一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒及其应用的制作方法

一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及病毒检测领域，具体涉及马疱疹病毒的检测方法及其应用，更具体的涉及ehv-1和ehv-4病毒检测的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.马鼻肺炎(equine rhinopneumonitis，er)是由疱疹病毒科 (herpesviridae)的马疱疹病毒1型(equine herpesvirus1，ehv-l)和马疱疹病毒4型(equine herpesvirus4，ehv-4)引起的一种急性、发热性传染病。ehv-l能引起不同程度的神经症状和高死亡率的马脑脊髓炎，以及怀孕母马流产，马驹死亡；ehv-4在世界范围内是引起马呼吸道疾病的主要原因；这两种病毒的病原体对养马业造成了严重的危害。早期诊断和加强饲养管理是预防关键。er的两种病原体间存在血清交叉反应，建立诊断及分型研究方法有利于马鼻肺炎的防控。
3.现有技术中，申请号为201410042034.7的发明专利中提供了一种一种用于检测i型和iv型马疱疹病毒的双重evay green实时荧光定量pcr检测试剂盒及其应用，ehv-1和ehv-4的检出率均为 76.9％(10/13)且检测结果需要结合标准曲线及琼脂糖凝胶检测，过程复杂。申请号为201310690472.x的发明专利中提供了一种鉴别马疱疹病毒1/4型的lamp检测引物及方法，结果也需依赖琼脂糖凝胶检测，且披露具体的检测准确率，但本技术领域常规技术人员熟知 lamp技术引物设计较复杂,而且在稳定性和准确率等方面与常规pcr相比还有一定的差距。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的不足问题，本发明的目的在于提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒及其应用，以达到早期诊断、治疗、风险分层和预后评估。
5.本发明通过以下技术方案实现的：
6.本发明提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒，含有quantstudio 3d数字pcr反应试剂，所述的试剂盒中含有用于检测ehv-1和ehv-4的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检测ehv-1的引物；包含用于检测ehv-4的引物对，核苷酸序列如seq id no.1及seq id no.2所示；还包含用于检测ehv-4的经vic标记的探针对，核苷酸序列如seq id no.3所示。
7.其中所述的检测ehv-1的引物及经fam标记的探针选用《马疱疹病毒1型quantstudio
tm 3d数字pcr检测方法的建立与应用》文章中披露的ehv-1相关检测引物及探针。
8.优选的，所述的双重反应液中各引物及探针的浓度分别设置为 0.1μmol/l～0.7μmol/l。
9.更优选的，ehv-1引物最优浓度为0.4μmol/l，ehv-4引物最优浓度为0.4μmol/l。
10.更优选的，ehv-1探针最优浓度为0.27μmol/l，ehv-4探针最优浓度为0.27μmol/l。
11.本发明提供的一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒，用于检测ehv-1和ehv-4的dpcr反应条件为：96℃10min； (56℃-64℃)2min，98℃30s，共39个循环；60℃，2min，10℃保存。
12.优选的，用于检测ehv-1和ehv-4的dpcr反应条件为：96℃ 10min；60℃2min，98℃30s,共39个循环；60℃，2min；10℃保存。
13.本发明还提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒在制备用于同时检测ehv-1和ehv-4的试剂中的应用。
14.本发明提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的引物组，含有用于检测ehv-1及ehv-4的引物对，其中，用于检测ehv-1的引物对的核苷酸序列如《马疱疹病毒1型quantstudio
tm 3d数字pcr检测方法的建立与应用》文章中所示，用于检测ehv-4的引物对的核苷酸序列如seq id no.1及seq id no.2所示。
15.本发明提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的探针组，含有用于检测ehv-1及ehv-4的探针对，其中，用于检测ehv-1的探针对的核苷酸序列如《马疱疹病毒1型quantstudio
tm 3d数字pcr检测方法的建立与应用》文章中所示，用于检测ehv-4的探针对的核苷酸序列如seq id no.3所示。
16.同时，本发明还提供了一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒的引物组及探针合物在制备检测ehv-1和ehv-4的试剂中的应用。
17.所述一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒中还包括quantstudio 3d数字pcr反应常用试剂和其它一些辅助试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；在本发明的具体实施方案中，使用了quantstudio 3d数字pcr的方法。
