甜菊糖苷的改进分离的制作方法

1.本公开涉及食品成分领域，具体涉及甜味剂，更具体涉及甜菊糖苷及其改进的分离。


背景技术：

2.多年生草本植物甜叶菊(stevia rebaudiana bertoni)的叶子积聚大量甜味强的化合物，所述化合物被称为甜菊糖苷(steviol glycoside)。虽然这些化合物的生物学功能尚不清楚，但它们作为替代性高效甜味剂具有商业意义。这些甜的甜菊糖苷的功能和感官特性似乎优于许多高效甜味剂的功能和感官特性。此外，研究表明蛇菊苷能够降低ii型糖尿病患者的血糖水平并且能够降低轻度高血压患者的血压。
3.甜菊糖苷在甜叶菊的叶中积聚，在叶中它们可能占叶干重的10％至20％。蛇菊苷(stevioside)和莱鲍迪甙a(rebaudioside a)均为热和ph稳定的，并且适用于碳酸饮料和许多其他食品中。蛇菊苷比蔗糖甜110至270倍，莱鲍迪甙a比蔗糖甜150至320倍。此外，莱鲍迪甙d(rebaudioside d)也是一种高效的二萜糖苷甜味剂，其在甜叶菊的叶中积聚。它可能比蔗糖甜约200倍。莱鲍迪甙m(reb m)是一种高效的二萜糖苷甜味剂。它在某些甜叶菊变种的叶中以痕量存在，但已被提出如果与其他甜菊糖苷相比则具有优良的口味特性。具体地，莱鲍迪甙m似乎缺乏其他甜菊糖苷，特别是莱鲍迪甙a所典型的苦、甘草后味。
4.传统上从甜叶菊(stevia)植株中提取甜菊糖苷。在甜叶菊中，赤霉酸(gibberellic acid，ga)生物合成中的中间体(-)-贝壳杉烯酸被转化为四环二萜甜菊醇，该四环二萜甜菊醇然后通过多步糖基化途径前进以形成各种甜菊糖苷。
5.在甜叶菊植株中，产量可能为可变的，并受农业和环境条件的影响。此外，如果与莱鲍迪甙a相比则具有改善的甜味和感官特性的莱鲍迪甙d和莱鲍迪甙m，仅以痕量存在于植物提取物中。
6.因此，最近，人们对使用发酵方法生产甜菊糖苷的兴趣日益浓厚。wo2013/110673和wo2015/007748描述了可用于生产至少甜菊糖苷(例如莱鲍迪甙a、莱鲍迪甙d和莱鲍迪甙m)的微生物。莱鲍迪甙m可用于各种甜叶菊组合物中，无论所述甜叶菊组合物是从甜叶菊叶获得还是通过发酵获得的(参见例如wo2015007748)。
7.甜菊糖苷，尤其是莱鲍迪甙m的有限溶解性在重组细胞发酵经适当转化以产生此类甜菊糖苷期间可能是有问题的，并且分离可能受到损害，因为沉淀的甜菊糖苷将与重组细胞混合，尤其是在离心以从包含甜菊糖苷的上清液中分离细胞期间。
8.dong和yang(“characterization of a new hemihydrate rebaudioside b crystal having lower aqueous solubility",food chemistry,elsevier ltd,nl,vol.304,125444,29august 2019)描述了水溶解度低至50ppm的莱鲍迪甙b的新半水合物晶体形式的分离。这种新晶体形式是在加热以溶解并随后将0.06％reb b溶液冷却至室温后获得的。
9.wo2016/100689 a1公开了四种包含7或8个糖部分的新甜菊糖苷，其中所述甜菊糖
苷包含通过糖苷键附接到甜菊醇主链的13位碳的四个糖单元的支链。即使在低浓度下，化合物1至4的存在也显示出对组合物中reb d和reb m的水溶性的积极影响。
10.因此，迫切需要改进发酵产生的甜菊糖苷，尤其是莱鲍迪甙m的分离。
附图说明
11.图1描绘了离心后细胞顶部的一层白色甜菊糖苷晶体。


技术实现要素：

12.本公开涉及一种用于产生一种或多种甜菊糖苷的方法，其中将能够产生一种或多种甜菊糖苷的重组细胞在合适的培养基中培养，所述培养在产生所述一种或多种甜菊糖苷且其中一种或多种甜菊糖苷从培养液中沉淀出来的条件下进行，所述方法包括处理培养液，使得沉淀的一种或多种甜菊糖苷至少部分地重新溶解，优选地，其中基本上所有的所述一种或多种甜菊糖苷重新溶解。
具体实施方式
13.在第一方面中，本发明提供了一种用于产生一种或多种甜菊糖苷的方法，其中将能够产生一种或多种甜菊糖苷的重组细胞在合适的培养基中培养，所述培养在产生所述一种或多种甜菊糖苷并且其中一种或多种甜菊糖苷从培养液中沉淀出来的条件下进行，所述方法包括处理培养液，使得沉淀的一种或多种甜菊糖苷至少部分地重新溶解在培养液中，优选地其中基本上所有的所述一种或多种甜菊糖苷都重新溶解在培养液中。
14.在这个方面中，还提供了一种用于从培养液中回收一种或多种甜菊糖苷的方法，其中所述培养液包含能够产生一种或多种甜菊糖苷的重组细胞、培养基、一种或多种沉淀的甜菊糖苷和任选的一种或多种溶解的甜菊糖苷，其中所述方法包括处理培养液，使得沉淀的一种或多种甜菊糖苷至少部分地重新溶解在培养液中，优选地其中基本上所有的所述一种或多种甜菊糖苷都重新溶解在培养液中。有效地，所述一种或多种甜菊糖苷可在其部分或完全重新溶解后从培养液中回收。
