dna分子与重组病毒及它们的制备方法和用途
技术领域：
：1.本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种dna分子与重组病毒及它们的制备方法和用途，具体地，涉及一种dna分子及其制备方法与应用、重组病毒及其制备方法与应用。
背景技术：
：：2.黄热病毒(yellowfevervirus,yfv)属于黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链rna病毒。黄热病毒主要在非洲和美洲地区流行，我国时有输入病例，人类主要通过蚊子叮咬感染黄热病毒，感染黄热病毒可以导致致死性出血热。目前防治黄热病流行的手段主要是疫苗接种和蚊媒控制，没有可以用于治疗黄热病的抗病毒药物。3.近年来，黄热病毒作为一种再发传染病引起多次大爆发，如2016年的刚果和安哥拉黄热疫情，这些爆发的原因有：(1)人群中黄热疫苗接种率下降。(2)城镇化快速发展，人口集中度提高。(3)蚊媒控制力度下降，黄热病毒的蚊媒入侵城市环境。4.报告病毒是近年来新兴的一种病毒学研究工具。其原理是将报告基因插入到病毒基因组中，通过病毒复制产生报告蛋白，进一步利用激发荧光或生物发光量来检测报告蛋白的表达量，最终标定病毒的复制水平。报告病毒具有传统病毒学难以比拟的优势，主要包括：(1)用时短操作简便，实时获取报告病毒的荧光信后即可完成病毒表达水平的检测；(2)通量高，通过自动化荧光检测设备即可完成大量样本的检测，可用于抗病毒药物的高通量筛选；(3)结合活体成像技术可观察单一动物连续时间点中病毒在体内的复制增殖情况，实时再现病毒在体内的感染过程。5.nano荧光素酶(nano-luciferase)，简称nluc，在细胞或者生物体内，nano荧光素酶可以催化其特异的底物发生可以发光的化学反应，通过检测光信号可以确定nano荧光素酶的含量，进而对病毒颗粒实现定量的目的。nano荧光素酶与底物的化学反应产生的光信号高于rluc和gluc等荧光素酶约100倍，检测的灵敏度更高。但是，目前尚未有以nano荧光素酶为报告基因的重组黄热病毒的相关报道。技术实现要素：6.本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种能够用于制备表达nano荧光素酶的重组黄热病毒的dna分子与重组病毒以及它们的制备和用途。7.为了实现上述目的，第一方面，本发明一方面提供一种dna分子，该dna分子含有串联连接的5’非编码区序列、插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒。8.第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述dna分子的方法，该方法包括在黄热病毒基因组rna对应的cdna中衣壳蛋白c的编码序列中插入nano荧光素酶的编码序列。9.第三方面，本发明提供了含有第一方面所述dna分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。10.第四方面，本发明提供了一种重组病毒，该重组病毒的基因组rna对应的cdna序列与第一方面所述的dna分子的序列相同。11.第五方面，本发明提供一种制备上述重组病毒的方法，该方法包括在黄热病毒基因组的第222-223位核苷酸之间插入nano荧光素酶的编码序列。12.第六方面，本发明提供一种上述dna分子和/或重组病毒在筛选黄热病毒治疗药物中的应用。13.本发明提供的dna分子可用于构建重组病毒，从而获得能够表达nano荧光素酶的重组病毒，该重组病毒能够用于筛选黄热病毒治疗药物。本发明提供的重组病毒具有如下多方面的优点：(1)重组病毒能够在宿主细胞上形成形态清晰且大小均一的蚀斑，蚀斑形态与亲本病毒的蚀斑形态相似；(2)重组病毒体外增殖能力强，热稳定性好；(3)重组病毒与亲本病毒神经毒力相当；(4)利用重组病毒检测荧光信号强度的方法实现对病毒的定量测定，方法简单、快速、准确，可用于筛选药物或其他细胞实验，而且所有操作可以通过自动化的高通量仪器完成，节省了大量时间和人力。附图说明14.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：15.图1为黄热减毒疫苗株yf-17d和重组病毒的全长rna对应的cdna的结构示意图；16.图2为实施例1步骤一中携带nluc基因的黄热病毒全长感染性克隆质粒的双酶切琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，markerdl15000；17.图3为实施例1中重组黄热病毒的光信号检测结果；18.图4为实施例2中间接免疫荧光的结果；19.图5为实施例3中空斑试验的结果；20.图6为实施例4中重组黄热病毒在体外细胞内的增殖特征的测试结果；21.图7为实施例5中重组黄热病毒的热稳定性的测试结果；22.图8为实施例6中重组黄热病毒在vero细胞上的光信号；23.图9为实施例6中重组黄热病毒体外病毒滴度与光信号的相关性；24.图10为实施例7中重组黄热病毒颅内感染balb/c乳鼠的活体成像；25.图11为实施例7中重组黄热病毒体内病毒滴度与光信号的相关性；26.图12为实施例8中重组黄热病毒的遗传稳定性电泳结果；27.图13为实施例9中重组黄热病毒在乳鼠体内的感染；28.图14为实施例9中重组黄热病毒感染乳鼠后的光信号定量分析；29.图15为实施例9中重组黄热病毒在乳鼠体内的脏器分布；30.图16为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的活体成像；31.图17为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的光信号定量分析；32.图18为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的脏器分布；33.图19为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的生存分析；34.图20为实施例11中单抗2a10g6对重组黄热病毒的中和作用；35.图21为实施例11中单抗2a10g6抑制重组黄热病毒的光信号定量分析；36.图22为实施例12中2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内中和实验的光信号检测分析；37.图23为实施例12中2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内的中和实验的光信号定量分析；38.图24为实施例12中2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内中和的生存曲线；39.图25为实施例13中nitd008对重组黄热病毒的光信号；40.图26为实施例13中nitd008抑制重组黄热病毒光信号曲线；41.图27为实施例13中替莫泊芬抑制对重组黄热病毒的光信号；42.图28为实施例13中替莫泊芬抑制重组黄热病毒光信号曲线；43.图29为实施例13中25hc抑制对重组黄热病毒的光信号；44.图30为实施例13中25hc抑制重组黄热病毒光信号曲线。具体实施方式45.以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。46.本发明中使用的“来源于”意指根据病毒的基因序列(rna)构建某蛋白的编码序列(dna)，并不限于从病毒基因组中提取获得基因序列，例如，来源于黄热病毒的序列是指与黄热病毒的基因序列具有90％以上(如92％、94％、96％、98％、99％，优选100％)的同一性的序列；“串联连接”是指将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸(或多肽)序列是连续的。47.第一方面，本发明提供的dna分子含有串联连接的5’非编码区序列、插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒。48.本发明的发明人发现，nluc基因分子量小，发光率高，尤其适用于报告基因，优选地，所述nano荧光素酶的编码序列如seqidno：1所示。49.本发明的发明人进一步发现，所述nano荧光素酶的编码序列位于衣壳蛋白c的编码序列的第102位核苷酸和第103位核苷酸之间，能够进一步保证5’非编码区的功能完整性。更优选地，所述插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列如seqidno：2所示。50.根据本发明所述的dna分子，优选地，所述黄热病毒为减毒株，更优选为黄热减毒疫苗株yf-17d。51.本发明所述的dna分子中，所述5’非编码区序列、衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列可以分别来源于同一基因型的黄热病毒，也可以来源于不同基因型的黄热病毒。52.根据本发明所述的dna分子，优选地，所述dna分子的核苷酸序列如seqidno：3所示。53.所述5’非编码区序列可以为seqidno：3中第1-118位所示的序列。54.所述插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列可以为seqidno：3中第119-1177位所示的序列。55.所述膜和膜蛋白前体prm的编码序列可以为seqidno：3中第1178-1669位所示的序列。56.所述包膜蛋白e的编码序列可以为seqidno：3中第1670-3148位所示的序列。57.所述非结构蛋白的编码序列可以为seqidno：3中第3149-11050位所示的序列。所述非结构蛋白的编码序列通常包括非结构蛋白ns1的编码序列、非结构蛋白ns2a的编码序列、非结构蛋白ns2b的编码序列、非结构蛋白ns3的编码序列、非结构蛋白ns4a的编码序列、非结构蛋白ns4b的编码序列和非结构蛋白ns5的编码序列。58.所述3’非编码区序列可以为seqidno：3中第11051-11556位所示的序列。59.本发明的发明人在研究中发现，将衣壳蛋白c的编码序列的某些位点进行无义突变，可以使所述的dna分子稳定性更高，所述衣壳蛋白c的编码序列的第726位核苷酸的碱基c突变为碱基a，第729位核苷酸的碱基g突变为碱基c，第732位核苷酸的碱基c突变为碱基a，第735位核苷酸的碱基c突变为碱基a，第738位核苷酸的碱基t突变为碱基c，第747位核苷酸的碱基a突变为碱基t，第748位核苷酸的碱基c突变为碱基a。60.第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的dna分子的方法，该方法包括在黄热病毒基因组rna对应的cdna中衣壳蛋白c的编码序列中插入nano荧光素酶的编码序列。61.进一步优选地，在黄热病毒基因组rna对应的cdna中衣壳蛋白c的编码序列中第102位核苷酸和第103位核苷酸之间插入nano荧光素酶的编码序列。62.第三方面，本发明提供了含有第一方面所述的dna分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。63.其中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明的dna分子相连获得。64.所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可为重组表达载体。根据本发明的一种实施方式，所述重组载体可以为pancr载体(序列如seqidno：4所示)的多克隆位点(如noti和xhoi)间插入有所述dna分子的重组载体。65.所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞(如bhk-21细胞或vero细胞)中而获得。66.所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株mc1061)中而获得。67.本发明的重组病毒可以通过将所述重组载体导入离体的哺乳动物细胞(如c6/36细胞或vero细胞)中得到。68.第四方面，本发明提供了一种重组病毒，该重组病毒的基因组rna对应的cdna序列与第一方面所述的dna分子的序列相同。69.第五方面，本发明提供一种制备上述重组病毒的方法，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组的第222-223位核苷酸之间插入nano荧光素酶的编码序列。70.第六方面，本发明提供一种上述dna分子和/或重组病毒在筛选黄热病毒治疗药物中的应用。71.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，“室温”是指25℃；限制性内切酶noti,nsii,xhoi购自neb公司；bhk-21细胞购自atcc，产品目录号为ccl-10；vero细胞购自atcc，产品目录号为ccl-81；黄热减毒疫苗株yf-17d购自北京天坛生物制品股份有限公司。72.实施例173.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的构建与鉴定。74.一、重组质粒pacnr-nluc-yf-17d的构建75.(1)以黄热病毒疫苗株yf-17d全长感染性克隆pacnr/flyf-17dx(由洛克菲勒大学的charlesm.rice教授惠赠，bredenbeekpj,kooiea,lindenbachb,huijkmann,ricecm,spaanwj.2003.astablefull-lengthyellowfeverviruscdnacloneandtheroleofconservedrnaelementsinflavivirusreplication.thejournalofgeneralvirology84:1261-1268.)和pnl1.1质粒(购自premega公司)为模板，通过oligo7软件设计出pcr引物序列，用普通pcr扩增出nluc基因片段，通过多次融合pcr将nluc报告基因插入到黄热病毒疫苗株yf-17d全长感染性克隆pacnr/flyf-17dx中，构建出黄热报告病毒全长感染性克隆pacnr-nluc-yf-17d。黄热报告病毒构建示意图如图1所示，其中nluc基因片段前复制保留c蛋白前34个aa的核苷酸序列，以保证5’端utr功能完整。引物序列如下所示。