0280]
(iii)(i)或(ii)中的一种，其连接至抗体恒定区、fc或重链恒定结构域ch2和/或ch3；或
[0281]
(iv)(i)或(ii)中的一种，其与结合免疫效应细胞的蛋白质连接。
[0282]
此外，如本文所述，抗原结合位点或抗体可以下列形式存在：
[0283]
(i)双链抗体；
[0284]
(ii)三链抗体；
[0285]
(iii)四链抗体；
[0286]
(iv)fab；
[0287]
(v)f(ab')2；
[0288]
(vi)fv；
[0289]
(vii)(i)至(vi)中的一种，其连接至抗体恒定区、fc或重链恒定结构域ch2和/或ch3；或
[0290]
(viii)(i)至(vi)中的一种，其与结合免疫效应细胞的蛋白质连接。
[0291]
对于单克隆抗体的产生，可使用许多已知技术中的任何一种技术，例如，在
us4196265中举例说明的方法或上文harlow和lane(1988年)所提到的方法。
[0292]
例如，在足以刺激抗体产生细胞的条件下用免疫原免疫合适的动物。啮齿类动物诸如兔、小鼠和大鼠是示例性动物。也可使用经基因工程改造以表达人抗体的小鼠(例如不表达鼠抗体的小鼠)来产生本发明的抗体(例如，如wo2002/066630中所述)。
[0293]
免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，特别是b淋巴细胞(b细胞)，用于单克隆抗体产生方案。这些细胞可从脾、扁桃体或淋巴结的活组织检查中获得或从外周血样品中获得。然后将来自免疫动物的b细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，该细胞通常来源于与用免疫原免疫的动物相同的物种。
[0294]
通过在选择性培养基中培养来扩增杂交体，该选择性培养基包含阻断组织培养基中核苷酸从头合成的药剂。示例性药剂是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。
[0295]
对扩增后的杂交瘤进行抗体特异性和/或滴度的功能性选择，诸如通过流式细胞术和/或免疫组织化学和/或免疫测定(例如，放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、斑点免疫测定等)。
[0296]
或者，abl-myc技术(neoclone，madison wi 53713，美国)用于产生分泌单克隆抗体的细胞系(例如，如largaespada等人，《j.immunol.methods》，第197卷：第85-95页(1996年)中所述)。
[0297]
抗体还可通过筛选展示文库(例如噬菌体展示文库)来产生或分离，例如，如us6300064和/或us5885793中所述。例如，发明人从噬菌体展示文库中分离出了完全人抗体。
[0298]
如本文所述的抗原结合蛋白或抗体的合适剂量将根据特定抗原结合位点、待治疗的病状和/或正在治疗中的受试者而变化。熟练的医师有能力确定合适的剂量，例如通过从次佳剂量开始并逐渐改变剂量以确定最佳剂量或有用剂量。或者，为了确定治疗/预防的合适剂量，使用来自细胞培养试验或动物研究的数据，其中合适剂量在包括活性化合物ed
50
的循环浓度范围内并且具有很少的毒性或没有毒性。剂量可在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。治疗/预防有效剂量可根据细胞培养试验初步估计。可在动物模型中配制剂量以达到包括细胞培养中测定的ic
50
(即达到症状的半最大抑制率的化合物的浓度或量)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人体内的有用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱法测量。
[0299]
药物组合物和施用途径
[0300]
本文提供了一种包含药学有效量的本文所述肽的药物组合物。在另外的实施方案中，提供了一种包含药学上可接受的盐的药物组合物。
[0301]
术语“药学上可接受的盐”还指具有酸性官能团诸如羧酸官能团的本发明组合物的盐，以及碱。作为非限制性实例，药学上可接受的盐包括硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯盐、溴盐、碘盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、扑酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-1,
4-二羧酸盐、己炔-1,4-二羧酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟乙磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐和酒石酸盐。
[0302]
此外，本文所述的肽或功能变体可作为包含药学上可接受的载体或媒介物的组合物的组分施用于受试者。此类组合物可任选地包含合适量的药学上可接受的赋形剂以便提供适当的施用形式。
[0303]