15.在本公开的实施方案中，优选地通过在重组细胞中发酵来生产甜菊糖苷。或者，甜菊糖苷可通过全细胞生物转换来产生。
16.因此，还提供了一种用于产生一种或多种甜菊糖苷的方法，其中将能够从一种或多种甜菊糖苷底物(例如植物来源的甜菊糖苷提取物、莱鲍迪甙a、蛇菊苷或它们的混合物等)开始产生一种或多种甜菊糖苷的重组细胞在合适的培养基中培养，所述培养在所述一种或多种甜菊糖苷底物被所述细胞进一步糖基化以产生所述一种甜菊糖苷并且其中所述一种或多种甜菊糖苷从培养液中沉淀出来的条件下进行，所述方法包括处理培养液，使得沉淀的一种或多种甜菊糖苷至少部分地重新溶解在培养液中，优选地其中基本上所有的所述一种或多种甜菊糖苷都重新溶解在培养液中。
17.还提供了一种从培养液中回收一种或多种甜菊糖苷的方法，其中所述培养液包含能够从一种或多种甜菊糖苷底物(例如植物来源的甜菊糖苷提取物、莱鲍迪甙a、蛇菊苷或它们的混合物等)开始产生一种或多种甜菊糖苷的重组细胞、培养基、一种或多种沉淀的甜菊糖苷和任选的一种或多种溶解的甜菊糖苷，其中所述方法包括处理培养液，使得沉淀的
一种或多种甜菊糖苷至少部分地重新溶解在培养液中，优选地其中基本上所有的所述一种或多种甜菊糖苷都重新溶解在培养液中。
18.通过重组细胞的发酵或生物转换产生甜菊糖苷的方法是本领域技术人员已知的，并且例如描述于wo2011153378、wo2013022989、wo2013110673、wo2014122227、wo2015007748中。
19.在本公开的上下文中，“培养液”、“发酵液”或“发酵液体”可以是可互换使用的。培养液通常包括培养基、本公开的重组细胞和任选的由重组细胞产生的产物，例如甜菊糖苷。处理培养液以重新溶解沉淀的一种或多种甜菊糖苷可以以本领域技术人员已知的任何方式执行；优选的处理是整个说明书和本文实施例中描述的任何处理。
20.在本公开的实施方案中，一种或多种甜菊糖苷的重新溶解可以在基本上阻止培养液中的重组细胞裂解的条件下发生。基本上阻止在本文中被解释为至多10％，优选至多5％，更优选至多4％、3％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％，或至多0.01％的重组细胞被裂解。重组细胞的裂解可以通过本领域技术人员已知的任何手段来确定。优选的方法是本文实施例中描述的方法，其中确定干物质的量的增加(干物质是细胞组分)或其中确定细胞沉淀的增加。
21.在本公开的实施方案中，一种或多种甜菊糖苷的重新溶解可通过使包含重组细胞和沉淀的一种或多种甜菊糖苷(和任选的一种或多种溶解的甜菊糖苷)的培养液经受加热步骤来执行。当在本公开的实施方案中，执行加热步骤以使一种或多种甜菊糖苷重新溶解时，加热步骤可以以一种或多种甜菊糖苷至少部分地重新溶解在培养基中的温度和时段执行，优选地在其中一种或多种甜菊糖苷完全重新溶解在培养基中的条件下执行。术语“部分地重新溶解”在本文中解释为至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的一种或多种甜菊糖苷重新溶解在培养基中。
22.在一个实施方案中，加热步骤在45-75℃之间的温度下执行和/或执行至多达约90秒的时段。在一个实施方案中，加热步骤在45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃下执行至多达20秒、21秒、22秒、23秒、24秒、25秒、26秒、27秒、28秒、29秒、30秒、31秒、32秒、33秒、34秒、35秒、36秒、37秒、38秒、39秒、40秒、41秒、42秒、43秒、44秒、45秒、46秒、47秒、48秒、49秒、50秒、51秒、52秒、53秒、54秒、55秒、56秒、57秒、58秒、59秒、60秒、61秒、62秒、63秒、64秒、65秒、66秒、67秒、68秒、69秒、70秒、71秒、72秒、73秒、74秒、75秒、76秒、77秒、78秒、79秒、80秒、81秒、82秒、83秒、84秒、85秒、86秒、87秒、88秒、89秒或90秒的时段。
23.在一个实施方案中，加热步骤在55-70℃的温度执行达至多60秒的时段，特别地其中加热步骤在60-70℃的温度执行达至多60秒的时段。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达至多20秒、21秒、22秒、23秒、24秒、25秒、26秒、27秒、28秒、29秒、30秒、31秒、32秒、33秒、34秒、35秒、36秒、37秒、38秒、39秒、40秒、41秒、42秒、43秒、44秒、45秒、46秒、47秒、48秒、49秒、50秒、51秒、52秒、53秒、54秒、55秒、56秒、57秒、58秒、59秒或60秒的时段。在一个