76.p-noti-f5′‑ccgaaaagtgccacctgac-3′(seqidno：5)77.p-yfc-nluc-b5′‑ccattccacttccgccaatttgttttgttttttgttttattttgtttgac-3′(seqidno：6)78.p-yfc-nluc-f5′‑attggcggaagtggaatggtcttcacactcgaagatt-3′(seqidno：7)79.p-nluc-2a-b5′‑acagctgtccagatcctgccagaatgcgttcgcac-3′(seqidno：8)80.p-nluc-2a-f5′‑gcaggatctggacagctgttgaattttgaccttct-3′(seqidno：9)81.p-nsii-b5′‑gcggcatgcggaggttcaaat-3′(seqidno：10)82.(2)通过融合pcr扩增携带nluc基因的目的片段：以pacnr/flyf-17dx质粒为模板，分别用p-noti-f与p-yfc-nluc-b，p-nluc-2a-f与p-nsii-b作为配对引物，扩增出a和c两个片段，同时以pnl1.1质粒为模板，用p-yfc-nluc-f与p-nluc-2a-b作为配对引物，扩增nluc基因片段，使用phusionhigh-fidelitypcrmastermixwithhfbuffer对上述片段pcr扩增。pcr扩增反应配方：2×phusionhigh-fidelitypcrmastermix25μl，两种质粒各自取0.5μl，按照上述配方，每条引物各2μl，使用双蒸水把反应总体积加至50μl。反应条件如下：83.预变性：1循环，98℃，30秒；84.变性：30循环，98℃，10秒；85.退火：30循环，55℃，20秒；86.延伸：30循环，72℃，50秒；87.终延伸：1循环，72℃，7分钟。88.通过琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物条带大小后回收上述目的片段pcr产物。方法如下：在1％琼脂糖凝胶中将pcr产物电泳分离后，在紫外灯照射下切下含有目的产物片段的凝胶，转移至新的1.5ml离心管中，加入1ml的bufferqg颠倒混匀，55℃水浴加热10-15分钟，观察并间断颠倒混匀至凝胶完全融化；待溶液冷却至室温后，把混合液转移到吸附柱中，用12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；加入500μlbufferqg，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；加入750μl按说明书要求加入乙醇的bufferpe，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；将吸附柱转移到新的收集管中，用12000rpm的转速离心2分钟后更换新的收集管，加入50μl双蒸水，室温静置1分钟后用12000rpm的转速离心1分钟，收集洗脱液，即是扩增的目的片段，放置-20℃保存。以pacnr/flyf-17dx质粒为模板，p-noti-f与p-yfc-nluc-b，p-nluc-2a-f与p-nsii-b作为配对引物扩增的目的产物分别为a片段和c片段，大小分别为514bp和1645bp。以pnl1.1质粒为模板，用p-yfc-nluc-f与p-nluc-2a-b作为配对引物扩增的目的产物为b片段，大小为543bp。89.融合pcr反应体系如下：2×phusionhigh-fidelitypcrmastermix25μl，a片段1μl，b片段2μl，使用双蒸水把反应总体积补加至48μl。反应条件如下：90.预变性：1循环，98℃，30秒；91.变性：10循环，98℃，10秒；92.退火：10循环，55℃，20秒；93.延伸：10循环，72℃，50秒；94.终延伸：1循环，72℃，7分钟。95.上述反应完成后，在反应体系中补加上下游引物p-noti-f与p-nluc-2a-b各2μl，反应条件如下：96.预变性：1循环，98℃，30秒；97.变性：30循环，98℃，10秒；98.退火：30循环，55℃，20秒；99.延伸：30循环，72℃，50秒；100.终延伸：1循环，72℃，7分钟。101.融合片段为ab片段，大小为1039bp。pcr产物回收方法同前所述。102.按照上述方法将ab片段和c片段融合，所用上下游引物分别为p-noti-f和p-nsii-b，融合pcr产物为abc片段，大小为2665bp。103.(3)携带nluc基因的重组黄热报告病毒全长cdna克隆质粒的构建104.将上述融合pcr产物abc片段与pacnr/flyf-17dx质粒分别用noti和nsii进行双酶切。两个酶切反应体系如下：融合pcr产物abc片段30μl或质粒pacnr/flyf-17dx30μl，noti2μl，nsii2μl，10×nebbuffer38μl，bsa0.8μl，分别用双蒸水补至80μl，37℃水浴加热反应3小时。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小后回收，方法和前述相同，用t4dna连接酶在4℃下连接13小时，反应体系如下：融合pcr产物abc片段1μl(约72ng)，pacnr/flyf-17dx质粒1μl(约43ng)，t4dna连接酶1μl，10×连接酶缓冲液1.5μl，加入6μl双蒸水将反应体系补足至15μl。根据测序结果得到重组质粒pacnr-nluc-yf-17d的结构如下：在pacnr/flyf-17dx载体的noti和nsii酶切位点之间插入了seqidno：1且，携带nluc基因的重组黄热报告病毒全长cdna的序列如seqidno：3所示。105.取大肠杆菌mc1061感受态细胞150μl，用上述获得的连接产物对其进行转化，表达连接产物。方法如下：把冻存的大肠杆菌mc1061感受态细胞150μl从-80℃冰箱取出，迅速放在碎冰块上静置10分钟，观察并确认感受态细胞融化后，与上述连接产物轻弹混匀后放在碎冰块里冰浴30分钟，42℃水浴热激90s，再放入碎冰里5分钟，把转化的感受态细胞与700μllb培养基混匀后，放置在37℃孵箱，180rpm的转速振荡培养90分钟，3000rpm的转速离心10分钟后，丢弃上清，收集沉淀出的感受态细胞，补加200μllb培养基，吹吸混匀细胞，将转化后的感受态细胞涂布在含amp抗生素的培养皿中，放在30℃孵箱中倒置培养20小时。根据菌落生长情况，挑取边界清晰的单菌落接种到含amp抗生素的lb培养基中，在30℃，170rpm培养箱中进行摇菌培养20小时后。进行质粒小提，过程如下：向吸附柱cp3中加入500μl的平衡液bl对吸附柱进行平衡，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；取1.5ml菌液，12000rmp离心1分钟后，吸弃上清，保留菌体沉淀；加入250μl含rnasea的溶液p1，反复吹吸重悬菌体；加入250μl溶液p2，充分混匀使菌体充分裂解；然后加入350μl溶液p3，手指轻弹离心管震荡混匀，待白色絮状沉淀析出后，室温静置2分钟后用12000rpm的转速离心10分钟；吸取上清加入到预先平衡过的吸附柱中，室温静置2分钟后用12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；加入600μl含80％乙醇的洗涤液，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液，重复漂洗1次；更换收集管，12000rpm的转速离心2分钟后，将吸附柱放置到新离心管中，室温静置2分钟，加入洗脱液eb50μl进行洗脱，静置2分钟后12000rpm的转速离心1分钟，收集洗脱液，4℃短期保存。106.(4)重组黄热报告病毒全长克隆质粒的双酶切鉴定107.将重组病毒全长克隆质粒用noti和nsii进行双酶切。酶切反应体系如下：质粒16μg，noti和nsii各4μl，bsa1μl，10×nebbuffer410μl，加入双蒸水把反应体系补至100μl，37℃水浴加热4小时后，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小，产生的两个片段大小分别为14000bp和2600bp。与预期一致，该质粒即为重组质粒pacnr-nluc-yf-17d，电泳结果见图2。108.二、重组黄热病毒nluc-yf-17d的拯救109.1、用限制性内切酶xhoi酶切重组质粒pacnr-nluc-yf-17d，进行线性化处理，回收线性化质粒。110.2、以步骤1的线性化质粒为模板，采用sp6ribomaxexpresslargescalernaproductionsystems(购自promega公司)体外转录试剂盒进行体外转录，然后采用rnase-freednasei(购自promega公司)纯化转录体rna，纯化后的转录体rna置于-80℃下冻存。111.3、用脂质体lipofectamine2000(购自invitrogen公司)将步骤2得到的转录体rna转染单层bhk-21细胞，方法如下：将15μl转录体rna与250μlopti-mem培养基(购自invitrogen公司)吹吸混匀，同时将6μl脂质体和250μl的opti-mem培养基吹吸混匀，室温静置5分钟；将以上两管混合液吹吸混匀，室温静置30分钟；向每孔细胞加入500μl混合液，并补加300μl新的opti-mem培养基；将6孔板(6孔板中已接种bhk-21细胞)置于37℃，5％co2孵箱中培养6小时后，吸弃上清，向每孔中加入2ml含2％fbs的dmem细胞培养液(购自invitrogen公司)，置于37℃，5％co2条件下培养，转染后第1、2和3天收取50μl培养上清，将培养上清重新接种于bhk-21细胞并进行培养，待细胞病变超过细胞总数的50％后，将细胞及培养液放在-80℃冰箱中完成1次冻融，离心收集细胞培养上清，即为重组黄热病毒种子液，置于-80℃保存。112.三、重组黄热病毒nluc-yf-17d的体外光信号检测113.用pbs把nano-glo荧光素酶底物(购自promega公司)稀释50倍，配制成为工作液。取重组黄热病毒种子液50μl和10μl工作液在48孔板中混合，震荡混匀，静置3分钟后将48孔板放入ivisspectrum成像室内拍照观察，参数如表1，扣除背景信号后，用livingimaging3.0对每孔的光信号进行定量分析。光信号检测检测结果如图3。从图3的结果可以看到光信号逐渐增强，表明经体外转录获得了具有感染性的rna，利用pacnr-nluc-yf-17d能够拯救出表达nluc基因的重组黄热病毒。114.表1成像参数115.项目参数成像模式自发光曝光时间3秒成像容差4激发光波长关闭发射光开启结构成像否视野d高度1.5116.实施例2117.本实施例用来说明采用ifa检测重组黄热病毒在bhk-21细胞的病毒蛋白表达。对实施例1中“二、重组黄热病毒nluc-yf-17d的拯救”部分得到的重组黄热病毒和黄热减毒疫苗株yf-17d进行如下测定：118.1、将bhk-21细胞传至预先放有盖玻片的6孔板中，在37℃，5％co2培养箱中培养至细胞覆盖面积达到80％左右，用拯救得到的重组黄热病毒以及黄热减毒疫苗株分别感染bhk-21细胞，感染后24小时将长有细胞的盖玻片取出，置于丙酮中固定30分钟，用pbs洗涤并晾干，即为抗原片，后置于-20℃冰箱保存。119.2、通过间接免疫荧光对bhk-21细胞中的病毒特异蛋白进行检测，方法如下：将步骤制备的抗原片取出，加入1:200稀释的黄病毒e蛋白鼠单抗(购自abcam)作为一抗，37℃孵育1小时后弃掉一抗溶液，用pbs振荡漂洗3次，每次5分钟。向抗原片上加入1:600稀释的alexafluor488标记山羊抗小鼠igg作为二抗，37℃孵育1小时，弃掉二抗溶液，用pbs振荡漂洗3次，每次5分钟。再向抗原片上加入dapi，室温孵育5分钟后用pbs振荡漂洗5分钟，弃掉pbs，将抗原片置于荧光显微镜下观察。120.间接免疫荧光的结果见图4。图4中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d。图4显示nluc-yf-17d与yf-17d均能够在bhk-21细胞中表达黄热病毒蛋白(均呈现绿色荧光)，二者蛋白表达效率相近，说明nluc基因不影响重组黄热病毒的蛋白表达效率。121.实施例3122.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的空斑特征。123.分别将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液和黄热减毒疫苗株yf-17d种子液进行如下检测：124.分别将nluc-yf-17d和yf-17d种子液用含2％fbs的dmem培养基(购自invitrogen公司)进行10倍梯度稀释(稀释度依次为10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6和10-7)。将各个稀释液分别以400μl/孔接种于铺于6孔板的单层bhk-21细胞，37℃、5％co2条件下静置1.5h，吸弃培养上清，在每个孔中加入琼脂盖(即含2％fbs和1％琼脂的dmem培养基)，37℃、5％co2条件下培养3d，然后用4％甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色10min，观察空斑形态，并计算空斑形成单位(pfu)。125.空斑形态观察结果的照片见图5。图5中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d，nluc-yf-17d和yf-17d黄热病毒均能够形成大小较为均一，边缘清晰的空斑，重组黄热病毒形成的空斑形态与黄热减毒疫苗株相似。126.实施例4127.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在体外的增殖能力。128.分别将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液和黄热减毒疫苗株yf-17d种子液进行如下检测：129.分别将两种病毒种子液以moi＝0.01的接种量接种12孔板中的vero细胞，37℃、5％co2孵育1h后，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，向每孔细胞补加1ml细胞维持液，将vero细胞置于37℃、5％co2条件下培养；分别于接种后12、24、36、48与60h收集细胞培养上清，置于-80℃冰箱保存。待完成所有样品收集后，用空斑法测定感染病毒后不同时间点细胞培养上清中的病毒滴度(方法同实施例3，均采用bhk-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为pfu/ml，即每毫升上清液中的病毒含量)，绘制生长曲线。