一种用于鉴定奶牛基因型的引物及其应用的制作方法

1.本发明是关于一种用于鉴定奶牛基因型的引物及其应用，具体而言，是关于一种用于鉴定a1型、a2型β-酪蛋白奶牛的引物，含有所述引物的试剂盒，以及鉴定奶牛β-酪蛋白基因型方法。


背景技术：

2.β-酪蛋白是人乳和牛乳中的一种主要蛋白。牛乳中β-酪蛋白约占总蛋白重量的30％，含有多种人体必需的氨基酸。牛乳中的β-酪蛋白有两种主要的变异型：a1型和a2型。a1型和a2型β-酪蛋白的区别在于第67位的氨基酸不同。a1型β-酪蛋白的第67位为组氨酸，其前7个氨基酸残基可以被裂解产生β-酪啡肽-7。已有研究报道，β-酪啡肽-7可能与婴幼儿的各种疾病有关，例如i型糖尿病和呼吸功能障碍等，并影响中枢神经系统活动。a2型β-酪蛋白的第67位为脯氨酸，无法产生此类裂解。人乳β-酪蛋白的结构与牛乳a2型β-酪蛋白结构较为相似，也无法裂解。除a1型和a2型外，牛乳β-酪蛋白根据其基因不同snps还存在a3、b、c、e、f、h1、i等多种变异型。
3.因此，区分不同型β-酪蛋白牛乳、奶牛具有重要意义。
4.cn105219839a和cn105018582a均公开了一种检测β-酪蛋白基因型的方法，是利用特异性引物进行pcr，扩增片段经限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳的条带结果进行a1和a2型的β-酪蛋白分型，然而有报道该方法成本较高、假阳性率高，后期仍需要进行测序确认。
5.cn105925717a公开了一种检测a1和a2型β-酪蛋白奶牛的方法，其中是基于beta-casein基因(ensembl参考序列ensbtat00000003409)c.245c》a突变，并利用pcr-rflp技术在上游引物(beta-caseinf)上创造了一个突变位点，设计得到可以扩增产生ecot22i酶切位点的引物，通过对pcr扩增产物进行酶切并进行凝胶电泳，依据酶切结果鉴定奶牛基因型。该方法酶切后产生的反应产物包含较小的49bp，以及相近的385bp与434bp，容易导致电泳条带区分显示不清晰。
6.cn107287292b公开了一种同时检测奶牛β-酪蛋白a1、a2、a3、b、c、e、f、h1和i变体型的方法，其中设计了多重pcr扩增引物和多重连接酶检测反应探针。该方法为多重pcr反应，对反应条件要求苛刻。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的在于提供一种用于鉴定奶牛基因型的引物。
8.本发明的另一目的在于提供所述引物的应用。
9.一方面，本发明提供了一种用于鉴定奶牛基因型的引物，其包括第一引物与第二引物，其中，第一引物为20～70bp且包括如seq id no.1所示序列中的连续的至少20bp的片段；第二引物为20～70bp且包括如seq id no.2所示序列中的连续的至少20bp的片段。
10.seq id no.1(5
’-3’
)：caagagaagtagtgctagaagttggccattgttaaggaactccttgaat
taaaaaaacac；
11.seq id no.2(5
’-3’
)：cagattttca acatcagtgagagtcaggctctggctttcagtaaagggctcaactggata。
12.根据本发明的具体实施方案，本发明的用于鉴定奶牛基因型的引物，其中：
13.第一引物为50～70bp且包括如seq id no.1所示序列中的连续的至少40bp的片段；第二引物为50～70bp且包括如seq id no.2所示序列中的连续的至少40bp的片段。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明的用于鉴定奶牛基因型的引物，其中：
15.第一引物具有如seq id no.1所示序列，或者为在seq id no.1所示序列中经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且与seq id no.1具有相同功能的由seq id no.1衍生的核苷酸序列；
16.第二引物具有如seq id no.2所示序列，或者为在seq id no.2所示序列中经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且与seq id no.2具有相同功能的由seq id no.2衍生的核苷酸序列。
17.根据本发明的具体实施方案，本发明的引物，为具有seq id no.1与seq id no.2所示序列的引物对。
18.本发明的特异性引物对，是基于奶牛a2a2、a1a2、a1a1三种不同型β-酪蛋白基因而特别设计的，能够针对不同基因型奶牛样本进行扩增，并都具有良好的扩增效果和扩增特异性，且扩增片段长度在700bp-750bp左右，能够充分支持dna条形码研究的应用。
19.从而，另一方面，本发明提供了所述的引物在鉴定奶牛β-酪蛋白基因型中的应用。
20.另一方面，本发明还提供了所述的引物在制备用于鉴定奶牛β-酪蛋白基因型的dna条形码或检测试剂盒中的应用。
21.另一方面，本发明还提供了一种用于鉴定奶牛基因型的试剂盒，其包括：
22.本发明所述的鉴定奶牛基因型的引物；和/或