实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达25秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达26秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达27秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达28秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达29秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达30秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达31秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行
·
达32秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达33秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达34秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达35秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达36秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达37秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达38秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达39秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达40秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达41秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达42秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达43秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达44秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达45秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达46秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达47秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达48秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达49秒。在一个实施方案中，加热步骤
在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达50秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达51秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达52秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达53秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达54秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达55秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达56秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达57秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达58秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达59秒。在一个实施方案中，加热步骤在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃执行达60秒。
24.在本公开的实施方案中，加热步骤可以使用本领域技术人员已知的任何手段来执行，例如使用热板交换器。
25.在本公开的实施方案中，可回收并任选纯化培养液中存在的一种或多种甜菊糖苷。回收和纯化可以使用本领域技术人员已知的任何手段来执行。本公开的方法可进一步包括从培养液中去除重组细胞。可以使用本领域技术人员已知的任何手段从培养液中去除重组细胞；可以通过离心将培养基中存在的一种或多种甜菊糖苷与重组细胞分离。在一个实施方案中，离心机可操作地连接至热板交换器。
26.在一个实施方案中，在至多40,000g*min下通过离心将培养基中存在的一种或多种甜菊糖苷与重组细胞分离，并且离心时间优选为至多5分钟。在一个实施方案中，g*t为在10,000g*min与30,000g*min之间，例如在15,000g*min至20,000g*min之间。
27.在本公开的实施方案中，所述一种或多种甜菊糖苷的回收和任选纯化可包括或可进一步包括培养基(即不再包含重组细胞的培养液)的过滤步骤、超滤步骤、蒸发步骤、结晶步骤和热休克步骤中的一者或多者。回收和纯化甜菊糖苷，例如回收和纯化通过发酵产生的甜菊糖苷的方法，已经在例如wo2015/014959 a1、wo2017/009293 a1、wo2017/009294 a1、wo2018/029272 a1和wo2018/029274 a1中描述。
28.在本公开的实施方案中，所述一种或多种甜菊糖苷可以是任何甜菊糖苷。在一个实施方案中，所述一种或多种甜菊糖苷是reb m、reb d、reb a或它们的组合物。缩写“reb”被本领域技术人员称为莱鲍迪甙；因此，reb m表示莱鲍迪甙m(rebaudioside m)。
29.通常，可在根据本公开的方法中使用的重组细胞能够产生糖基化的二萜，例如甜菊糖苷。例如，根据本公开的重组细胞可以能够产生例如以下物质中的一种或多种：甜菊醇-13-单苷、甜菊醇-19-单苷、13-[(β-d-吡喃葡萄糖基)氧)贝壳杉-16-烯-18-酸2-o-β-d-吡喃葡萄糖基-β-d-吡喃葡萄糖基酯、甜茶苷、蛇菊苷、甜菊醇-19-二苷、甜菊双糖苷、莱鲍
葡萄糖的c-2'。
[0044]
具有ugt2活性的多肽还可以催化利用除甜菊醇13-o-葡糖苷和甜茶苷以外的甜菊糖苷底物的反应，例如，功能性ugt2多肽可以利用蛇菊苷作为底物，从而将葡萄糖部分转移到19-o-葡萄糖残基的c-2'以产生莱鲍迪甙e。功能性ugt2多肽也可以利用莱鲍迪甙a作为底物，从而将葡萄糖部分转移到19-o-葡萄糖残基的c-2'以产生莱鲍迪甙d。然而，功能性ugt2多肽通常不会将葡萄糖部分转移至在c-13位处具有1,3-结合的葡萄糖的甜菊醇化合物，即通常不会发生将葡萄糖部分转移至甜菊醇1,3-二糖苷和1,3-蛇菊苷。具有ugt2活性的多肽可包括ugt2多肽，所述ugt2多肽可优先催化甜菊醇-13-单苷转化成甜菊双糖苷和/或催化甜茶苷转化成蛇菊苷，这可有助于将生产转向莱鲍迪甙a。替代地，具有ugt2活性的多肽可包括ugt2多肽，所述ugt2多肽可优先催化蛇菊苷转化成莱鲍迪甙e或催化甜茶苷转化成在19位处具有附加糖的化合物，这可能有助于将生产转向莱鲍迪甙m。也就是说，优选在13位处加成糖部分可有助于将生产转向莱鲍迪甙a，而优选在19位处加成糖部分可有助于将生产转向莱鲍迪甙m。特定ugt2的示例是在wo2016146711的seq id no:1、seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:14、seq id no:17、seq id no:20、seq id no:22或seq id no:25中所述的那些。其他ugt2描述于wo2016151046中的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4中。
[0045]
具有ugt2活性的多肽还可从尿苷二磷酸葡萄糖以外的供体转移糖部分。例如，具有ugt2活性的多肽充当尿苷5'-二磷酸d-木糖基:甜菊醇-13-o-葡萄糖苷转移酶，从而将木糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-o-葡糖苷的13-o-葡萄糖的c-2'。作为另一个示例，具有ugt2活性的多肽可以充当尿苷5'-二磷酸l-鼠李糖基:甜菊醇-13-0-葡糖苷转移酶，从而将鼠李糖部分转移到受体分子甜菊醇的13-o-葡萄糖的c-2'。
[0046]
适用于在根据本公开的产生甜菊糖苷的方法中使用的重组细胞可以包含编码具有ugt活性的多肽的核苷酸序列，可以包含编码能够催化将c-19-葡萄糖加成至甜菊双糖苷的多肽的核苷酸序列。也就是说，本公开的重组酵母可包含ugt，其能够催化其中甜菊双糖苷转化为蛇菊苷的反应。因此，此类重组酵母可能能够将甜菊双糖苷转化为蛇菊苷。此类核苷酸序列的表达可以赋予重组酵母产生至少蛇菊苷的能力。
[0047]