130.生长曲线结果见图6。图6中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d，2种病毒在vero细胞上具有类似的增殖特性，均在感染后60h复制达到最高滴度，nluc-yf-17d与yf-17d在细胞培养上清中的最高滴度分别为106.4pfu/ml和106.7pfu/ml。结果表明，nluc基因的插入不影响病毒在体外的增殖能力。131.实施例5132.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的热稳定性。133.分别将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液和黄热减毒疫苗株yf-17d种子液进行如下检测：134.将两种病毒种子液均等分成为1000pfu的单位，在40℃下孵育0-35h不等，通过空斑法测定孵育不同时间后的病毒滴度(方法同实施例3)，绘制两种病毒在40℃下的感染性衰减曲线。135.感染性衰减曲线见图7，图7中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d，2种病毒在40℃下具有类似的热稳定性质，均在孵育35h后完全丧失感染性，nluc-yf-17d与yf-17d在40℃下的感染性半衰期分别是2.837h和3.392h。结果表明，nluc基因的插入不影响病毒在40℃下的热稳定性。136.实施例6137.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在细胞上表达的荧光素酶活性与病毒滴度的相关性。138.将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：139.将vero细胞传至12孔板中，置于37℃、5％co2条件下培养至细胞长成单层。弃掉培养上清，将重组黄热病毒按照moi＝0.1感染量接种于12孔板中的vero细胞，置于37℃，5％co2孵育1h后，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，向每孔细胞补加1ml细胞维持液，将vero细胞置于37℃，5％co2培养箱中培养。分别于接种后24、36、48与60h收集细胞培养上清，每个上清样本分成2份，置于-80℃冰箱保存。待完成所有样品收集后，用空斑法测定1份上清样本中的病毒滴度(方法同实施例3，均采用bhk-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为pfu/ml，即每毫升上清液中的病毒含量)，用体外荧光信号分析方法检测另1份样本上清中的荧光信号强度(见图8)，并绘制病毒滴度和荧光信号的线性回归曲线。140.线性回归曲线见图9，r2值大于0.9说明本发明制备的重组黄热病毒可以代表黄热病毒减毒株。141.实施例7142.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在体内表达的荧光素酶活性与病毒滴度的相关性。143.将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：144.重组黄热病毒nluc-yf-17d经颅内感染balb/c乳鼠，在感染后第1-5日里，分别取1-3只乳鼠，进行活体成像拍照观察，拍照结束后，立即在生物安全柜中处死并解剖乳鼠，用蚀斑法测定乳鼠鼠脑中的病毒滴度(方法同实施例3，均采用bhk-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为pfu/g)，绘制鼠脑中病毒滴度和荧光信号强度的线性回归曲线。145.重组黄热病毒nluc-yf-17d颅内感染balb/c乳鼠的活体成像见图10，线性回归曲线见图11。r2值大于0.9，说明本发明制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d可以代表黄热病毒减毒株。146.实施例8147.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的遗传稳定性。148.将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：149.将p0代nluc-yf-17d按照moi＝0.01的感染量接种于单层vero细胞，置于37℃，5％co2培养箱中培养，3d后收集细胞上清(第一代病毒液，p1)。重复以上步骤3次，收集每一代细胞培养上清，置于-80℃保存。150.用purelinkrnaminikit试剂盒(购自promega公司)提取每一传代病毒的rna，方法如下：取200μl病毒储备液置于1.5ml离心管中，加入200μl含1％β-巯基乙醇的lysisbuffer，振荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，振荡混匀后，将混合液转移到吸附柱中，12000rpm的转速离心20s，丢弃滤出液；向吸附柱中加入700μlwashbufferi，12000rpm的转速离心20s，丢弃滤出液；向吸附柱中加入500μl含乙醇的washbufferii，12000rpm的转速离心20s，丢弃滤出液，重复上述步骤一次；将吸附柱置于新的收集管中，12000rpm的转速离心2分钟；将吸附柱转移到干净的1.5ml离心管中，向吸附柱中央加入40μlrnase-freewater，室温静置1分钟后，12000rpm的转速离心1分钟，收集洗脱液，混匀后置于-80℃冰箱保存。151.以病毒储备液中提取的rna作为模板，nluc-f和nluc-b作为上下游引物，进行一步法rt-pcr反应，nluc-f引物序列为：agtaaatcctgtgtgctaat(seqidno：11)，nluc-b引物序列为：ccaccactctcttgactttc(seqidno：12)。方法如下：向pcr反应管中加入rna10μl，引物nluc-f和nluc-b各1μl，2xreactionmix25μl，superscriptiiirt/platinumtaqmix2μl，用双蒸水将体系补足至50μl；rt-pcr反应条件如下表2所示：152.表2rt-pcr反应参数[0153][0154]将pcr产物在1％琼脂糖凝胶中以100v电压电泳45m进行鉴定，电泳结果见图12。结果表明，外源性nluc基因在重组黄热病毒的传代过程中具有遗传稳定性。[0155]实施例9[0156]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d对乳鼠的感染作用。[0157]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0158]将重组黄热病毒nluc-yf-17d用含有10％fbs的dmem(购自invitrogen公司)稀释至50000pfu/ml，取1窝1日龄balb/c乳鼠(军事科学院军事医学研究院动物中心spf级)，经颅内注射20μl含有重组黄热病毒的dmem，即每只乳鼠接种1000pfu重组黄热病毒。在感染后1、3、5和7天，使用异氟烷(购自鲁南贝特制药公司)麻醉乳鼠，对每只乳鼠给予颅内和腹腔分别注射20μl和40μlnano-glo荧光素酶底物工作液，静置3分钟后，对乳鼠腹面和背面进行活体成像拍照观察，扣除背景光信号之后，用livingimaging3.0对发光部位进行定量分析。在感染后第7天，成像拍照后，立即处死并解剖2只濒死的乳鼠，取出脑、肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠和睾丸，置于平皿之中，对分离出的脏器再次成像拍照，观察重组黄热病毒的脏器分布。[0159]重组黄热病毒nluc-yf-17d在乳鼠体内的感染见图13，感染乳鼠后的光信号定量分析见图14，在乳鼠体内的脏器分布见图15，图13中，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d。结果表明，重组黄热病毒可以感染balb/c乳鼠，随着时间的增加，重组黄热病毒增殖导致光信号也逐渐增强，在感染后第5天，乳鼠腹侧开始检测到光信号。提示重组黄热病毒从颅内突破血脑屏障侵袭了内脏组织。在感染后第7天将濒死的乳鼠处死并解剖，对脏器进行成像拍照(见图15)，结果显示重组黄热病毒可以感染肝、脑、肠、脾和睾丸等多个脏器，其中脑内的光信号最强，说明重组黄热病毒nluc-yf-17d有很强的神经嗜性。[0160]实施例10[0161]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d经腹腔对成鼠的感染作用。[0162]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0163]用含有10％fbs的dmem将重组黄热病毒稀释至50000pfu/ml，分别取5只2周龄的a129和129小鼠，经腹腔注射20μl含有重组黄热病毒的dmem，即每只小鼠接种1000pfu重组黄热病毒。在感染后1、3和5d，使用异氟烷麻醉乳鼠，对每只小鼠给予颅内和腹腔分别注射20μl和60μlnano-glo荧光素酶底物工作液，静置3分钟后，对小鼠腹面和背面进行活体成像拍照观察，扣除背景光信号之后，用livingimaging3.0对发光部位进行定量分析。在感染后第5天，成像拍照后，立即处死并解剖2只a129和129鼠，取出脑、肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠和睾丸，置于平皿之中，对分离出的脏器再次成像拍照。[0164]重组黄热病毒nluc-yf-17d经腹腔感染129和a129小鼠的活体成像见图16，感染129和a129小鼠的光信号检测定量分析见图17，重组黄热病毒在129和a129小鼠体内的脏器分布见图18，感染129和a129小鼠的生存分析见图19。结果表明，重组黄热病毒可以经腹腔途径感染a129小鼠，并能侵袭到中枢神经系统，导致系统性感染，最终导致小鼠死亡，说明重组黄热病毒对a129小鼠有很强的内脏、神经嗜性和神经侵袭力。重组黄热病毒不能经腹腔感染129小鼠说明1型干扰素素在抵抗重组黄热病毒感染过程中有重要作用。[0165]实施例11[0166]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d体外光信号减少中和作用。[0167]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0168]用含有10％fbs的dmem将黄病毒e蛋白鼠单抗2a10g6单抗(购自abcam公司)分别稀释至58、11.6、2.32、0.464、0.0928、0.01856μg/ml。将上述浓度的抗体分别与1000pfu的重组黄热病毒混合，震荡混匀，置于37℃孵育1h，分别取每个2a10g6单抗稀释度的混合液500μl接种于24孔板中的bhk-21细胞单层，置于37℃，5％co2培养箱中吸附1h，期间每间隔20分钟轻轻摇匀一次。然后弃去每孔中的混合液，用pbs洗去残留混合液后弃掉上清，向每孔细胞补加500μl细胞维持液，置于37℃，5％co2培养箱培养。2天后，对培养上清进行体外荧光信号检测分析，绘制药物抑制曲线。[0169]单抗2a10g6对重组黄热病毒nluc-yf-17d的中和作用见图20，单抗2a10g6抑制重组黄热病毒的光信号定量分析见图21。从图21可以看出，随着抗体浓度的增加，光信号强度逐渐较弱，2a10g6单克隆抗体的最大浓度58μg/ml可以完全中和重组黄热病毒，完全检测不到光信号，计算得到ic50为4.234μg/ml。结果表明，2a10g6单克隆抗体对重组黄热病毒有很高的中和活性。[0170]实施例12[0171]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d体内光信号减少中和作用。[0172]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0173]用0.1mg2a10g6单抗和1000pfu的重组黄热病毒在含有10％fbs的dmem中混合，震荡混匀，置于37℃孵育1h，将混合液经颅内注射3只4周龄的a129小鼠。对照组a129小鼠经颅内注射同等量的dmem。将接种后的小鼠置于spf级饲养环境中，每天观察并记录小鼠发病及死亡情况。去掉因非实验因素死亡的小鼠，绘制颅内接种小鼠的生存曲线。在感染后1、3和5天后，使用异氟烷麻醉小鼠，对每只小鼠给予颅内和腹腔分别注射20μl和60μlnano-glo荧光素酶底物工作液，静置3分钟后，对小鼠腹面和背面进行活体成像拍照观察，扣除背景光信号之后，用livingimaging3.0对发光部位进行定量分析。[0174]2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内中和实验的光信号检测分析见图22，2a10g6单克隆抗体的中和实验的光信号定量分析见图23，2a10g6单克隆抗体的体内中和的生存曲线见图24。结果显示，2a10g6单克隆抗体组小鼠完全检测不到光信号，磷酸盐缓冲溶液(pbs)，对照组小鼠的光信号强度随着时间逐渐增加，在感染后第3天达到峰值(图22)，并且对照组小鼠在感染后第7天全部死亡，2a10g6单克隆抗体组无一只小鼠死亡(图24)，以上结果进一步证实了2a10g6单克隆抗体对重组黄热病毒的中和活性。[0175]实施例13[0176]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在药物筛选中的应用。[0177]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行分别进行如下检测：[0178](1)将bhk-21细胞传至12孔板中，使细胞长满单层；每孔细胞按照moi＝0.1接种重组黄热病毒，置于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，补加1ml维持液，同时加入药物nitd008(新加坡诺华传染病研究所赠送)，终浓度分别是100、20、4、0.8、0.16、0.032和0.0064μm，同等量的溶剂dmso(购自西格玛公司)作为对照；置于37℃、5％co2培养箱中培养，感染后48h，对培养上清进行体外荧光信号分析(见图25)，绘制替莫泊芬对重组黄热病毒的抑制曲线。[0179]荧光信号分析见图25，抑制曲线见图26。随着药物nitd008浓度的增加，光信号逐渐减弱，在最大药物浓度100μm的培养上清中完全检测不到光信号(见图25)，计算得到药物nitd008对重组黄热病毒的ic50＝18.05μm(见图26)。