药物赋形剂可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些液体，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物赋形剂可以是，例如，盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等。此外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。
[0304]
在一个实施方案中，当向受试者施用时，药学上可接受的赋形剂是无菌的。当静脉内给予本文所述的任何药剂时，水是有用的赋形剂。盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体赋形剂，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本文所述的任何药剂也可包含少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。
[0305]
在一个实施方案中，本文所述的肽或功能变体可采用溶液、悬浮液、乳液、滴剂、片剂、丸剂、微丸、胶囊、含有液体、粉末、持续释放制剂、栓剂、乳液、气溶胶、喷雾剂、悬浮液、纳米颗粒或微针的胶囊或适合使用的任何其他形式。在一个实施方案中，组合物以胶囊形式存在。其他合适的药物赋形剂实例描述于remington的《药物科学》第1447-1676页(alfonso r.gennaro编辑，第19版，1995年)，在此将其内容以引用方式并入本文。
[0306]
必要时，本文所述的肽或功能变体还包含增溶剂。同样，可用本领域已知的合适的媒介物或递送装置递送药剂。
[0307]
本文概述的肽可在单一递送媒介物或递送装置中共同递送。用于施用的组合物可任选地包含局部麻醉剂(诸如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。
[0308]
包含本文所述的肽或功能变体或本文所述的皮质类固醇或单克隆抗体的制剂可方便地以单位剂型存在并且可通过本领域熟知的任何方法制备。此类方法通常包括将治疗剂与载体结合的步骤，该载体构成一种或多种辅助成分。通常，通过将治疗剂与液体载体、细碎固体载体或两者均匀且紧密地结合，接着如果需要，将产物成形为所需制剂的剂型(例如湿法制粒或干法制粒、粉末共混物等，随后使用本领域已知的常规方法压片)来制备制剂。
[0309]
在一个实施方案中，本文所述的肽或功能变体或本文所述的皮质类固醇或单克隆抗体根据常规方法配制为适于本文所述施用模式的组合物。在一个方面，药物组合物被配制用于施用至呼吸道、皮肤或胃肠道。因此，用于施用至呼吸道的包含本文所述肽的药物组合物可配制为可吸入物质，诸如本领域常见的和本文所述的物质。在另一个实施方案中，用于施用至胃肠道的包含本文所述肽的药物组合物可用肠溶衣配制，诸如本领域常见的和本文所述的物质。在又一个实施方案中，用于施用至皮肤的包含本文所述肽的药物组合物包
含允许组合物吸收进入有需要的个体的真皮层的基质。
[0310]
在一个实施方案中，药物组合物可以单剂量或多剂量施用。药物组合物可在24小时的时间段内施用一至三次，或在7天或更长的时间段内每天施用。施用频率和施用时间可如实施例中所述。
[0311]
施用途径包括，例如：皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、淋巴结内、气管内、关节内、阴道内、经皮、直肠、经吸入或局部施用，特别是施用至耳、鼻、眼或皮肤。在一些实施方案中，该施用通过口服或通过肠胃外注射实现。施用方式可由医师判断，部分取决于医学病状出现的部位。在大多数情况下，施用使得本文所述的任何药剂释放到血流中。
[0312]
本文公开的肽可以约0.2mg/天至约2400mg/天的总量给予。该剂量可在一天内分成两个或三个剂量给予或以单次日剂量给予。本文公开的方法所考虑的治疗剂的总日剂量的具体量包括约0.2mg、约0.5mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约105mg、约110mg、约115mg、约120mg、约125mg、约130mg、约135mg、约140mg、约145mg、约150mg、约200mg、约250mg、约267mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约534mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg或更高。
[0313]
在一些实施方案中，患者或个体是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊或非人灵长类动物，诸如猴子、黑猩猩或狒狒。在其他实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物，例如斑马鱼。在一些实施方案中，受试者和/或动物可包含荧光标记的细胞(具有例如gfp)。在一些实施方案中，受试者和/或动物是包含荧光细胞的转基因动物。
[0314]
在一些实施方案中，患者或个体是人。在一些实施方案中，人是儿童。在其他实施方案中，人是成年人。在其他实施方案中，人是老年人。在其他实施方案中，人可被称为患者。
[0315]