因此，适用于在根据本公开的产生甜菊糖苷的方法中使用的重组细胞还可包含编码具有由udp-糖基转移酶(ugt)ugt74g1所示的活性的多肽的核苷酸序列，由此所述核苷酸序列在酵母转化时赋予细胞将甜菊双糖苷转换为蛇菊苷的能力。
[0048]
合适的ugt74g1多肽可以能够将葡萄糖单元转移至甜菊醇的13-oh或19-cooh。合适的ugt74g1多肽可以功能为尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-cooh转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-o-葡糖苷19-cooh转移酶。功能性ugt74g1多肽还可以催化糖基转移酶反应，该糖基转移酶反应利用除甜菊醇、甜菊醇-13-o-葡糖苷以外的甜菊糖苷底物，或转移来自除尿苷二磷酸葡萄糖以外的供体的糖部分。此类的序列在本文中可以称为ugt3序列。因此，具有ugt3活性的多肽是能够在所述甜菊醇或前体甜菊糖苷中存在的c-19羧基处糖基化甜菊醇或前体甜菊糖苷的多肽，优选地其中糖基化是β-糖基化。
[0049]
适用于在根据本公开的产生甜菊糖苷的方法中使用的重组细胞可以包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化在蛇菊苷的c-13位处的葡萄糖的c-3'的糖基化的多肽。也就是说，适用于在本公开的方法中使用的重组酵母可以包含ugt，所述ugt能够催
化将蛇菊苷转化为莱鲍迪甙a的反应。因此，这种重组酵母可以能够将蛇菊苷转化为莱鲍迪甙a。此类核苷酸序列的表达可以赋予酵母产生至少莱鲍迪甙a的能力。
[0050]
因此，适用于在根据本公开的产生甜菊糖苷的方法中使用的重组细胞还可包含编码具有由udp-糖基转移酶(ugt)ugt76g1所示的活性的多肽的核苷酸序列，由此所述核苷酸序列在酵母转化时赋予所述酵母将蛇菊苷转换为莱鲍迪甙a的能力。
[0051]
合适的ugt76g1将葡萄糖部分加成到受体分子甜菊醇1,2糖苷的c-13-o-葡萄糖的c-3'。因此，ugt76g1功能为例如尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-0-1,2葡糖苷c-3'葡糖基转移酶，以及尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-0-葡糖基、13-0-1,2二苷c-3'葡糖基转移酶。功能性ugt76g1多肽还可以催化葡糖基转移酶反应，该葡糖基转移酶反应利用含有除了葡萄糖以外的糖的甜菊糖苷底物，例如甜菊醇鼠李糖苷和甜菊醇木糖苷。此类序列在本文中可以称为ugt4序列。ugt4可以替代地或另外地能够将rebd转换为rebm。因此，具有ugt4活性的多肽能够对具有13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖、或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的前体甜菊糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖、或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3'进行1,3糖基化，优选β1,3-糖基化。
[0052]
根据本公开的用于产生一种或多种甜菊糖苷的重组细胞通常包含编码至少一种或多种具有ugt活性(例如ugt1活性、ugt2活性、ugt3活性和/或ugt4活性)的多肽的核苷酸序列，其中所述重组细胞能够从一种或多种甜菊糖苷底物(例如植物来源的甜菊糖苷提取物、莱鲍迪甙a、蛇菊苷、或如前文所述的一种或多种糖苷的任何混合物)开始产生一种或多种甜菊糖苷。
[0053]
用于在根据本公开的产生甜菊糖苷的方法中使用的重组细胞通常包含编码至少一种具有ugt1活性的多肽、至少一种具有ugt2活性的多肽、至少一种具有ugt3活性的多肽和至少一种具有ugt4活性的多肽的核苷酸序列，其中所述重组细胞当在合适的培养基中在产生所述一种或多种甜菊糖苷的条件下培养(即，甜菊糖苷的发酵生产)时，能够产生所述一种或多种甜菊糖苷。这些核酸序列中的一种或多种核酸序列可以是重组的。给定的核酸可以编码具有上述活性中的一种或多种活性的多肽。例如，核酸可编码具有上述活性中的两种、三种或四种活性的多肽。优选地，用于在本公开的方法中使用的重组酵母包含ugt1、ugt2和ugt3和ugt4活性。合适的ugt1、ugt2、ugt3和ugt4序列在wo2015/007748的表1中描述。
[0054]