结果表明，nitd008在体外条件下对重组黄热病毒的增殖有抑制作用。[0180](2)将bhk-21细胞传至12孔板中，使细胞长满单层；每孔细胞按照moi＝0.1接种重组黄热病毒，置于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，补加1ml维持液，同时加入药物替莫卟酚(temoporfin，购自caymenchemicals公司)，终浓度分别是294、59、12、2.4、0.5和0.1μm，同等量的溶剂dmso(购自西格玛公司)作为对照；置于37℃、5％co2培养箱中培养，感染后48h，对培养上清进行体外荧光信号分析(见图27)，绘制替莫泊芬对重组黄热病毒的抑制曲线。[0181]荧光信号分析见图27，抑制曲线见图28。图27中，随着替莫泊芬浓度的增加，光信号逐渐减弱，在最大药物浓度100μm的培养上清中完全检测不到光信号)；图28中，计算得到替莫泊芬对重组黄热病毒的ic50＝2.950nm，结果表明，替莫泊芬在体外条件下对重组黄热病毒的增殖有抑制作用。[0182](3)将bhk-21细胞传至12孔板中，使细胞长至80％；加入药物25-羟基胆固醇(25hc，购自西格玛公司)，终浓度分别是25、12.5、2.5、0.5、0.1和0.02μm，同时同等量的溶剂dmso作为对照，置于37℃，5％co2培养箱中孵育8小时后，每孔细胞按照moi＝0.1接种重组黄热病毒，置于37℃，5％co2培养箱中孵育1小时，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，补加1ml维持液，置于37℃，5％co2培养箱中培养，感染后48小时，对培养上清进行体外荧光信号分析。绘制25hc对重组黄热病毒的抑制曲线。[0183]荧光信号分析见图29，抑制曲线见图30。随着25hc浓度的增加，光信号逐渐减弱，在最大药物浓度25μm的培养上清中完全检测不到光信号(图29)，计算得到25hc对重组黄热病毒的ic50＝6.001μm(图30)。结果说明，25hc在体外条件下对重组黄热病毒的增殖有抑制作用。[0184]以上实施例说明，本发明获得的重组黄热病毒能够代表亲本病毒用于对治疗黄热病毒药物进行筛选，方法高效快捷且操作简单。[0185]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。[0186]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。[0187]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。[0188]序列[0189]seqidno：1(nano荧光素酶的编码序列)共513bp[0190]atggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggca[0191]seqidno：2(插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列，下划线标注的是nano荧光素酶的编码序列)共1059bp[0192]atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggcggaagtggaatggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcaggatctggacagctgttgaattttgaccttcttaagcttgcgggagacgtcgagtccaaccctggccccatgtctggtcgtaaagctcagggaaaaacactcggagtaaacatggtacgtagaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggaaacagacctggaccttcaagaggtgttcaaggatttatctttttctttttgttcaacattttgactggaaaaaagatcacagcccacctaaagaggttgtggaaaatgctggacccaagacaaggcttggctgttctaaggaaagtcaagagagtggtggccagtttgatgagaggattgtcctcaaggaaacgccgttcccatgatgttctgactgtgcaattcctaattttgggaatgctgttgatgacgggtgga[0193]seqidno：3(nluc-yf-17d)共11558bp[0194]agtaaatcctgtgtgctaattgaggtgcattggtctgcaaatcgagttgctaggcaataaacacatttggattaattttaatcgttcgttgagcgattagcagagaactgaccagaacatgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggcggaagtggaatggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcaggatctggacagctgttgaattttgaccttcttaagcttgcgggagacgtcgagtccaaccctggccccatgtctggtcgtaaagctcagggaaaaacactcggagtaaacatggtacgtagaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggaaacagacctggaccttcaagaggtgttcaaggatttatctttttctttttgttcaacattttgactggaaaaaagatcacagcccacctaaagaggttgtggaaaatgctggacccaagacaaggcttggctgttctaaggaaagtcaagagagtggtggccagtttgatgagaggattgtcctcaaggaaacgccgttcccatgatgttctgactgtgcaattcctaattttgggaatgctgttgatgacgggtggagtgaccttggtgcggaaaaacagatggttgctcctaaatgtgacatctgaggacctcgggaaaacattctctgtgggcacaggcaactgcacaacaaacattttggaagccaagtactggtgcccagactcaatggaatacaactgtcccaatctcagtccaagagaggagccagatgacattgattgctggtgctatggggtggaaaacgttagagtcgcatatggtaagtgtgactcagcaggcaggtctaggaggtcaagaagggccattgacttgcctacgcatgaaaaccatggtttgaagacccggcaagaaaaatggatgactggaagaatgggtgaaaggcaactccaaaagattgagagatggttcgtgaggaaccccttttttgcagtgacggctctgaccattgcctaccttgtgggaagcaacatgacgcaacgagtcgtgattgccctactggtcttggctgttggtccggcctactcagctcactgcattggaattactgacagggatttcattgagggggtgcatggaggaacttgggtttcagctaccctggagcaagacaagtgtgtcactgttatggcccctgacaagccttcattggacatctcactagagacagtagccattgatagacctgctgaggtgaggaaagtgtgttacaatgcagttctcactcatgtgaagattaatgacaagtgccccagcactggagaggcccacctagctgaagagaacgaaggggacaatgcgtgcaagcgcacttattctgatagaggctggggcaatggctgtggcctatttgggaaagggagcattgtggcatgcgccaaattcacttgtgccaaatccatgagtttgtttgaggttgatcagaccaaaattcagtatgtcatcagagcacaattgcatgtaggggccaagcaggaaaattggaataccgacattaagactctcaagtttgatgccctgtcaggctcccaggaagtcgagttcattgggtatggaaaagctacactggaatgccaggtgcaaactgcggtggactttggtaacagttacatcgctgagatggaaacagagagctggatagtggacagacagtgggcccaggacttgaccctgccatggcagagtggaagtggcggggtgtggagagagatgcatcatcttgtcgaatttgaacctccgcatgccgccactatcagagtactggccctgggaaaccaggaaggctccttgaaaacagctcttactggcgcaatgagggttacaaaggacacaaatgacaacaacctttacaaactacatggtggacatgtttcttgcagagtgaaattgtcagctttgacactcaaggggacatcctacaaaatatgcactgacaaaatgttttttgtcaagaacccaactgacactggccatggcactgttgtgatgcaggtgaaagtgtcaaaaggagccccctgcaggattccagtgatagtagctgatgatcttacagcggcaatcaataaaggcattttggttacagttaaccccatcgcctcaaccaatgatgatgaagtgctgattgaggtgaacccaccttttggagacagctacattatcgttgggagaggagattcacgtctcacttaccagtggcacaaagagggaagctcaataggaaagttgttcactcagaccatgaaaggcgtggaacgcctggccgtcatgggagacaccgcctgggatttcagctccgctggagggttcttcacttcggttgggaaaggaattcatacggtgtttggctctgcctttcaggggctatttggcggcttgaactggataacaaaggtcatcatgggggcggtacttatatgggttggcatcaacacaagaaacatgacaatgtccatgagcatgatcttggtaggagtgatcatgatgtttttgtctctaggagttggggcggatcaaggatgcgccatcaactttggcaagagagagctcaagtgcggagatggtatcttcatatttagagactctgatgactggctgaacaagtactcatactatccagaagatcctgtgaagcttgcatcaatagtgaaagcctcttttgaagaagggaagtgtggcctaaattcagttgactcccttgagcatgagatgtggagaagcagggcagatgagatcaatgccatttttgaggaaaacgaggtggacatttctgttgtcgtgcaggatccaaagaatgtttaccagagaggaactcatccattttccagaattcgggatggtctgcagtatggttggaagacttggggtaagaaccttgtgttctccccagggaggaagaatggaagcttcatcatagatggaaagtccaggaaagaatgcccgttttcaaaccgggtctggaattctttccagatagaggagtttgggacgggagtgttcaccacacgcgtgtacatggacgcagtctttgaatacaccatagactgcgatggatctatcttgggtgcagcggtgaacggaaaaaagagtgcccatggctctccaacattttggatgggaagtcatgaagtaaatgggacatggatgatccacaccttggaggcattagattacaaggagtgtgagtggccactgacacatacgattggaacatcagttgaagagagtgaaatgttcatgccgagatcaatcggaggcccagttagctctcacaatcatatccctggatacaaggttcagacgaacggaccttggatgcaggtaccactagaagtgaagagagaagcttgcccagggactagcgtgatcattgatggcaactgtgatggacggggaaaatcaaccagatccaccacggatagcgggaaagttattcctgaatggtgttgccgctcctgcacaatgccgcctgtgagcttccatggtagtgatgggtgttggtatcccatggaaattaggccaaggaaaacgcatgaaagccatctggtgcgctcctgggttacagctggagaaatacatgctgtcccttttggtttggtgagcatgatgatagcaatggaagtggtcctaaggaaaagacagggaccaaagcaaatgttggttggaggagtagtgctcttgggagcaatgctggtcgggcaagtaactctccttgatttgctgaaactcacagtggctgtgggattgcatttccatgagatgaacaatggaggagacgccatgtatatggcgttgattgctgccttttcaatcagaccagggctgctcatcggctttgggctcaggaccctatggagccctcgggaacgccttgtgctgaccctaggagcagccatggtggagattgccttgggtggcgtgatgggcggcctgtggaagtatctaaatgcagtttctctctgcatcctgacaataaatgctgttgcttctaggaaagcatcaaataccatcttgcccctcatggctctgttgacacctgtcactatggctgaggtgagacttgccgcaatgttcttttgtgccgtggttatcataggggtccttcaccagaatttcaaggacacctccatgcagaagactatacctctggtggccctcacactcacatcttacctgggcttgacacaaccttttttgggcctgtgtgcatttctggcaacccgcatatttgggcgaaggagtatcccagtga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技术领域：