在某些实施方案中，人的年龄范围为约0个月至约6个月、约6个月至约12个月、约6个月至约18个月、约18个月至约36个月、约1岁至约5岁、约5岁至约10岁、约10岁至约15岁、约15岁至约20岁、约20岁至约25岁、约25岁至约30岁、约30岁至约35岁、约35岁至约40岁、约40岁至约45岁、约45岁至约50岁、约50岁至约55岁、约55岁至约60岁、约60岁至约65岁、约65岁至约70岁、约70岁至约75岁、约75岁至约80岁、约80岁至约85岁、约85岁至约90岁、约90岁至约95岁或约95岁至约100岁。
[0316]
在其他实施方案中，受试者是非人动物，因此本发明涉及兽医用途。在一个具体的实施方案中，非人动物是家庭宠物。在另一个具体的实施方案中，非人动物是家畜动物。
[0317]
肠内施用
[0318]
在一个实施方案中，提供了一种用于治疗或预防个体胃肠道中不适当炎症反应的方法，该方法包括向需要治疗的个体施用包含药学上有效量的本文所述的肽或其药学上可接受的盐的药物组合物，从而治疗或预防个体胃肠道中不适当的炎症反应。
[0319]
对治疗的阳性反应可以是预防或减轻炎性肠症状的恶化，例如降低炎性红斑或细胞因子/趋化因子表达水平，减少溃疡、肠不适和疼痛。
[0320]
本文提供的组合物可通过对药物制剂领域技术人员显而易见的多种方法配制。上述各种释放特性可以各种不同的方式实现。合适的制剂包括例如片剂、胶囊、压制包衣制剂和其他容易给予的制剂。
[0321]
合适的药物制剂可含有例如约0.1％至约99.9％的活性成分，优选地可含有约1％至约60％的活性成分。用于经肠施用或肠胃外施用的联合疗法的药物制剂是例如单位剂型的那些药物制剂，诸如糖衣片、片剂、胶囊或栓剂、或安瓿剂。如果没有另外说明，这些药物制剂可以本身已知的方式制备，例如通过常规的混合、制粒、包糖衣、溶解或冻干方法制备。应当理解，包含在每种剂型的单个剂量中的组合组分的单位含量本身不需要构成有效量，因为通过施用多个剂量单位就可以达到必需的有效量。
[0322]
呼吸道施用
[0323]
在一个实施方案中，提供了一种用于治疗或预防个体呼吸道中不适当炎症反应的方法，该方法包括向需要治疗的个体施用包含药学上有效量的本文所述的肽或其药学上可接受的盐的药物组合物，从而治疗或预防个体呼吸道中不适当的炎症反应。
[0324]
术语“呼吸道的”是指通过包括鼻、咽喉、喉、气管、支气管和肺的身体系统将氧气吸入体内并排出二氧化碳的过程。
[0325]
术语“呼吸道疾病”或“呼吸道病状”是指涉及炎症并影响包括上呼吸道(包括鼻腔、咽和喉)和下呼吸道(包括气管、支气管和肺)的呼吸系统的组成部分的几种疾病中的任一种疾病。
[0326]
呼吸道疾病的症状可包括咳嗽、产生过多痰液、气促感或胸部紧迫感，伴有可听见的喘息。锻炼能力可能相当有限。这些病状中的每一种所带来的影响还可通过误工/误学的天数、睡眠紊乱、对支气管扩张药物的需求、对糖皮质激素(包括口服糖皮质激素)的需求来测量。
[0327]
呼吸道疾病的存在、改善、治疗或预防可通过受试者的任何临床或生化相关方法或其活组织检查来确定。例如，测量的参数可以是肺功能的存在或程度、阻塞的体征和症状；运动耐受性；夜间唤醒；误学或误工的天数；支气管扩张药物用量；吸入皮质类固醇(ics)剂量；口服糖皮质激素(gc)用量；对其他药物的需求；对医学治疗的需求；住院。
[0328]
对治疗的阳性反应还可以是预防或减轻呼吸道症状的恶化，例如降低炎性红斑或细胞因子/趋化因子表达水平、减少咳嗽或痰液产生、或减少胸闷。
[0329]
本文所述的肽可配制在组合物中用于施用至上呼吸道(urt)、下呼吸道(lrt)或urt和lrt两者。本文所述的肽可配制用于鼻内施用，包括干粉、喷雾剂、雾剂或气雾剂。这对于呼吸道感染的治疗可能是特别优选的。用于施用的合适制剂(例如，鼻喷雾剂或滴鼻剂，其中载体是液体)包括活性成分的水溶液或油性溶液。或者，组合物可以是干粉，包括例如赋形剂，例如甘露醇、海藻糖、乳糖，并将其施用至上呼吸道。液体或干粉制剂可设计用于上呼吸道和下呼吸道递送。
[0330]
也可以包含其他成分，诸如本领域已知的防腐剂、着色剂、润滑或粘性矿物油或植物油、香料、天然或合成植物提取物(诸如芳香油)、湿润剂和粘度增强剂(诸如甘油)，以为制剂提供额外粘度、保湿性和令人愉悦的质地和气味。对于本发明的溶液或悬浮液的鼻腔施用，本领域有各种装置可用于产生液滴、微滴和喷雾。例如，本文所述的化合物或组合物可通过简单的滴管(或移液管)施用至鼻道中，该滴管包括玻璃、塑料或金属分配管，内容物
通过由附接至一端的手动泵(例如，柔性橡胶球)提供的空气压力从该管逐滴排出。
[0331]
眼睛的泪液分泌物从眼眶流入鼻道中，因此，如果需要，普通技术人员可以容易地提供合适的药学上可接受的眼用溶液作为本文所述的肽或组合物的载体进行递送，并且可以滴眼剂的形式施用至眼眶以提供眼部和鼻内给药。
[0332]
在一个实施方案中，制备包含含有用于以滴剂或喷雾剂形式递送的溶液或悬浮液的滴管或喷雾装置的预先测量的单位剂量分配器，其含有一个或多个剂量的待施用药物。本发明还包括一种试剂盒，该试剂盒含有一个或多个单位脱水剂量的化合物，以及任何所需的盐和/或缓冲剂、防腐剂、着色剂等，可随时通过加入适量的水将其制备成溶液或悬浮液。水可以是无菌的或非灭菌的，尽管通常优选无菌水。
[0333]
施用至皮肤
[0334]
在一个实施方案中，提供了一种用于治疗或预防个体真皮层或皮肤(包括表皮、下皮/皮下组织)中不适当炎症反应的方法，该方法包括向需要治疗的个体施用肽、包含药学有效量的本文所述肽或其药学上可接受的盐的药物组合物，从而治疗或预防个体真皮层或皮肤中不适当的炎症反应。