18.本发明提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
19.本发明提供的一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒及其应用，具有高度的特异性且显著提高检测的准确性。并能够避免试验中可能出现的污染，并对临床样本中的病毒含量进行绝对定量，为 ehv-1、ehv-4感染早期病毒含量较低时的检测提供新的技术，适用于马鼻肺炎的早期诊断、潜伏感染甄别及流行病学调查。
附图说明
20.图1所示为灵敏度检测结果图。
21.其中图中所示ehv-1，ehv-4各1μl质粒浓度分别为104copies/μl 图2所示为灵敏度检测结果图。
22.其中图中所示ehv-1，ehv-4各1μl质粒浓度分别为 103copies/μl
23.图3所示为灵敏度检测结果图。
24.其中图中所示ehv-1，ehv-4各1μl质粒浓度分别为 102copies/μl
25.图4所示为灵敏度检测结果图。
26.其中图中所示ehv-1，ehv-4各1μl质粒浓度分别为 101copies/μl
27.图5所示为灵敏度检测结果图。
28.其中图中所示ehv-1，ehv-4各1μl质粒浓度分别为 100copies/μl
29.图6所示为特异性检测结果图。
具体实施方式
30.下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
31.本发明中材料及试剂有：ehv-1、ehv-4、马泰勒虫、马动脉炎病毒的核酸均由乌鲁木齐海关技术中心保存，dna/rna提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自takara公司，quantstudio
tm 3d digitalpcr master mix v2购自赛默飞公司。
32.本发明中所使用的仪器有：co2培养箱购自天美公司；nanodropnd-1000微量核酸蛋白检测仪、quantstudio
tm 3d digital pcr系统包括：quantstudio
tm 3d digital pcr chip v2、quantstudio
tm 3ddigital pcr chip loader、proflex
tm 2xflat pcrsystem，quantstudio
tm 3d数字pcr读取仪、quantstudio
tm 3d analysissuite
tm software购自赛默飞公司。所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
33.本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
34.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
35.实施例一：一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒
36.本发明提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒，含有quantstudio 3d数字pcr反应试剂，所述的试剂盒中含有用于检测ehv-1和ehv-4的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检测ehv-4的引物，核苷酸序列如seq id no.1及seq id no.2 所示；还包含用于检测ehv-4的经vic标记的探针对，核苷酸序列如seq id no.3所示。
37.其中所述的检测ehv-1的引物及经fam标记的探针选用《马疱疹病毒1型quantstudio
tm 3d数字pcr检测方法的建立与应用》文章中披露的ehv-1相关检测引物及探针。
38.所述的双重反应液中各引物及探针的浓度分别设置为0.1 μmol/l～0.7μmol/l。
39.本发明提供的一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒，用于检测ehv-1和ehv-4的dpcr反应条件为：96℃10min； (56℃-64℃)2min，98℃30s，共39个循环；60℃，2min，10℃保存。
40.本发明还提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒在制备用于同时检测ehv-1和ehv-4的试剂中的应用。
41.本发明提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的引物组，含有用于检测ehv-1及ehv-4的引物对，其中，用于检测ehv-1的引物对的核苷酸序列如《马疱疹病毒1型quantstudio
tm 3d数字pcr检测方法的建立与应用》文章中所示，用于检测ehv-4的引物对的核苷酸序列如seq id no.1及seq id no.2所示。
42.本发明提供一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的探针组，含有用于检测ehv-1及ehv-4的探针对，其中，用于检测ehv-1的探针对的核苷酸序列如《马疱疹病毒1型quantstudio
tm 3d数字pcr检测方法的建立与应用》文章中所示，用于检测ehv-4的探针对的
核苷酸序列如seq id no.3所示。