：1.本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种dna分子与重组病毒及它们的制备方法和用途，具体地，涉及一种dna分子及其制备方法与应用、重组病毒及其制备方法与应用。
背景技术：
：：2.黄热病毒(yellowfevervirus,yfv)属于黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链rna病毒。黄热病毒主要在非洲和美洲地区流行，我国时有输入病例，人类主要通过蚊子叮咬感染黄热病毒，感染黄热病毒可以导致致死性出血热。目前防治黄热病流行的手段主要是疫苗接种和蚊媒控制，没有可以用于治疗黄热病的抗病毒药物。3.近年来，黄热病毒作为一种再发传染病引起多次大爆发，如2016年的刚果和安哥拉黄热疫情，这些爆发的原因有：(1)人群中黄热疫苗接种率下降。(2)城镇化快速发展，人口集中度提高。(3)蚊媒控制力度下降，黄热病毒的蚊媒入侵城市环境。4.报告病毒是近年来新兴的一种病毒学研究工具。其原理是将报告基因插入到病毒基因组中，通过病毒复制产生报告蛋白，进一步利用激发荧光或生物发光量来检测报告蛋白的表达量，最终标定病毒的复制水平。报告病毒具有传统病毒学难以比拟的优势，主要包括：(1)用时短操作简便，实时获取报告病毒的荧光信后即可完成病毒表达水平的检测；(2)通量高，通过自动化荧光检测设备即可完成大量样本的检测，可用于抗病毒药物的高通量筛选；(3)结合活体成像技术可观察单一动物连续时间点中病毒在体内的复制增殖情况，实时再现病毒在体内的感染过程。5.nano荧光素酶(nano-luciferase)，简称nluc，在细胞或者生物体内，nano荧光素酶可以催化其特异的底物发生可以发光的化学反应，通过检测光信号可以确定nano荧光素酶的含量，进而对病毒颗粒实现定量的目的。nano荧光素酶与底物的化学反应产生的光信号高于rluc和gluc等荧光素酶约100倍，检测的灵敏度更高。但是，目前尚未有以nano荧光素酶为报告基因的重组黄热病毒的相关报道。技术实现要素：6.本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种能够用于制备表达nano荧光素酶的重组黄热病毒的dna分子与重组病毒以及它们的制备和用途。7.为了实现上述目的，第一方面，本发明一方面提供一种dna分子，该dna分子含有串联连接的5’非编码区序列、插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒。8.第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述dna分子的方法，该方法包括在黄热病毒基因组rna对应的cdna中衣壳蛋白c的编码序列中插入nano荧光素酶的编码序列。9.第三方面，本发明提供了含有第一方面所述dna分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。10.第四方面，本发明提供了一种重组病毒，该重组病毒的基因组rna对应的cdna序列与第一方面所述的dna分子的序列相同。11.第五方面，本发明提供一种制备上述重组病毒的方法，该方法包括在黄热病毒基因组的第222-223位核苷酸之间插入nano荧光素酶的编码序列。12.第六方面，本发明提供一种上述dna分子和/或重组病毒在筛选黄热病毒治疗药物中的应用。13.本发明提供的dna分子可用于构建重组病毒，从而获得能够表达nano荧光素酶的重组病毒，该重组病毒能够用于筛选黄热病毒治疗药物。本发明提供的重组病毒具有如下多方面的优点：(1)重组病毒能够在宿主细胞上形成形态清晰且大小均一的蚀斑，蚀斑形态与亲本病毒的蚀斑形态相似；(2)重组病毒体外增殖能力强，热稳定性好；(3)重组病毒与亲本病毒神经毒力相当；(4)利用重组病毒检测荧光信号强度的方法实现对病毒的定量测定，方法简单、快速、准确，可用于筛选药物或其他细胞实验，而且所有操作可以通过自动化的高通量仪器完成，节省了大量时间和人力。附图说明14.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：15.图1为黄热减毒疫苗株yf-17d和重组病毒的全长rna对应的cdna的结构示意图；16.图2为实施例1步骤一中携带nluc基因的黄热病毒全长感染性克隆质粒的双酶切琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，markerdl15000；17.图3为实施例1中重组黄热病毒的光信号检测结果；18.图4为实施例2中间接免疫荧光的结果；19.图5为实施例3中空斑试验的结果；20.图6为实施例4中重组黄热病毒在体外细胞内的增殖特征的测试结果；21.图7为实施例5中重组黄热病毒的热稳定性的测试结果；22.图8为实施例6中重组黄热病毒在vero细胞上的光信号；23.图9为实施例6中重组黄热病毒体外病毒滴度与光信号的相关性；24.图10为实施例7中重组黄热病毒颅内感染balb/c乳鼠的活体成像；25.图11为实施例7中重组黄热病毒体内病毒滴度与光信号的相关性；26.图12为实施例8中重组黄热病毒的遗传稳定性电泳结果；27.图13为实施例9中重组黄热病毒在乳鼠体内的感染；28.图14为实施例9中重组黄热病毒感染乳鼠后的光信号定量分析；29.图15为实施例9中重组黄热病毒在乳鼠体内的脏器分布；30.图16为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的活体成像；31.图17为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的光信号定量分析；32.图18为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的脏器分布；33.图19为实施例10中重组黄热病毒经腹腔感染129和a129小鼠的生存分析；34.图20为实施例11中单抗2a10g6对重组黄热病毒的中和作用；35.图21为实施例11中单抗2a10g6抑制重组黄热病毒的光信号定量分析；36.图22为实施例12中2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内中和实验的光信号检测分析；37.图23为实施例12中2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内的中和实验的光信号定量分析；38.图24为实施例12中2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内中和的生存曲线；39.图25为实施例13中nitd008对重组黄热病毒的光信号；40.图26为实施例13中nitd008抑制重组黄热病毒光信号曲线；41.图27为实施例13中替莫泊芬抑制对重组黄热病毒的光信号；42.图28为实施例13中替莫泊芬抑制重组黄热病毒光信号曲线；43.图29为实施例13中25hc抑制对重组黄热病毒的光信号；44.图30为实施例13中25hc抑制重组黄热病毒光信号曲线。具体实施方式45.以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。46.本发明中使用的“来源于”意指根据病毒的基因序列(rna)构建某蛋白的编码序列(dna)，并不限于从病毒基因组中提取获得基因序列，例如，来源于黄热病毒的序列是指与黄热病毒的基因序列具有90％以上(如92％、94％、96％、98％、99％，优选100％)的同一性的序列；“串联连接”是指将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸(或多肽)序列是连续的。47.第一方面，本发明提供的dna分子含有串联连接的5’非编码区序列、插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒。48.本发明的发明人发现，nluc基因分子量小，发光率高，尤其适用于报告基因，优选地，所述nano荧光素酶的编码序列如seqidno：1所示。49.本发明的发明人进一步发现，所述nano荧光素酶的编码序列位于衣壳蛋白c的编码序列的第102位核苷酸和第103位核苷酸之间，能够进一步保证5’非编码区的功能完整性。更优选地，所述插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列如seqidno：2所示。50.根据本发明所述的dna分子，优选地，所述黄热病毒为减毒株，更优选为黄热减毒疫苗株yf-17d。51.本发明所述的dna分子中，所述5’非编码区序列、衣壳蛋白c的编码序列、膜和膜蛋白前体prm的编码序列、包膜蛋白e的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列可以分别来源于同一基因型的黄热病毒，也可以来源于不同基因型的黄热病毒。52.根据本发明所述的dna分子，优选地，所述dna分子的核苷酸序列如seqidno：3所示。53.所述5’非编码区序列可以为seqidno：3中第1-118位所示的序列。54.所述插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列可以为seqidno：3中第119-1177位所示的序列。55.所述膜和膜蛋白前体prm的编码序列可以为seqidno：3中第1178-1669位所示的序列。56.所述包膜蛋白e的编码序列可以为seqidno：3中第1670-3148位所示的序列。57.所述非结构蛋白的编码序列可以为seqidno：3中第3149-11050位所示的序列。所述非结构蛋白的编码序列通常包括非结构蛋白ns1的编码序列、非结构蛋白ns2a的编码序列、非结构蛋白ns2b的编码序列、非结构蛋白ns3的编码序列、非结构蛋白ns4a的编码序列、非结构蛋白ns4b的编码序列和非结构蛋白ns5的编码序列。58.所述3’非编码区序列可以为seqidno：3中第11051-11556位所示的序列。59.本发明的发明人在研究中发现，将衣壳蛋白c的编码序列的某些位点进行无义突变，可以使所述的dna分子稳定性更高，所述衣壳蛋白c的编码序列的第726位核苷酸的碱基c突变为碱基a，第729位核苷酸的碱基g突变为碱基c，第732位核苷酸的碱基c突变为碱基a，第735位核苷酸的碱基c突变为碱基a，第738位核苷酸的碱基t突变为碱基c，第747位核苷酸的碱基a突变为碱基t，第748位核苷酸的碱基c突变为碱基a。60.第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的dna分子的方法，该方法包括在黄热病毒基因组rna对应的cdna中衣壳蛋白c的编码序列中插入nano荧光素酶的编码序列。61.进一步优选地，在黄热病毒基因组rna对应的cdna中衣壳蛋白c的编码序列中第102位核苷酸和第103位核苷酸之间插入nano荧光素酶的编码序列。62.第三方面，本发明提供了含有第一方面所述的dna分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。63.其中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明的dna分子相连获得。64.所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可为重组表达载体。根据本发明的一种实施方式，所述重组载体可以为pancr载体(序列如seqidno：4所示)的多克隆位点(如noti和xhoi)间插入有所述dna分子的重组载体。65.所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞(如bhk-21细胞或vero细胞)中而获得。66.所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株mc1061)中而获得。67.本发明的重组病毒可以通过将所述重组载体导入离体的哺乳动物细胞(如c6/36细胞或vero细胞)中得到。68.第四方面，本发明提供了一种重组病毒，该重组病毒的基因组rna对应的cdna序列与第一方面所述的dna分子的序列相同。69.第五方面，本发明提供一种制备上述重组病毒的方法，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组的第222-223位核苷酸之间插入nano荧光素酶的编码序列。70.第六方面，本发明提供一种上述dna分子和/或重组病毒在筛选黄热病毒治疗药物中的应用。71.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，“室温”是指25℃；限制性内切酶noti,nsii,xhoi购自neb公司；bhk-21细胞购自atcc，产品目录号为ccl-10；vero细胞购自atcc，产品目录号为ccl-81；黄热减毒疫苗株yf-17d购自北京天坛生物制品股份有限公司。72.实施例173.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的构建与鉴定。74.一、重组质粒pacnr-nluc-yf-17d的构建75.(1)以黄热病毒疫苗株yf-17d全长感染性克隆pacnr/flyf-17dx(由洛克菲勒大学的charlesm.rice教授惠赠，bredenbeekpj,kooiea,lindenbachb,huijkmann,ricecm,spaanwj.2003.astablefull-lengthyellowfeverviruscdnacloneandtheroleofconservedrnaelementsinflavivirusreplication.thejournalofgeneralvirology84:1261-1268.)和pnl1.1质粒(购自premega公司)为模板，通过oligo7软件设计出pcr引物序列，用普通pcr扩增出nluc基因片段，通过多次融合pcr将nluc报告基因插入到黄热病毒疫苗株yf-17d全长感染性克隆pacnr/flyf-17dx中，构建出黄热报告病毒全长感染性克隆pacnr-nluc-yf-17d。黄热报告病毒构建示意图如图1所示，其中nluc基因片段前复制保留c蛋白前34个aa的核苷酸序列，以保证5’端utr功能完整。引物序列如下所示。