[0335]
对治疗的阳性反应可以是预防或减轻皮肤症状恶化，例如降低炎性红斑或细胞因子/趋化因子表达水平，减少肿胀、皮疹、鳞屑和/或减少从患病区域渗出的液体。
[0336]
适于治疗皮肤中不适当的炎症反应的药物组合物可与一种或多种赋形剂一起配制。另外，药物组合物还可与类固醇乳膏、保湿剂、煤焦油、乳膏或软膏或类视黄醇乳膏一起施用。
[0337]
其他物质(诸如生物活性剂、药物赋形剂和美容剂)可包含在本发明的局部组合物中。
[0338]
生物活性剂可包括但不限于类黄酮/黄酮化合物，其包括但不限于tanetin、3,7,3'-三甲氧基六羟黄酮、芹菜素及其衍生物。当存在类黄酮/黄酮化合物时，基于局部组合物的重量，它们的浓度为约0.001％至约0.5％，优选地为约0.005％至0.2％。
[0339]
其他生物活性剂包括但不限于防晒剂、抗皱/抗老化剂、抗真菌剂、抗菌剂、抗痤疮和抗牛皮癣剂、脱色剂，其中可使用此类药剂，只要它们与局部组合物的其他组分在物理和化学上相容。
[0340]
本发明的组合物可包含另外的皮肤活性剂。活性物质可以是但不限于维生素化合物。亮肤剂(曲酸、抗坏血酸和衍生物，诸如抗坏血酸棕榈酸酯等)；抗氧化剂，诸如生育酚和酯；烟酰胺、金属螯合剂、类视黄醇和衍生物、保湿剂、羟基酸，诸如水杨酸、防晒剂，诸如甲氧基肉桂酸辛酯、羟苯甲酮、阿伏苯宗等、防晒剂，诸如氧化钛和氧化锌、以及皮肤保护剂。可使用上述皮肤活性物质的混合物。
[0341]
可用于本发明组合物的防晒剂可包括但不限于有机或无机防晒剂，诸如甲氧基肉桂酸辛酯和其他肉桂酸酯化合物、二氧化钛、氧化锌等。
[0342]
抗真菌剂包括但不限于咪康唑、益康唑、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、联苯苄唑、特康唑、布康唑、噻康唑、奥昔康唑、硫康唑、沙康唑、克霉唑、十一烯酸、卤普罗近、布替萘芬、托萘酯、制霉菌素、环吡酮胺、特比萘芬、阿莫罗芬、萘替芬、新康唑、灰黄霉素，以及它们的药学上可接受的盐。
[0343]
抗生素(或防腐剂)包括但不限于莫匹罗星、硫酸新霉素、杆菌肽、多粘菌素b、l-氧
氟沙星、四环素(盐酸金霉素、盐酸土霉素和盐酸四环素)、磷酸克林霉素、硫酸庆大霉素、苯扎氯铵、苄索氯铵、己基间苯二酚、甲基苄索氯铵、苯酚、季铵化合物、三氯碳、三氯生、茶树油、过氧化苯甲酰，以及它们的药学上可接受的盐。
[0344]
痤疮成分包括但不限于使表皮分化正常化的药剂(例如，类视黄醇)、角质层分离剂(例如，水杨酸和α-羟基酸)、过氧化苯甲酰、抗生素和调节皮脂的化合物或植物提取物。
[0345]
抗牛皮癣剂包括但不限于皮质类固醇(例如，二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、二乙酸二氟拉松、丙酸卤倍他索、安西奈德、去羟米松、醋酸氟轻松、醋酸氟轻松、哈西奈德、醋酸曲安西龙、氢化可的松、戊酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、二丙酸阿氯米松、氟氢缩松、糠酸莫米松、醋酸甲基泼尼松)、维生素d及其类似物(例如，卡泊三烯)、类视黄醇(例如，罗肤格)和地蒽酚。
[0346]
可用于本发明组合物的美容剂可包括但不限于防止潜在皮肤刺激的那些药剂，诸如润肤剂、维生素和抗氧化剂(例如，维生素e)和草药提取物(例如，芦荟)。此外，美容剂可包括湿润剂、抗氧化剂/防腐剂、植物提取物、调味剂、香料、表面活性剂等。湿润剂的实例包括甘油、山梨醇、丙二醇、乙二醇、1,3-丁二醇、聚丙二醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、燕麦蛋白、尿囊素、乙酰胺mea、透明质酸等。它们可单独使用或组合使用。
[0347]
美容剂还可包括掩盖炎性病症和相关病状的症状的物质；此类物质包括但不限于颜料、染料和其他添加剂(例如，二氧化硅、滑石、氧化锌、氧化钛、粘土粉末)。药物赋形剂包括但不限于ph调节剂，诸如ph调节剂、有机溶剂(例如，丙二醇、甘油等)、鲸蜡醇、高岭土、滑石、氧化锌、氧化钛、玉米淀粉、葡萄糖酸钠、油(例如，矿物油)、鲸蜡硬脂醇醚-20、鲸蜡醇聚醚-2、表面活性剂和乳化剂、增稠剂(或粘合剂)、香料、抗氧化剂、防腐剂和水。
[0348]
粘合剂或增稠剂可用于本发明的组合物中以向组合物提供直接性和物理稳定性。适用于本发明组合物的粘合剂或增稠剂包括纤维素衍生物，诸如羧甲基纤维素的碱金属盐、甲基纤维素、羟乙基纤维素和羧甲基羟乙基纤维素钠；碱金属藻酸盐，诸如藻酸钠、丙二醇藻酸盐；树胶，诸如角叉菜胶、黄原胶、黄蓍胶、caraya树胶和阿拉伯胶；以及合成粘合剂，诸如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂(诸如，天然胶和合成聚合物)以及着色剂和香料也通常包含在此类组合物中。
[0349]
可用于本发明组合物的防腐剂的实例包括但不限于水杨酸、盐酸氯己定、苯氧基乙醇、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等。
[0350]