根据本公开的重组细胞可包含两种或更多种核酸序列，该两种或更多种核酸序列编码具有任何一种ugt活性(例如ugt1、ugt2、ugt3或ugt4活性)的多肽。当根据本公开的重组细胞包含两种或更多种核酸序列，该两种或更多种核酸序列编码具有任何一种ugt活性的多肽，这些核酸序列可以相同或不同和/或可以编码相同或不同的多肽。具体地，根据本公开的重组细胞可以包含编码两个不同的ugt2多肽的核酸序列。
[0055]
根据本公开的重组细胞可以包含编码以下多肽中的一者或多者的一种或多种重组核苷酸序列。
[0056]
具有对映-古巴焦磷酸合酶活性的多肽；
[0057]
具有对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽；以及
[0058]
具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽。
[0059]
根据本公开的重组细胞可包含编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的重组
核苷酸序列。
[0060]
出于本公开的目的，具有对映-古巴焦磷酸合酶(ec 5.5.1.13)的多肽能够催化以下化学反应：
[0061][0062]
该酶具有一种底物和一种产物，所述底物为香叶酰香叶酰焦磷酸酯(geranylgeranyl pyrophosphate)，所述产物为对映-古巴焦磷酸(ent-copalyl pyrophosphate)。该酶参与赤霉素生物合成。该酶属于异构酶家族，特别是分子内裂解酶类。该类酶的学名是对映-古巴焦磷酸裂解酶(脱环)。常用的其他名称包括有对映-古巴焦磷酸合酶、对映-贝壳杉烯合酶a和对映-贝壳杉烯合酶a。
[0063]
编码对映-古巴焦磷酸合酶的合适核酸序列可例如包含wo2015/007748的seq id.no:1、seq id.no:3、seq id.no:5、seq id.no:7、seq id.no:17、seq id.no:19、seq id.no:59、seq id.no:61、seq id.no:141、seq id.no:142、seq id.no:151、seq id.no:152、seq id.no:153、seq id.no:154、seq id.no:159、seq id.no:160、seq id.no:182或seq id.no:184所示的序列。
[0064]
出于本公开的目的，具有对映-贝壳杉烯合酶活性(ec 4.2.3.19)的多肽是能够催化以下化学反应的多肽：
[0065]
对映-古巴焦磷酸对映-贝壳杉烯 二磷酸盐
[0066]
因此，该酶具有一种底物和两种产物，所述底物为对映-古巴焦磷酸，所述产物为两种产物对映-贝壳杉烯和焦磷酸酯。
[0067]
该酶属于裂解酶家族，尤其是作用于磷酸盐的那些碳-氧裂解酶。该酶类别的学名是对映-古巴焦磷酸焦磷酸裂解酶(环化，形成对映-贝壳杉烯)。常用的其他名称包括对映-贝壳杉烯合酶b、对映-贝壳杉烯合成酶b、对映-古巴焦磷酸焦磷酸裂解酶，以及(环化)。该酶参与二萜类生物合成。
[0068]
编码对映-贝壳杉烯合酶的合适的核酸序列可以例如包含wo2015/007748的seq id.no:9、seq id.no:11、seq id.no:13、seq id.no:15、seq id.no:17、seq id.no:19、seq id.no:63、seq id.no:65、seq id.no:143、seq id.no:144、seq id.no:155、seq id.no:156、seq id.no:157、seq id.no:158、seq id.no:159、seq id.no:160、seq id.no:183或seq id.no:184所示的序列。
[0069]
对映-古巴焦磷酸合酶也可具有与同一蛋白质分子相关的不同对映-贝壳杉烯合酶活性。由对映-贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素生物合成途径中的下一步。两种类型的酶活性是不同的，并且用于抑制蛋白质的对映-贝壳杉烯合酶活性的定点诱变导致了对映-古巴焦磷酸酯的积聚。
[0070]
因此，在根据本公开的重组细胞中使用的单个核苷酸序列可以编码具有对映-古巴焦磷酸合酶活性和对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽。或者，两种活性可以被编码为两个不同的单独核苷酸序列。
[0071]
出于本公开的目的，具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性(ec 1.14.13.78)的多肽是能
够催化对映-贝壳杉烯的4-甲基的三次连续氧化以产生贝壳杉烯酸的多肽。这种活性通常需要细胞色素p450的存在。
[0072]