76.p-noti-f5′‑ccgaaaagtgccacctgac-3′(seqidno：5)77.p-yfc-nluc-b5′‑ccattccacttccgccaatttgttttgttttttgttttattttgtttgac-3′(seqidno：6)78.p-yfc-nluc-f5′‑attggcggaagtggaatggtcttcacactcgaagatt-3′(seqidno：7)79.p-nluc-2a-b5′‑acagctgtccagatcctgccagaatgcgttcgcac-3′(seqidno：8)80.p-nluc-2a-f5′‑gcaggatctggacagctgttgaattttgaccttct-3′(seqidno：9)81.p-nsii-b5′‑gcggcatgcggaggttcaaat-3′(seqidno：10)82.(2)通过融合pcr扩增携带nluc基因的目的片段：以pacnr/flyf-17dx质粒为模板，分别用p-noti-f与p-yfc-nluc-b，p-nluc-2a-f与p-nsii-b作为配对引物，扩增出a和c两个片段，同时以pnl1.1质粒为模板，用p-yfc-nluc-f与p-nluc-2a-b作为配对引物，扩增nluc基因片段，使用phusionhigh-fidelitypcrmastermixwithhfbuffer对上述片段pcr扩增。pcr扩增反应配方：2×phusionhigh-fidelitypcrmastermix25μl，两种质粒各自取0.5μl，按照上述配方，每条引物各2μl，使用双蒸水把反应总体积加至50μl。反应条件如下：83.预变性：1循环，98℃，30秒；84.变性：30循环，98℃，10秒；85.退火：30循环，55℃，20秒；86.延伸：30循环，72℃，50秒；87.终延伸：1循环，72℃，7分钟。88.通过琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物条带大小后回收上述目的片段pcr产物。方法如下：在1％琼脂糖凝胶中将pcr产物电泳分离后，在紫外灯照射下切下含有目的产物片段的凝胶，转移至新的1.5ml离心管中，加入1ml的bufferqg颠倒混匀，55℃水浴加热10-15分钟，观察并间断颠倒混匀至凝胶完全融化；待溶液冷却至室温后，把混合液转移到吸附柱中，用12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；加入500μlbufferqg，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；加入750μl按说明书要求加入乙醇的bufferpe，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；将吸附柱转移到新的收集管中，用12000rpm的转速离心2分钟后更换新的收集管，加入50μl双蒸水，室温静置1分钟后用12000rpm的转速离心1分钟，收集洗脱液，即是扩增的目的片段，放置-20℃保存。以pacnr/flyf-17dx质粒为模板，p-noti-f与p-yfc-nluc-b，p-nluc-2a-f与p-nsii-b作为配对引物扩增的目的产物分别为a片段和c片段，大小分别为514bp和1645bp。以pnl1.1质粒为模板，用p-yfc-nluc-f与p-nluc-2a-b作为配对引物扩增的目的产物为b片段，大小为543bp。89.融合pcr反应体系如下：2×phusionhigh-fidelitypcrmastermix25μl，a片段1μl，b片段2μl，使用双蒸水把反应总体积补加至48μl。反应条件如下：90.预变性：1循环，98℃，30秒；91.变性：10循环，98℃，10秒；92.退火：10循环，55℃，20秒；93.延伸：10循环，72℃，50秒；94.终延伸：1循环，72℃，7分钟。95.上述反应完成后，在反应体系中补加上下游引物p-noti-f与p-nluc-2a-b各2μl，反应条件如下：96.预变性：1循环，98℃，30秒；97.变性：30循环，98℃，10秒；98.退火：30循环，55℃，20秒；99.延伸：30循环，72℃，50秒；100.终延伸：1循环，72℃，7分钟。101.融合片段为ab片段，大小为1039bp。pcr产物回收方法同前所述。102.按照上述方法将ab片段和c片段融合，所用上下游引物分别为p-noti-f和p-nsii-b，融合pcr产物为abc片段，大小为2665bp。103.(3)携带nluc基因的重组黄热报告病毒全长cdna克隆质粒的构建104.将上述融合pcr产物abc片段与pacnr/flyf-17dx质粒分别用noti和nsii进行双酶切。两个酶切反应体系如下：融合pcr产物abc片段30μl或质粒pacnr/flyf-17dx30μl，noti2μl，nsii2μl，10×nebbuffer38μl，bsa0.8μl，分别用双蒸水补至80μl，37℃水浴加热反应3小时。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小后回收，方法和前述相同，用t4dna连接酶在4℃下连接13小时，反应体系如下：融合pcr产物abc片段1μl(约72ng)，pacnr/flyf-17dx质粒1μl(约43ng)，t4dna连接酶1μl，10×连接酶缓冲液1.5μl，加入6μl双蒸水将反应体系补足至15μl。根据测序结果得到重组质粒pacnr-nluc-yf-17d的结构如下：在pacnr/flyf-17dx载体的noti和nsii酶切位点之间插入了seqidno：1且，携带nluc基因的重组黄热报告病毒全长cdna的序列如seqidno：3所示。105.取大肠杆菌mc1061感受态细胞150μl，用上述获得的连接产物对其进行转化，表达连接产物。方法如下：把冻存的大肠杆菌mc1061感受态细胞150μl从-80℃冰箱取出，迅速放在碎冰块上静置10分钟，观察并确认感受态细胞融化后，与上述连接产物轻弹混匀后放在碎冰块里冰浴30分钟，42℃水浴热激90s，再放入碎冰里5分钟，把转化的感受态细胞与700μllb培养基混匀后，放置在37℃孵箱，180rpm的转速振荡培养90分钟，3000rpm的转速离心10分钟后，丢弃上清，收集沉淀出的感受态细胞，补加200μllb培养基，吹吸混匀细胞，将转化后的感受态细胞涂布在含amp抗生素的培养皿中，放在30℃孵箱中倒置培养20小时。根据菌落生长情况，挑取边界清晰的单菌落接种到含amp抗生素的lb培养基中，在30℃，170rpm培养箱中进行摇菌培养20小时后。进行质粒小提，过程如下：向吸附柱cp3中加入500μl的平衡液bl对吸附柱进行平衡，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；取1.5ml菌液，12000rmp离心1分钟后，吸弃上清，保留菌体沉淀；加入250μl含rnasea的溶液p1，反复吹吸重悬菌体；加入250μl溶液p2，充分混匀使菌体充分裂解；然后加入350μl溶液p3，手指轻弹离心管震荡混匀，待白色絮状沉淀析出后，室温静置2分钟后用12000rpm的转速离心10分钟；吸取上清加入到预先平衡过的吸附柱中，室温静置2分钟后用12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液；加入600μl含80％乙醇的洗涤液，12000rpm的转速离心1分钟，丢弃滤出液，重复漂洗1次；更换收集管，12000rpm的转速离心2分钟后，将吸附柱放置到新离心管中，室温静置2分钟，加入洗脱液eb50μl进行洗脱，静置2分钟后12000rpm的转速离心1分钟，收集洗脱液，4℃短期保存。106.(4)重组黄热报告病毒全长克隆质粒的双酶切鉴定107.将重组病毒全长克隆质粒用noti和nsii进行双酶切。酶切反应体系如下：质粒16μg，noti和nsii各4μl，bsa1μl，10×nebbuffer410μl，加入双蒸水把反应体系补至100μl，37℃水浴加热4小时后，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小，产生的两个片段大小分别为14000bp和2600bp。与预期一致，该质粒即为重组质粒pacnr-nluc-yf-17d，电泳结果见图2。108.二、重组黄热病毒nluc-yf-17d的拯救109.1、用限制性内切酶xhoi酶切重组质粒pacnr-nluc-yf-17d，进行线性化处理，回收线性化质粒。110.2、以步骤1的线性化质粒为模板，采用sp6ribomaxexpresslargescalernaproductionsystems(购自promega公司)体外转录试剂盒进行体外转录，然后采用rnase-freednasei(购自promega公司)纯化转录体rna，纯化后的转录体rna置于-80℃下冻存。111.3、用脂质体lipofectamine2000(购自invitrogen公司)将步骤2得到的转录体rna转染单层bhk-21细胞，方法如下：将15μl转录体rna与250μlopti-mem培养基(购自invitrogen公司)吹吸混匀，同时将6μl脂质体和250μl的opti-mem培养基吹吸混匀，室温静置5分钟；将以上两管混合液吹吸混匀，室温静置30分钟；向每孔细胞加入500μl混合液，并补加300μl新的opti-mem培养基；将6孔板(6孔板中已接种bhk-21细胞)置于37℃，5％co2孵箱中培养6小时后，吸弃上清，向每孔中加入2ml含2％fbs的dmem细胞培养液(购自invitrogen公司)，置于37℃，5％co2条件下培养，转染后第1、2和3天收取50μl培养上清，将培养上清重新接种于bhk-21细胞并进行培养，待细胞病变超过细胞总数的50％后，将细胞及培养液放在-80℃冰箱中完成1次冻融，离心收集细胞培养上清，即为重组黄热病毒种子液，置于-80℃保存。112.三、重组黄热病毒nluc-yf-17d的体外光信号检测113.用pbs把nano-glo荧光素酶底物(购自promega公司)稀释50倍，配制成为工作液。取重组黄热病毒种子液50μl和10μl工作液在48孔板中混合，震荡混匀，静置3分钟后将48孔板放入ivisspectrum成像室内拍照观察，参数如表1，扣除背景信号后，用livingimaging3.0对每孔的光信号进行定量分析。光信号检测检测结果如图3。从图3的结果可以看到光信号逐渐增强，表明经体外转录获得了具有感染性的rna，利用pacnr-nluc-yf-17d能够拯救出表达nluc基因的重组黄热病毒。114.表1成像参数115.项目参数成像模式自发光曝光时间3秒成像容差4激发光波长关闭发射光开启结构成像否视野d高度1.5116.实施例2117.本实施例用来说明采用ifa检测重组黄热病毒在bhk-21细胞的病毒蛋白表达。对实施例1中“二、重组黄热病毒nluc-yf-17d的拯救”部分得到的重组黄热病毒和黄热减毒疫苗株yf-17d进行如下测定：118.1、将bhk-21细胞传至预先放有盖玻片的6孔板中，在37℃，5％co2培养箱中培养至细胞覆盖面积达到80％左右，用拯救得到的重组黄热病毒以及黄热减毒疫苗株分别感染bhk-21细胞，感染后24小时将长有细胞的盖玻片取出，置于丙酮中固定30分钟，用pbs洗涤并晾干，即为抗原片，后置于-20℃冰箱保存。119.2、通过间接免疫荧光对bhk-21细胞中的病毒特异蛋白进行检测，方法如下：将步骤制备的抗原片取出，加入1:200稀释的黄病毒e蛋白鼠单抗(购自abcam)作为一抗，37℃孵育1小时后弃掉一抗溶液，用pbs振荡漂洗3次，每次5分钟。向抗原片上加入1:600稀释的alexafluor488标记山羊抗小鼠igg作为二抗，37℃孵育1小时，弃掉二抗溶液，用pbs振荡漂洗3次，每次5分钟。再向抗原片上加入dapi，室温孵育5分钟后用pbs振荡漂洗5分钟，弃掉pbs，将抗原片置于荧光显微镜下观察。120.间接免疫荧光的结果见图4。图4中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d。图4显示nluc-yf-17d与yf-17d均能够在bhk-21细胞中表达黄热病毒蛋白(均呈现绿色荧光)，二者蛋白表达效率相近，说明nluc基因不影响重组黄热病毒的蛋白表达效率。121.实施例3122.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的空斑特征。123.分别将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液和黄热减毒疫苗株yf-17d种子液进行如下检测：124.分别将nluc-yf-17d和yf-17d种子液用含2％fbs的dmem培养基(购自invitrogen公司)进行10倍梯度稀释(稀释度依次为10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6和10-7)。将各个稀释液分别以400μl/孔接种于铺于6孔板的单层bhk-21细胞，37℃、5％co2条件下静置1.5h，吸弃培养上清，在每个孔中加入琼脂盖(即含2％fbs和1％琼脂的dmem培养基)，37℃、5％co2条件下培养3d，然后用4％甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色10min，观察空斑形态，并计算空斑形成单位(pfu)。125.空斑形态观察结果的照片见图5。图5中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d，nluc-yf-17d和yf-17d黄热病毒均能够形成大小较为均一，边缘清晰的空斑，重组黄热病毒形成的空斑形态与黄热减毒疫苗株相似。126.实施例4127.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在体外的增殖能力。128.分别将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液和黄热减毒疫苗株yf-17d种子液进行如下检测：129.分别将两种病毒种子液以moi＝0.01的接种量接种12孔板中的vero细胞，37℃、5％co2孵育1h后，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，向每孔细胞补加1ml细胞维持液，将vero细胞置于37℃、5％co2条件下培养；分别于接种后12、24、36、48与60h收集细胞培养上清，置于-80℃冰箱保存。待完成所有样品收集后，用空斑法测定感染病毒后不同时间点细胞培养上清中的病毒滴度(方法同实施例3，均采用bhk-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为pfu/ml，即每毫升上清液中的病毒含量)，绘制生长曲线。