可用于本发明组合物的调味剂和芳香剂的实例包括薄荷醇、茴香脑、香芹酮、丁子香酚、柠檬烯、罗勒烯、正癸醇、香茅醇、α-萜品醇、水杨酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸香茅酯、桉树脑、芳樟醇、乙基芳樟醇、香草醛、百里酚、留兰香油、薄荷油、柠檬油、橙油、鼠尾草油、迷迭香油、肉桂油、甜椒油、肉桂叶油、紫苏油、冬青油、丁香油、桉树油等。
[0351]
本发明的组合物可制备成许多形式局部施用于患者。例如，组合物可以凝胶、乳膏、软膏、洗发剂、头皮调理剂、液体、喷雾液体、涂抹/刷涂制剂、气雾剂、粉末或粘性绷带的形式施用。此外，组合物可浸渍在绷带、水胶体或其他伤口敷料、治疗贴剂上或布擦拭产品(诸如，婴儿擦拭物或面部擦拭物)上。
[0352]
本发明的组合物可以乳液形式存在，诸如乳膏剂、洗剂等。这种组合物可具有多于一个相并且可包括能够制造多相乳液的表面活性剂。
[0353]
可用于本发明组合物的表面活性剂的实例包括烷基硫酸钠，例如，月桂基硫酸钠和肉豆蔻基硫酸钠；n-酰基肌氨酸钠，例如，n-月桂酰基肌氨酸钠和n-肉豆蔻酰基肌氨酸钠；十二烷基苯磺酸钠、氢化椰子脂肪酸单甘油酯硫酸钠、月桂基磺基乙酸钠和n-酰基谷氨酸盐，例如，n-棕榈酰基谷氨酸盐、n-甲基酰基牛磺酸钠盐、n-甲基酰基丙氨酸钠盐、α-烯烃磺酸钠和二辛基磺基琥珀酸钠；n-烷基氨基甘油，例如，n-月桂基二氨基乙基甘油和n-肉豆蔻基二氨基乙基甘油、n-烷基-n-羧甲基铵甜菜碱和2-烷基-1-羟乙基咪唑啉甜菜碱钠；聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯羊毛脂醇、聚氧乙烯甘油基单脂族酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂族酸酯、聚氧乙烯脂族酸酯、高级脂族酸甘油酯、脱水山梨糖醇脂族酸酯、普朗尼克型表面活性剂，和聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂族酸酯，诸如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。本领域技术人员已知的乳化剂型表面活性剂应用于本发明的组合物中。
[0354]
在本发明的另一方面，提供了皮肤病学可接受的载体。这种合适的载体适于局部使用。它不仅与本文所述的活性成分相容，而且不会引入任何毒性和安全性问题。有效和安全的载体占本发明组合物重量的约50％至约99％，更优选地占组合物重量的约75％至约99％，最优选地占组合物重量的约85％至约95％。
[0355]
选择使用哪种药物赋形剂或生物制剂或美容剂通常受所治疗的炎性病症或相关病状类型的控制或影响。例如，如果本发明的组合物用于治疗与脚癣、股癣或尿布疹相关的皮肤炎症，那么滑石将是优选的药物赋形剂，抗真菌剂将是优选的生物制剂。如果本发明的组合物用于治疗头皮湿疹，那么乳化剂和油类将是优选的药物赋形剂。
[0356]
试剂盒
[0357]
本发明提供了可简化本文所述的任何药剂的施用的试剂盒。本发明的示例性试剂盒包含单位剂型的本文所述的任何组合物。在一个实施方案中，单位剂型是容器，诸如预填充注射器，其可以是无菌的，含有本文所述的任何药剂和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物。该试剂盒可进一步包含标签或印刷的说明书，该说明书指导使用本文所述的任何药剂。该试剂盒还可包含眼睑张开器、局部麻醉剂和用于给药位置的清洁剂。该试剂盒还可进一步包含一种或多种本文所述的另外的药剂。在一个实施方案中，该试剂盒包含含有有效量的本发明组合物和有效量的另一种组合物(诸如，本文所述的那些组合物)的容器。
[0358]
本发明还包括试剂盒，该试剂盒包含以下物质的一种或多种：
[0359]
(i)本文所述的肽；
[0360]
(ii)本发明的抗原结合位点；
[0361]
(iii)本文所述的抗炎剂；
[0362]
(iii)本发明的药物组合物。
[0363]
在一个实施方案中，该试剂盒还可包含检测工具，例如与本发明的肽连接的检测工具。
[0364]
在试剂盒具有治疗/预防用途的情况下，该试剂盒还可包含药学上可接受的载体。
[0365]
任选地，本发明的试剂盒包装有根据任何实施例用于本文所述方法的说明书。
[0366]
应当理解，在本说明书中公开和限定的本发明包括文本或附图中提到的或从文本或附图中可明显看出的两个或多个单独特征的所有可选组合。所有这些不同的组合构成了
本发明的各个可选方面。
[0367]
实施例1：适用于本发明的肽的产生
[0368]
合成rp23(seq id no:12)。
[0369]
h-kkkk-ch2ch2och2ch2och2co-mtpgtqspffllllltvltvv-oh rp23(肽12)在ctc树脂上以12.5μmol的量通过自动化spps进行合成，并在50℃下进行偶联反应。在两个leu-thr连接处掺入了假脯氨酸二肽fmoc-l-leu-l-thr[ψme,mepro]-oh。用tfa:ipr3sih:茴香硫醚:h2o(90:2.5:2.5:5，v/v/v/v)从树脂上切割该肽。经制备性hplc纯化，随后冷冻干燥，得到白色固体rp23(肽12)(9.6mg，26％收率)。lrms计算值：[m 2h]
2
＝1475.38，[m 3h]
3
＝983.92，[m 4h]
4
＝738.19；实验值(esi )：1145.90，764.10。c
140h239n31o35
s的hrms计算值：[m h]