43.同时，本发明还提供了一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒的引物组及探针合物在制备检测ehv-1和ehv-4的试剂中的应用。
44.所述一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒中还包括 quantstudio
tm 3d数字pcr反应常用试剂和其它一些辅助试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；在本发明的具体实施方案中，使用了quantstudio
tm 3d数字pcr的方法。
45.实施例二：标准品制备
46.提取ehv-1、ehv-4模板后分别进行pcr扩增。pcr反应体系 25μl：premix ex taq 12.5μl，ehv1-f1和ehv1-r1各1μl，dna 模板1μl，加ddh2o补至25μl。pcr反应程序：94℃预变性4min；94℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。扩增产物进行普通pcr试验。将出现目标片段的ehv-1、ehv-4扩增产物和上下游引物送至赛默飞世尔科技ta克隆测序部构建质粒并完成测序工作。使用微量核酸蛋白检测仪检测出提取的质粒浓度，计算出拷贝数。
47.实施例三：反应条件优化
48.扩增条件优化：96℃预变性10min；56℃、58℃、60℃、62℃、 64℃退火2min，98℃变性30s，共39个循环；60℃，2min，10℃保存。反应体系采用15μl反应体系，master mix
×
2为7.5μl，ehv-1 和ehv-4引物0.6μl，ehv-1和ehv-4探针0.6μl，dna模板各1.0 μl，补ddh2o至15.0μl。利用quantstudio
tm 3d分析软件通过试验的有效反应孔数，阴阳性峰状态、荧光信号的强度等来分析试验结果。确定最佳退火温度为60℃。
49.反应体系优化：96℃预变性10min；60℃退火2min，98℃变性 30s，共39个循环；60℃，2min，10℃保存。反应体系15μl，mastermix v2为7.5μl，ehv-1和ehv-4引物0.13μmol/l、0.27μmol/l、 0.40μmol/l、0.53μmol/l、0.67μmol/l，ehv-1和ehv-4探针 0.13μmol/l、0.27μmol/l、0.40μmol/l、0.53μmol/l、0.67μmol/l，dna 模板各1.0μl，补ddh2o至15.0μl。利用quantstudio
tm 3d分析软件通过试验的有效反应孔数，阴阳性峰状态、荧光信号的强度等来分析试验结果。确定最佳ehv-1和ehv-4引物浓度0.40μmol/l，最佳 ehv-1和ehv-4探针浓度0.27μmol/l。
50.实施例四：灵敏性检测
51.以质粒浓度5.83
×
104至5.83
×
100copies/μl为模板，将反应模板换成等体积的ddh2o设置阴性对照。用优化好的反应条件测定该方法检测范围的最低检出限，对与制备获得一种同时定量检测ehv-1 和ehv-4的检测试剂盒进行灵敏性检测。检测结果如附图1、附图2、附图3、附图4、附图5所示，说明本发明提供的一种同时定量检测 ehv-1和ehv-4的检测试剂盒在检测时的的拷贝数灵敏度最低检测限100copies/μl，在100copies/μl及以上拷贝数能够有效检出，在个位数拷贝数以下没有扩增，核酸未能有效检出。
52.实施例五：特异性检测
53.采用本发明提供的一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒对马属动物的常见病马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马泰勒虫、马动脉炎病毒的核酸进行检测，验证3d-dpcr特异性。特异性检测结果如附图6所示，通过使用本发明提供的一种同时定量检测 ehv-1和ehv-4的检测试剂盒，能够同时检测ehv-1和ehv-4，且具有良好的特异性。
54.实施例六：重复性检测
55.以样品的3个不同浓度梯度为模板，取低浓度、中浓度、高浓度样品进行检测，分别进行批内和批间重复性试验，利用拷贝数计算变异系数进行重复性评估。并选择同一浓度梯度样品三周内进行批内和批间重复性试验，ct值计算组内组间变异系数cv均小于0.1％，有良好的重复性和稳定性
56.实施例七：一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒检测结果比较
57.使用全血基因组dna试剂盒提取123份马属动物全血样品核酸，用上述实施例中所述建立的一种同时定量检测ehv-1和ehv-4 的检测试剂盒方法和qpcr检出结果不相符的阳性样品进行病毒分离，验证是否为ehv-1阳性，分别提取可疑样品全血白细胞并悬浮于含2％fbs的mem维持液中，接种到含rk 13的细胞培养瓶中，正常37℃孵育7天后，将细胞培养物进行反复冻融，而后取冻融后的产物按上法再次传代，孵育6内观察病毒对培养的细胞侵染后产生的细胞病变效应(cpe)，将培养瓶放置在-80℃反复冻融3次后离心取上清。再根据dna/rna提取试剂盒的方法，用提取的临床样品核酸，使用现有的技术中报道的ehv1、ehv4引物对其进行普通pcr 扩增，将扩增产物进行测序。以确认临床可疑样品是假阳性还是真阳性。并对检测结果进行对比，检测结果如表1所示。
58.表1：检测结果比较
59.分组阳性数假阳性数本发明提供的试剂盒法1230qpcr方法1203
60.如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。