130.生长曲线结果见图6。图6中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d，2种病毒在vero细胞上具有类似的增殖特性，均在感染后60h复制达到最高滴度，nluc-yf-17d与yf-17d在细胞培养上清中的最高滴度分别为106.4pfu/ml和106.7pfu/ml。结果表明，nluc基因的插入不影响病毒在体外的增殖能力。131.实施例5132.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的热稳定性。133.分别将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液和黄热减毒疫苗株yf-17d种子液进行如下检测：134.将两种病毒种子液均等分成为1000pfu的单位，在40℃下孵育0-35h不等，通过空斑法测定孵育不同时间后的病毒滴度(方法同实施例3)，绘制两种病毒在40℃下的感染性衰减曲线。135.感染性衰减曲线见图7，图7中，yf-17d代表黄热减毒疫苗株，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d，2种病毒在40℃下具有类似的热稳定性质，均在孵育35h后完全丧失感染性，nluc-yf-17d与yf-17d在40℃下的感染性半衰期分别是2.837h和3.392h。结果表明，nluc基因的插入不影响病毒在40℃下的热稳定性。136.实施例6137.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在细胞上表达的荧光素酶活性与病毒滴度的相关性。138.将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：139.将vero细胞传至12孔板中，置于37℃、5％co2条件下培养至细胞长成单层。弃掉培养上清，将重组黄热病毒按照moi＝0.1感染量接种于12孔板中的vero细胞，置于37℃，5％co2孵育1h后，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，向每孔细胞补加1ml细胞维持液，将vero细胞置于37℃，5％co2培养箱中培养。分别于接种后24、36、48与60h收集细胞培养上清，每个上清样本分成2份，置于-80℃冰箱保存。待完成所有样品收集后，用空斑法测定1份上清样本中的病毒滴度(方法同实施例3，均采用bhk-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为pfu/ml，即每毫升上清液中的病毒含量)，用体外荧光信号分析方法检测另1份样本上清中的荧光信号强度(见图8)，并绘制病毒滴度和荧光信号的线性回归曲线。140.线性回归曲线见图9，r2值大于0.9说明本发明制备的重组黄热病毒可以代表黄热病毒减毒株。141.实施例7142.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在体内表达的荧光素酶活性与病毒滴度的相关性。143.将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：144.重组黄热病毒nluc-yf-17d经颅内感染balb/c乳鼠，在感染后第1-5日里，分别取1-3只乳鼠，进行活体成像拍照观察，拍照结束后，立即在生物安全柜中处死并解剖乳鼠，用蚀斑法测定乳鼠鼠脑中的病毒滴度(方法同实施例3，均采用bhk-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为pfu/g)，绘制鼠脑中病毒滴度和荧光信号强度的线性回归曲线。145.重组黄热病毒nluc-yf-17d颅内感染balb/c乳鼠的活体成像见图10，线性回归曲线见图11。r2值大于0.9，说明本发明制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d可以代表黄热病毒减毒株。146.实施例8147.本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d的遗传稳定性。148.将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：149.将p0代nluc-yf-17d按照moi＝0.01的感染量接种于单层vero细胞，置于37℃，5％co2培养箱中培养，3d后收集细胞上清(第一代病毒液，p1)。重复以上步骤3次，收集每一代细胞培养上清，置于-80℃保存。150.用purelinkrnaminikit试剂盒(购自promega公司)提取每一传代病毒的rna，方法如下：取200μl病毒储备液置于1.5ml离心管中，加入200μl含1％β-巯基乙醇的lysisbuffer，振荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，振荡混匀后，将混合液转移到吸附柱中，12000rpm的转速离心20s，丢弃滤出液；向吸附柱中加入700μlwashbufferi，12000rpm的转速离心20s，丢弃滤出液；向吸附柱中加入500μl含乙醇的washbufferii，12000rpm的转速离心20s，丢弃滤出液，重复上述步骤一次；将吸附柱置于新的收集管中，12000rpm的转速离心2分钟；将吸附柱转移到干净的1.5ml离心管中，向吸附柱中央加入40μlrnase-freewater，室温静置1分钟后，12000rpm的转速离心1分钟，收集洗脱液，混匀后置于-80℃冰箱保存。151.以病毒储备液中提取的rna作为模板，nluc-f和nluc-b作为上下游引物，进行一步法rt-pcr反应，nluc-f引物序列为：agtaaatcctgtgtgctaat(seqidno：11)，nluc-b引物序列为：ccaccactctcttgactttc(seqidno：12)。方法如下：向pcr反应管中加入rna10μl，引物nluc-f和nluc-b各1μl，2xreactionmix25μl，superscriptiiirt/platinumtaqmix2μl，用双蒸水将体系补足至50μl；rt-pcr反应条件如下表2所示：152.表2rt-pcr反应参数[0153][0154]将pcr产物在1％琼脂糖凝胶中以100v电压电泳45m进行鉴定，电泳结果见图12。结果表明，外源性nluc基因在重组黄热病毒的传代过程中具有遗传稳定性。[0155]实施例9[0156]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d对乳鼠的感染作用。[0157]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0158]将重组黄热病毒nluc-yf-17d用含有10％fbs的dmem(购自invitrogen公司)稀释至50000pfu/ml，取1窝1日龄balb/c乳鼠(军事科学院军事医学研究院动物中心spf级)，经颅内注射20μl含有重组黄热病毒的dmem，即每只乳鼠接种1000pfu重组黄热病毒。在感染后1、3、5和7天，使用异氟烷(购自鲁南贝特制药公司)麻醉乳鼠，对每只乳鼠给予颅内和腹腔分别注射20μl和40μlnano-glo荧光素酶底物工作液，静置3分钟后，对乳鼠腹面和背面进行活体成像拍照观察，扣除背景光信号之后，用livingimaging3.0对发光部位进行定量分析。在感染后第7天，成像拍照后，立即处死并解剖2只濒死的乳鼠，取出脑、肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠和睾丸，置于平皿之中，对分离出的脏器再次成像拍照，观察重组黄热病毒的脏器分布。[0159]重组黄热病毒nluc-yf-17d在乳鼠体内的感染见图13，感染乳鼠后的光信号定量分析见图14，在乳鼠体内的脏器分布见图15，图13中，nluc-yf-17d代表重组黄热病毒nluc-yf-17d。结果表明，重组黄热病毒可以感染balb/c乳鼠，随着时间的增加，重组黄热病毒增殖导致光信号也逐渐增强，在感染后第5天，乳鼠腹侧开始检测到光信号。提示重组黄热病毒从颅内突破血脑屏障侵袭了内脏组织。在感染后第7天将濒死的乳鼠处死并解剖，对脏器进行成像拍照(见图15)，结果显示重组黄热病毒可以感染肝、脑、肠、脾和睾丸等多个脏器，其中脑内的光信号最强，说明重组黄热病毒nluc-yf-17d有很强的神经嗜性。[0160]实施例10[0161]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d经腹腔对成鼠的感染作用。[0162]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0163]用含有10％fbs的dmem将重组黄热病毒稀释至50000pfu/ml，分别取5只2周龄的a129和129小鼠，经腹腔注射20μl含有重组黄热病毒的dmem，即每只小鼠接种1000pfu重组黄热病毒。在感染后1、3和5d，使用异氟烷麻醉乳鼠，对每只小鼠给予颅内和腹腔分别注射20μl和60μlnano-glo荧光素酶底物工作液，静置3分钟后，对小鼠腹面和背面进行活体成像拍照观察，扣除背景光信号之后，用livingimaging3.0对发光部位进行定量分析。在感染后第5天，成像拍照后，立即处死并解剖2只a129和129鼠，取出脑、肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠和睾丸，置于平皿之中，对分离出的脏器再次成像拍照。[0164]重组黄热病毒nluc-yf-17d经腹腔感染129和a129小鼠的活体成像见图16，感染129和a129小鼠的光信号检测定量分析见图17，重组黄热病毒在129和a129小鼠体内的脏器分布见图18，感染129和a129小鼠的生存分析见图19。结果表明，重组黄热病毒可以经腹腔途径感染a129小鼠，并能侵袭到中枢神经系统，导致系统性感染，最终导致小鼠死亡，说明重组黄热病毒对a129小鼠有很强的内脏、神经嗜性和神经侵袭力。重组黄热病毒不能经腹腔感染129小鼠说明1型干扰素素在抵抗重组黄热病毒感染过程中有重要作用。[0165]实施例11[0166]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d体外光信号减少中和作用。[0167]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0168]用含有10％fbs的dmem将黄病毒e蛋白鼠单抗2a10g6单抗(购自abcam公司)分别稀释至58、11.6、2.32、0.464、0.0928、0.01856μg/ml。将上述浓度的抗体分别与1000pfu的重组黄热病毒混合，震荡混匀，置于37℃孵育1h，分别取每个2a10g6单抗稀释度的混合液500μl接种于24孔板中的bhk-21细胞单层，置于37℃，5％co2培养箱中吸附1h，期间每间隔20分钟轻轻摇匀一次。然后弃去每孔中的混合液，用pbs洗去残留混合液后弃掉上清，向每孔细胞补加500μl细胞维持液，置于37℃，5％co2培养箱培养。2天后，对培养上清进行体外荧光信号检测分析，绘制药物抑制曲线。[0169]单抗2a10g6对重组黄热病毒nluc-yf-17d的中和作用见图20，单抗2a10g6抑制重组黄热病毒的光信号定量分析见图21。从图21可以看出，随着抗体浓度的增加，光信号强度逐渐较弱，2a10g6单克隆抗体的最大浓度58μg/ml可以完全中和重组黄热病毒，完全检测不到光信号，计算得到ic50为4.234μg/ml。结果表明，2a10g6单克隆抗体对重组黄热病毒有很高的中和活性。[0170]实施例12[0171]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d体内光信号减少中和作用。[0172]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行如下检测：[0173]用0.1mg2a10g6单抗和1000pfu的重组黄热病毒在含有10％fbs的dmem中混合，震荡混匀，置于37℃孵育1h，将混合液经颅内注射3只4周龄的a129小鼠。对照组a129小鼠经颅内注射同等量的dmem。将接种后的小鼠置于spf级饲养环境中，每天观察并记录小鼠发病及死亡情况。去掉因非实验因素死亡的小鼠，绘制颅内接种小鼠的生存曲线。在感染后1、3和5天后，使用异氟烷麻醉小鼠，对每只小鼠给予颅内和腹腔分别注射20μl和60μlnano-glo荧光素酶底物工作液，静置3分钟后，对小鼠腹面和背面进行活体成像拍照观察，扣除背景光信号之后，用livingimaging3.0对发光部位进行定量分析。[0174]2a10g6单克隆抗体基于重组黄热病毒的体内中和实验的光信号检测分析见图22，2a10g6单克隆抗体的中和实验的光信号定量分析见图23，2a10g6单克隆抗体的体内中和的生存曲线见图24。结果显示，2a10g6单克隆抗体组小鼠完全检测不到光信号，磷酸盐缓冲溶液(pbs)，对照组小鼠的光信号强度随着时间逐渐增加，在感染后第3天达到峰值(图22)，并且对照组小鼠在感染后第7天全部死亡，2a10g6单克隆抗体组无一只小鼠死亡(图24)，以上结果进一步证实了2a10g6单克隆抗体对重组黄热病毒的中和活性。[0175]实施例13[0176]本实施例用来说明重组黄热病毒nluc-yf-17d在药物筛选中的应用。[0177]将实施例1制备的重组黄热病毒nluc-yf-17d种子液进行分别进行如下检测：[0178](1)将bhk-21细胞传至12孔板中，使细胞长满单层；每孔细胞按照moi＝0.1接种重组黄热病毒，置于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，补加1ml维持液，同时加入药物nitd008(新加坡诺华传染病研究所赠送)，终浓度分别是100、20、4、0.8、0.16、0.032和0.0064μm，同等量的溶剂dmso(购自西格玛公司)作为对照；置于37℃、5％co2培养箱中培养，感染后48h，对培养上清进行体外荧光信号分析(见图25)，绘制替莫泊芬对重组黄热病毒的抑制曲线。[0179]荧光信号分析见图25，抑制曲线见图26。随着药物nitd008浓度的增加，光信号逐渐减弱，在最大药物浓度100μm的培养上清中完全检测不到光信号(见图25)，计算得到药物nitd008对重组黄热病毒的ic50＝18.05μm(见图26)。结果表明，nitd008在体外条件下对重组黄热病毒的增殖有抑制作用。