＝2946.760；实验值(maldi-tof)：2946.758。
[0370]
实施例2：施用肽对免疫系统局部抑制的影响
[0371]
接触超敏性模型-方法
[0372]
将8周龄雌性c57bl/6小鼠(australian bioresources)的腹部粗剃毛。最少24小时后，通过50μl的磷酸盐缓冲盐水经腹部皮下注射来递送rp23(seq id no:12)。七天后，通过施用于剃毛后的腹部，使小鼠对1-氟-2,4-二硝基苯(dnfb，0.5体积％)的橄榄油/丙酮(1:4，v/v，30μl)溶液局部过敏。致敏五天后，用dnfb(0.25体积％)的橄榄油/丙酮溶液(1:4，v/v，15μl/耳)对小鼠耳部进行刺激。从刚开始刺激前到刺激后96小时，使用手动测径器每天测量耳厚度。耳肿胀的阳性对照由注射pbs而不是注射rp23后的小鼠组成。阴性对照或刺激对照由一组接受dnfb刺激但未接受致敏的小鼠组成。从其他样品的耳厚度变化中减去该对照组耳厚度变化的平均值来说明由于施用dnfb、橄榄油和丙酮引起的非特异性刺激。
[0373]
咪喹莫特诱导的银屑病模型-方法
[0374]
对8周龄雌性c57bl/6小鼠(australian bioresources)的背部粗剃毛。最少24小时后，通过200μl的磷酸盐缓冲盐水(pbs)经下背部皮下注射来递送10nmol的rp23。作为疾病发展阳性对照的小鼠组仅接受pbs注射。一天或七天后，通过将5％的咪喹莫特乳膏(aldara，inova pharmaceuticals)局部施用于剃毛后的背部(57.5mg)和一耳部(5mg，分涂于耳廓和耳背)来诱发银屑病样炎症。对侧耳作为咪喹莫特诱导炎症的阴性对照。每天重复施用咪喹莫特并持续四天。c57bl/6小鼠在施用咪喹莫特乳膏后体重快速减轻(高达20％)。在咪喹莫特施用前2天开始以饮食补充的形式对小鼠提供支持性护理，并在咪喹莫特施用的第二天和第三天于腹膜内注射300μl的无菌pbs。通过记录体重减轻和使用仅评估疾病严重程度的修正的银屑病皮损面积和严重程度指数(pasi)临床评分系统对背部皮肤的疾病进行分级来监测疾病进展五天。另外，在背部皮肤的四个象限上读取红斑计(dsm ii测色仪，cortex technology，丹麦)读数并使用手动测径器记录皮肤背厚度测量值。通过记录耳厚度来确定耳皮肤的疾病进展，其中耳厚度通过手动测径器测量。作为免疫抑制治疗的阳性对照，对各组小鼠每日局部施用二丙酸倍他米松0.05％(msd)乳膏(背部30mg，耳部10mg)。接受过类固醇治疗的小鼠体重和脾重都明显减轻，这表明产生了全身性免疫抑制作用。
[0375]
发明人最初试验了rp23(seq id no:12)作为小鼠皮肤肿瘤模型中的疫苗抗原。令人惊讶的是，他们在经rp23处理的小鼠中没有观察到皮肤肿瘤生长减缓，而是观察到了肿瘤生长有所增加，这表明产生了免疫抑制作用(图1)。然后他们使用接触超敏试验对rp23是
否能缓解接触性皮炎鼠模型中的炎症进行了评估(图2a)。如通过耳厚度减少(图2b)和炎性髓样细胞皮肤浸润减少(图2c)所测量的，在致敏之前单次注射纳摩尔的rp23能够显著抑制炎症的引发。这种免疫抑制对rp23序列是特异性的，因为以加扰顺序携带相同氨基酸的肽没有显著减缓耳肿胀(图3a)。当与seq id no:3(muc1sp)的作用相比时，rp23大大提高了合成产率而没有明显改变免疫抑制作用(图3b)。发明人使用rp23进行了剂量反应试验以滴定免疫抑制作用。使用低纳摩尔范围内的三个剂量(2nmol、5nmol或10nmol，约0.3mg/kg、0.8mg/kg、1.6mg/kg)，与对照组相比，观察到耳肿胀的剂量依赖性减少高达100％(图3c)。在试验中添加gm-csf消除了由rp23引起的大部分抑制作用(图3d)。此外，在咪喹莫特诱导的银屑病鼠模型中(图4a)，单次注射rp23缓解了局部红斑、皮肤增厚和鳞屑(图4b，图4c)。这种免疫调节作用被阻断在递送rp23的区域中，这与局部施用糖皮质激素会引起不必要的全身性免疫抑制作用不同(图4d)。即使对小鼠每天皮下注射10nmol的剂量并持续6天(数据未显示)，在接受rp23注射的小鼠中仍没有观察到任何类型的不良反应，这表明该肽是无毒且无刺激性的。
[0376]
使用体外培养系统确定rp23是否能够抑制特异性促炎免疫细胞的活性。在原代鼠脾树突细胞中，rp23减少了炎性趋化因子的分泌(数据未显示)以及表面活化标记的表达(图5a)。经rp23培养的鼠科骨髓衍生巨噬细胞在lps刺激后il-6、mcp-1和tnf的释放减少(图5b)。类似地，来源于人血的原代巨噬细胞在lps或咪喹莫特刺激后il-6和il-12/23的释放减少(图5c)。rp23能够诱导巨噬细胞产生这些变化而不引起对细胞的任何细胞抑制作用或细胞毒性作用(图6)，这表明了该肽是无毒的。当皮内注射rp23到健康人类皮肤外植体时，它降低了真皮树突细胞的自发性活化(图7)。
[0377]
总之，本文所述的肽有潜力用于对寻求改善炎性皮肤疾病治疗的患者的新型、基于局部作用肽的疗法。
[0378]
另外，经修饰的免疫途径，特别是il-12/23、il-6和tnf的减少(图5)以及促炎免疫细胞诸如巨噬细胞和树突细胞活化状态的减少(图5、图7、图15)表明了rp23具有超出炎性皮肤适应症更广泛的适用性。银屑病小鼠皮肤中rp23介导的tcrαβ