23.dna片段和/或其条形码，其中所述dna片段是利用本发明的鉴定奶牛基因型的引物、分别以不同β-酪蛋白基因型奶牛的dna为模板扩增得到的。所述的dna片段可条码化，得到对应的图像化条形码。
24.根据本发明的具体实施方案，所述dna片段是分别以a2a2、a1a2、a1a1三种基因型奶牛的dna为模板扩增得到的。
25.另一方面，本发明还提供了一种鉴定奶牛基因型的方法，该方法包括：
26.从待测样品中提取总dna；
27.以所提取的总dna为模板，利用本发明所述的引物进行pcr扩增；
28.对上述扩增结果进行分析判断。
29.根据本发明的具体实施方案，本发明的鉴定奶牛基因型的方法中，所述待测样品来自需要鉴定β-酪蛋白基因型的奶牛的血液或组织材料(例如牛毛囊、耳组织)。
30.根据本发明的具体实施方案，本发明的鉴定奶牛基因型的方法中，所述pcr扩增的条件为：
31.94℃预变性3min；94℃变性10-60sec，50-65℃退火10-60sec，72℃延伸1-10min，此步骤20-40个循环；72℃保持1-10min。
32.根据本发明的具体实施方案，本发明的鉴定奶牛基因型的方法中，对扩增结果进
行分析判断的过程包括：
33.对扩增产物进行测序；和/或
34.将扩增产物的序列与本发明中所述的dna片段的序列、测序图谱和/或条形码进行比较。
35.本发明的鉴定奶牛基因型的技术，具有以下特点：
36.可以检测a2a2、a1a2、a1a1三种基因型中任意一种的存在，而不仅仅是检测一种基因型；
37.检测准确性高，通过多样品的检测显示，本发明的检测结果与第三方检测一致性达100％；
38.pcr产物能够清晰读取序列；
39.不但可以检测第67位蛋白位点的突变，还可以检测另外的4个突变位点；
40.操作简单，设定合适的pcr扩增条件后，即可得到目的片段；
41.成本低，对仪器及试剂要求不高，一般分子生物学实验室均可进行。
42.总而言之，本发明设计了特异性引物，对奶牛不同基因型的特异性较好，产物片段长度合适，并有很好的扩增效率，并且扩增容易，不容易得到错误序列信息。
附图说明
43.图1为本发明实施例1中电泳确认目的片段的电泳图。
44.图2为本发明实施例1中测序得到的核苷酸测序图。
45.图3为本发明的基因分型示意图。
具体实施方式
46.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂均可商购获得，所用引物委托合成。
47.实施例1鉴定奶牛基因型的特异性引物对及鉴定方法
48.1.引物设计
49.本发明根据奶牛a2a2、a1a2、a1a1三种基因型的β-酪蛋白基因，利用软件在对长达10338bp核苷酸序列选取不同的位点进行设计引物，经过分析初步筛选得到48对引物，进一步经过调整扩增条件等实验验证分析，最终筛选出seq id no.1和seq id no.2引物对，其对多种不同基因型的样品扩增得到的产物均能够清晰读取序列。
50.正向引物(seq id no.1)：
[0051]5’-
caagagaagtagtgctagaagttggccattgttaaggaactccttgaattaaaaaaacac-3’；
[0052]
反向引物(seq id no.2)：
[0053]5’-
cagattttca acatcagtgagagtcaggctctggctttcagtaaagggctcaactggata-3’。
[0054]
2.dna提取
[0055]
采集荷斯坦奶牛血液，提取总dna作为pcr的模板。基因组dna提取按照sambrook&russel(2001)的方法进行。
[0056]
3.pcr扩增
[0057]
用移液器移取所得dna溶液1μl，经由微量紫外分光光度计nd-1000(nanodrop technologies,inc.，usa)进行dna浓度测定，并通过a
260/280
的吸收率比值判断dna纯度。
[0058]
pcr扩增采用35μl反应体系，反应体系组成为dna模板(浓度﹥50ng/μl)4μl，上游引物(10μm)1.5μl，下游引物(10μm)1.5μl，2
×
taq master mix 17.5μl，灭菌水10.5μl。
[0059]
pcr扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，此步骤40个循环；72℃保持3min。。
[0060]
电泳确认：可选择性地通过电泳确认目的片段是否符合要求。结果参见图1，确认符合要求。
[0061]
4.核苷酸测序
[0062]
通过核苷酸测序，得到准确核苷酸序列及测序图(图2)。从图中可以看出，本发明中的引物不但可以检测67号蛋白位点的突变(图中第一处框线标示处，a2/a1)，还可以检测另外4个突变位点(图中第二至第五处框线标示处)。
[0063]
5.基因分型
[0064]
通过分析核苷酸序列，判定基因分型(图3)。
[0065]
表1记录了采用本发明的方法对来源于252头奶牛的不同样品进行基因分型的结果，经与第三方基因测序结果比较，一致性达100％。
[0066]
表1本研究基因分型结果与第三方测序比较
[0067][0068]
本实施例的实验结果显示，本发明的引物对特异性好，多个样品扩增均未出现非特异性产物，在不同样品中均具有良好的扩增效率，且扩增产物能够清晰读取序列。