[0180](2)将bhk-21细胞传至12孔板中，使细胞长满单层；每孔细胞按照moi＝0.1接种重组黄热病毒，置于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，补加1ml维持液，同时加入药物替莫卟酚(temoporfin，购自caymenchemicals公司)，终浓度分别是294、59、12、2.4、0.5和0.1μm，同等量的溶剂dmso(购自西格玛公司)作为对照；置于37℃、5％co2培养箱中培养，感染后48h，对培养上清进行体外荧光信号分析(见图27)，绘制替莫泊芬对重组黄热病毒的抑制曲线。[0181]荧光信号分析见图27，抑制曲线见图28。图27中，随着替莫泊芬浓度的增加，光信号逐渐减弱，在最大药物浓度100μm的培养上清中完全检测不到光信号)；图28中，计算得到替莫泊芬对重组黄热病毒的ic50＝2.950nm，结果表明，替莫泊芬在体外条件下对重组黄热病毒的增殖有抑制作用。[0182](3)将bhk-21细胞传至12孔板中，使细胞长至80％；加入药物25-羟基胆固醇(25hc，购自西格玛公司)，终浓度分别是25、12.5、2.5、0.5、0.1和0.02μm，同时同等量的溶剂dmso作为对照，置于37℃，5％co2培养箱中孵育8小时后，每孔细胞按照moi＝0.1接种重组黄热病毒，置于37℃，5％co2培养箱中孵育1小时，吸弃病毒上清，用pbs洗去残留病毒液后弃掉上清，补加1ml维持液，置于37℃，5％co2培养箱中培养，感染后48小时，对培养上清进行体外荧光信号分析。绘制25hc对重组黄热病毒的抑制曲线。[0183]荧光信号分析见图29，抑制曲线见图30。随着25hc浓度的增加，光信号逐渐减弱，在最大药物浓度25μm的培养上清中完全检测不到光信号(图29)，计算得到25hc对重组黄热病毒的ic50＝6.001μm(图30)。结果说明，25hc在体外条件下对重组黄热病毒的增殖有抑制作用。[0184]以上实施例说明，本发明获得的重组黄热病毒能够代表亲本病毒用于对治疗黄热病毒药物进行筛选，方法高效快捷且操作简单。[0185]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。[0186]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。[0187]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。[0188]序列[0189]seqidno：1(nano荧光素酶的编码序列)共513bp[0190]atggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggca[0191]seqidno：2(插入有nano荧光素酶的编码序列的衣壳蛋白c的编码序列，下划线标注的是nano荧光素酶的编码序列)共1059bp[0192]atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggcggaagtggaatggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcaggatctggacagctgttgaattttgaccttcttaagcttgcgggagacgtcgagtccaaccctggccccatgtctggtcgtaaagctcagggaaaaacactcggagtaaacatggtacgtagaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggaaacagacctggaccttcaagaggtgttcaaggatttatctttttctttttgttcaacattttgactggaaaaaagatcacagcccacctaaagaggttgtggaaaatgctggacccaagacaaggcttggctgttctaaggaaagtcaagagagtggtggccagtttgatgagaggattgtcctcaaggaaacgccgttcccatgatgttctgactgtgcaattcctaattttgggaatgctgttgatgacgggtgga[0193]seqidno：3(nluc-yf-17d)共11558bp[0194]agtaaatcctgtgtgctaattgaggtgcattggtctgcaaatcgagttgctaggcaataaacacatttggattaattttaatcgttcgttgagcgattagcagagaactgaccagaacatgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggcggaagtggaatggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcaggatctggacagctgttgaattttgaccttcttaagcttgcgggagacgtcgagtccaaccctggccccatgtctggtcgtaaagctcagggaaaaacactcggagtaaacatggtacgtagaggagttcgctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggaaacagacctggaccttcaagaggtgttcaaggatttatctttttctttttgttcaacattttgactggaaaaaagatcacagcccacctaaagaggttgtggaaaatgctggacccaagacaaggcttggctgttctaaggaaagtcaagagagtggtggccagtttgatgagaggattgtcctcaaggaaacgccgttcccatgatgttctgactgtgcaattcctaattttgggaatgctgttgatgacgggtggagtgaccttggtgcggaaaaacagatggttgctcctaaatgtgacatctgaggacctcgggaaaacattctctgtgggcacaggcaactgcacaacaaacattttggaagccaagtactggtgcccagactcaatggaatacaactgtcccaatctcagtccaagagaggagccagatgacattgattgctggtgctatggggtggaaaacgttagagtcgcatatggtaagtgtgactcagcaggcaggtctaggaggtcaagaagggccattgacttgcctacgcatgaaaaccatggtttgaagacccggcaagaaaaatggatgactggaagaatgggtgaaaggcaactccaaaagattgagagatggttcgtgaggaaccccttttttgcagtgacggctctgaccattgcctaccttgtgggaagcaacatgacgcaacgagtcgtgattgccctactggtcttggctgttggtccggcctactcagctcactgcattggaattactgacagggatttcattgagggggtgcatggaggaacttgggtttcagctaccctggagcaagacaagtgtgtcactgttatggcccctgacaagccttcattggacatctcactagagacagtagccattgatagacctgctgaggtgaggaaagtgtgttacaatgcagttctcactcatgtgaagattaatgacaagtgccccagcactggagaggcccacctagctgaagagaacgaaggggacaatgcgtgcaagcgcacttattctgatagaggctggggcaatggctgtggcctatttgggaaagggagcattgtggcatgcgccaaattcacttgtgccaaatccatgagtttgtttgaggttgatcagaccaaaattcagtatgtcatcagagcacaattgcatgtaggggccaagcaggaaaattggaataccgacattaagactctcaagtttgatgccctgtcaggctcccaggaagtcgagttcattgggtatggaaaagctacactggaatgccaggtgcaaactgcggtggactttggtaacagttacatcgctgagatggaaacagagagctggatagtggacagacagtgggcccaggacttgaccctgccatggcagagtggaagtggcggggtgtggagagagatgcatcatcttgtcgaatttgaacctccgcatgccgccactatcagagtactggccctgggaaaccaggaaggctccttgaaaacagctcttactggcgcaatgagggttacaaaggacacaaatgacaacaacctttacaaactacatggtggacatgtttcttgcagagtgaaattgtcagctttgacactcaaggggacatcctacaaaatatgcactgacaaaatgttttttgtcaagaacccaactgacactggccatggcactgttgtgatgcaggtgaaagtgtcaaaaggagccccctgcaggattccagtgatagtagctgatgatcttacagcggcaatcaataaaggcattttggttacagttaaccccatcgcctcaaccaatgatgatgaagtgctgattgaggtgaacccaccttttggagacagctacattatcgttgggagaggagattcacgtctcacttaccagtggcacaaagagggaagctcaataggaaagttgttcactcagaccatgaaaggcgtggaacgcctggccgtcatgggagacaccgcctgggatttcagctccgctggagggttcttcacttcggttgggaaaggaattcatacggtgtttggctctgcctttcaggggctatttggcggcttgaactggataacaaaggtcatcatgggggcggtacttatatgggttggcatcaacacaagaaacatgacaatgtccatgagcatgatcttggtaggagtgatcatgatgtttttgtctctaggagttggggcggatcaaggatgcgccatcaactttggcaagagagagctcaagtgcggagatggtatcttcatatttagagactctgatgactggctgaacaagtactcatactatccagaagatcctgtgaagcttgcatcaatagtgaaagcctcttttgaagaagggaagtgtggcctaaattcagttgactcccttgagcatgagatgtggagaagcagggcagatgagatcaatgccatttttgaggaaaacgaggtggacatttctgttgtcgtgcaggatccaaagaatgtttaccagagaggaactcatccattttccagaattcgggatggtctgcagtatggttggaagacttggggtaagaaccttgtgttctccccagggaggaagaatggaagcttcatcatagatggaaagtccaggaaagaatgcccgttttcaaaccgggtctggaattctttccagatagaggagtttgggacgggagtgttcaccacacgcgtgtacatggacgcagtctttgaatacaccatagactgcgatggatctatcttgggtgcagcggtgaacggaaaaaagagtgcccatggctctccaacattttggatgggaagtcatgaagtaaatgggacatggatgatccacaccttggaggcattagattacaaggagtgtgagtggccactgacacatacgattggaacatcagttgaagagagtgaaatgttcatgccgagatcaatcggaggcccagttagctctcacaatcatatccctggatacaaggttcagacgaacggaccttggatgcaggtaccactagaagtgaagagagaagcttgcccagggactagcgtgatcattgatggcaactgtgatggacggggaaaatcaaccagatccaccacggatagcgggaaagttattcctgaatggtgttgccgctcctgcacaatgccgcctgtgagcttccatggtagtgatgggtgttggtatcccatggaaattaggccaaggaaaacgcatgaaagccatctggtgcgctcctgggttacagctggagaaatacatgctgtcccttttggtttggtgagcatgatgatagcaatggaagtggtcctaaggaaaagacagggaccaaagcaaatgttggttggaggagtagtgctcttgggagcaatgctggtcgggcaagtaactctccttgatttgctgaaactcacagtggctgtgggattgcatttccatgagatgaacaatggaggagacgccatgtatatggcgttgattgctgccttttcaatcagaccagggctgctcatcggctttgggctcaggaccctatggagccctcgggaacgccttgtgctgaccctaggagcagccatggtggagattgccttgggtggcgtgatgggcggcctgtggaagtatctaaatgcagtttctctctgcatcctgacaataaatgctgttgcttctaggaaagcatcaaataccatcttgcccctcatggctctgttgacacctgtcactatggctgaggtgagacttgccgcaatgttcttttgtgccgtggttatcataggggtccttcaccagaatttcaaggacacctccatgcagaagactatacctctggtggccctcacactcacatcttacctgggcttgacacaaccttttttgggcctgtgtgcatttctggcaacccgcatatttgggcgaaggagtatcccagtga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再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。