t细胞减少(图11a)以及皮肤引流淋巴结中foxp3

cd4

t细胞的增加(图11b)也表明了rp23适用于t细胞介导的炎性病状。这可包括进一步以t辅助1或17型炎症为特征的炎性病状，诸如类风湿性关节炎和炎症性肠病，其可由促炎性先天性免疫细胞引发或通过促炎性先天性免疫细胞进一步加重。
[0379]
实施例3：rp23变体(seq id no:12)对炎症反应的作用
[0380]
接着，发明人使用接触超敏性模型进行了另外的体内研究以确定rp23负责其免疫调节活性的部分。在对皮肤用接触刺激物(dnfb)致敏前七天，对小鼠腹部皮下注射一次肽(10nmol)。五天后，用dnfb刺激小鼠的耳部远端位点。72小时内测量耳厚度。耳厚度与炎症反应程度成比例。
[0381]
与注射盐水(pbs)的小鼠相比，发现seq id no:12(rp23)、荧光标记的seq id no:12(seq id no:21＝af594-rp23)、可重组产生的seq id no:12(seq id no:22＝k4g3muc1sp)和肽的c末端片段(seq id no:2＝muc1sp c片段)都会使炎症反应有所缓解(图8)。
[0382]
肽序列seq id no:12kkkk-peg-mtpgtqspffllllltvltvv
seq id no:21af594-kkkk-peg-mtpgtqspffllllltvltvvseq id no:22kkkkgggmtpgtqspffllllltvltvvseq id no:2llllltvltvv
[0383]
实施例4：另外的肽变体对炎症反应的作用
[0384]
在接触性皮炎的小鼠模型中，使用如本文所述标记为seq id no:32和seq id no:35的许多其他肽变体证实了上述rp23(seq id no:12)的作用。将这些肽的作用与加扰seq id no:35进行比较。
[0385]
对小鼠腹部皮下注射一次pbs、rp23(10nmol)或下表中所示的下列肽变体之一(rp23的等摩尔量)。
[0386][0387]
在指示的位置，光致亮氨酸代替亮氨酸，这些分子用于光交联研究。七天后，用接触刺激物(dnfb)致敏腹部皮肤，并于五天后，用dnfb刺激小鼠的耳部远端位点。
[0388]
如图9a所示，在接受任何rp23变体注射的小鼠中，耳厚度显著增加有所降低，其中肽序列保留。相反，接受对照pbs注射或seq id no:35加扰变体注射的小鼠耳部炎症没有得到缓解。这重申了seq id no:30氨基酸序列对免疫抑制作用的重要性，并且表明了特定的化学修饰不影响rp23的功效。因此，经修饰的rp23 seq id nos:32和35可代替rp23用于评估rp23诱导的免疫调节作用。
[0389]
实施例5：本文所述的肽与皮质类固醇联合施用对炎症反应的作用
[0390]
将aldara霜剂(5％的咪喹莫特，57.5mg)每天(第0-4天)施用于c57bl/6雌性小鼠的背部以诱导银屑病。测定在第0天向背部局部施用或不施用糖皮质激素(0.05％的二丙酸倍他米松，30mg)的情况下接受预防性pbs或rp23注射(于第-1天)的小鼠的临床评分(pasi；修正的银屑病皮损面积和严重程度指数)(图10a)。在早期时间点，即在第1天和第2天，与单独注射rp23或单独注射bd相比，同时接受rp23和bd注射的小鼠的临床评分略有下降。值得注意的是，随着疾病的发展，单独注射bd所带来的保护作用丧失，而同时注射rp23和bd所带来的保护作用得以维持。然而，在稍后的时间点，与单独注射rp23相比，组合注射没有优势。
[0391]
当在治疗时间点(第1天)协同给药时，还对rp23和bd疗法进行了测试。如上所述诱发银屑病，但在第5天停止施用咪喹莫特后10天内每天测定临床评分以记录银屑病疾病消退的速率和程度(图10b)。此外，rp23和bd在减缓疾病方面提供了早期优势(于第2天)并在疾病消退的速率和程度方面与仅注射bd疗法相比提供了改善。这表明rp23可用于增强治疗性bd的功效，包括当仅单次施用bd或rp23时。
[0392]
实施例6：rp23处理减少患病皮肤中β

t细胞并增加皮肤引流淋巴结中cd4

t调节性细胞
[0393]
于第-1天对c57bl/6雌性小鼠注射pbs或rp23，然后将aldara霜剂(5％的咪喹莫特，57.5mg)每天(第0-4天)施用于小鼠背部以诱导银屑病。于第15天，通过流式细胞术分析皮肤和腹股沟淋巴结以将t细胞亚群定量为银屑病背部皮肤中总白细胞(cd45

)的比例(图11a)。rp23处理降低了背部皮肤中总cd4

和cd8

t细胞的比例，这表明了在银屑病存在的情况下促炎t细胞向皮肤的增殖或募集减少。
[0394]
通过转录因子染色和流式细胞术对皮肤引流淋巴结(腹股沟)中的cd3

cd4

tcrαβt细胞进行表型分析以鉴定具有调节表型(即foxp3 )的细胞。在经rp23处理的小鼠中，无论分别限定转录因子t-bet或rorγt的th1或th17是否同时表达，foxp3表达细胞的数目均会明显增加(图11b)。这表明rp23治疗促进了调节t细胞应答的应答，包括th1或th17型炎症；rp23可用于任何其中该类型炎症是致病性炎症的炎症适应症，包括银屑病、接触性皮炎、炎性肠病(例如溃疡性结肠炎或克罗恩病)和类风湿性关节炎。
[0395]
实施例7：用于局部施用的肽制剂
[0396]
rp23
af594
被配制在由聚二甲基硅氧烷、液体石蜡、4-氯-3-甲基苯酚、溴化十六烷基三甲铵和十八烷-1-醇组成的适合的储备乳液中用于局部施用。将其局部施用(7mg/cm2，10nmol的rp23)于全厚度人皮肤外植体并培养24小时。制备冷冻切片并通过荧光显微镜进行分析。在表皮组织(e)和基底膜(线)下的真皮组织(d)中均可检测到rp23
af594
。这表明了当局部施用于人皮肤时rp23能够穿透角质层和基底膜，并发现rp23与皮肤的表皮层和真皮层两者中的细胞紧密连接或被其捕获(图12)。
[0397]
实施例8：施用肽对免疫系统局部抑制的影响：rp23治疗缓解特应性皮炎小鼠模型中的炎症
[0398]
对c57bl/6雌性小鼠的耳部和剃后的背部致敏(第0天)并局部施用刺激剂噁唑酮或仅施用媒介物进行刺激(第7、10、14、17、19、21、23、25和27天)。于第-1天，或于第-7天和第-1天对小鼠注射rp23，与仅注射pbs(第-7天和第-1天)或在每次施用恶唑酮时在小鼠背部施用类固醇(0.01％的二丙酸倍他米松，30mg)进行比较。使用手动测径器测量耳厚度。与注射pbs的对照组小鼠相比，接受rp23注射小鼠组的耳内炎症有所缓解，这表明rp23减少了对局部刺激物的炎症反应的引发。
[0399]
实施例9：rp23与皮肤和肺部中的先天性免疫细胞相互作用
[0400]
在c57bl/6小鼠给药后24小时，通过流式细胞术鉴定af594-rp23

细胞。当在下背部皮下注射rp23时，该肽主要被嗜中性粒细胞(cd11b

ly6g

)或cd11b

髓样细胞亚群(其可包含巨噬细胞和树突细胞)捕获于皮肤中(图14a)。类似地，当rp23通过鼻内滴注递送到肺粘膜时，该肽主要被嗜中性粒细胞、肺泡巨噬细胞和树突细胞捕获(图14b)。
[0401]
rp23的粘膜递送也降低了肺部中抗原呈递细胞上活化标记的表达。通过鼻内滴注使未接触过抗原的c57bl/6小鼠(n＝5)接受pbs注射或rp23注射，并于24小时后，收集来自支气管肺泡灌洗液和灌注肺中的细胞。通过流式细胞术测定cd11c

树突细胞上mhcii的平均荧光强度。肺组织中树突细胞上的mhcii表达明显降低(图15a)。为了确定一旦诱导有效的肺部炎症这种作用是否能维持，通过鼻内滴注对c57bl/6小鼠(n＝4)注射pbs、倒频rp23肽或rp23，然后24小时后鼻内施用pam2cys-sk
4-peg(oh)以诱导炎症状态。经rp23处理的小
鼠在肺树突细胞和支气管肺泡间隙中的树突细胞中mhcii表达再次降低(图15b)。这表明了rp23被抗原呈递细胞摄取，然后调节它们的功能，使得它们具有较少的促炎性。