编码对映-贝壳杉烯氧化酶的合适核酸序列可以例如包含wo2015/007748的seq id.no:21、seq id.no:23、seq id.no:25、seq id.no:67、seq id.no:85、seq id.no:145、seq id.no:161、seq id.no:162、seq id.no:163、seq id.no:180或seq id.no:186所示的序列。
[0073]
编码贝壳杉烯酸13-羟化酶的合适的核酸序列可以例如包含如wo2015/007748的seq id.no:27、seq id.no:29、seq id.no:31、seq id.no:33、seq id.no:69、seq id.no:89、seq id.no:91、seq id.no:93、seq id.no:95、seq id.no:97、seq id.no:146、seq id.no:164、seq id.no:165、seq id.no:166、seq id.no:167或seq id.no:185所示的序列。其他合适的贝壳杉烯酸13-羟化酶是wo2017/060318或wo2018/104238中所述的变异多肽。
[0074]
根据本公开的重组细胞可以包含编码具有如本文所公开的细胞色素p450还原酶活性(cpr)的多肽的重组核酸序列。也就是说，根据本公开的重组细胞可以能够表达编码具有细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列。
[0075]
在根据本公开的重组细胞中，该重组细胞产生香叶酰香叶酰焦磷酸(ggpp)的能力可以被上调。在本公开的上下文中上调意味着重组细胞比等同的非重组细胞产生更多的ggpp。
[0076]
因此，根据本公开的重组细胞可以包含编码羟甲基戊二酰-辅酶a还原酶、法呢基-焦磷酸合酶和香叶酰香叶酰二磷酸合酶的一种或多种核苷酸序列，由此所述一种或多种核苷酸序列在转化微生物后赋予该微生物产生升高水平的ggpp的能力。因此，根据本公开的重组细胞可包含一种或多种编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶、法呢基-焦磷酸合成酶和香叶酰香叶酰二磷酸合酶中的一种或多种的重组核酸序列。
[0077]
因此，根据本公开的重组细胞可包含编码以下多肽中的一种或多种的核酸序列：
[0078]
具有羟甲基戊二酰-辅酶a还原酶活性的多肽；
[0079]
具有法呢基-焦磷酸合酶活性的多肽；
[0080]
具有香叶酰香叶酰二磷酸合酶活性的多肽。
[0081]
具体地，可能的是选自由对映-古巴焦磷酸合酶、对映-贝壳杉烯合酶、对映-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、ugt、羟甲基戊二酰-辅酶a还原酶、法呢基-焦磷酸合酶、香叶酰香叶酰二磷酸合酶和细胞色素p450还原酶组成的组的酶对于细胞是天然的，并且可能不需要用编码这些酶的核苷酸序列中的一种或多种核苷酸序列进行转化来赋予细胞产生甜菊醇或甜菊糖苷的能力。根据本公开的优选细胞可以是天然(即，以其非重组形式)能够产生ggpp的重组细胞。
[0082]
对由细胞或重组细胞进行的甜菊醇或甜菊糖苷产生的进一步改善可通过传统菌株改良获得。
[0083]
在本公开的实施方案中，重组细胞可以是能够产生甜菊糖苷的重组细胞，其中所述重组细胞包含编码以下多肽中的一者或多者的一种或多种核酸序列：
[0084]
具有羟甲基戊二酰-辅酶a还原酶活性的多肽；
[0085]
具有法呢基-焦磷酸合酶活性的多肽；
[0086]
具有香叶酰香叶酰二磷酸合酶活性的多肽
[0087]
具有对映-古巴焦磷酸合酶活性的多肽；
[0088]
具有对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽；
[0089]
具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；
[0090]
具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽；
[0091]
具有nadph-细胞色素p450还原酶活性的多肽；
[0092]
具有ugt74g1活性的多肽；
[0093]
具有ugt2活性的多肽；
[0094]
具有ugt85c2活性的多肽；
[0095]
具有ugt76g1活性的多肽。
[0096]
在本公开的实施方案中，重组细胞可以是任何适于产生一种或多种甜菊糖苷的微生物细胞。在一个实施方案中，所述重组细胞属于以下属中的一者：酵母属(saccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、毕赤酵母属(pichia)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、假丝酵母属(candida)、汉逊酵母属(hansenula)、腐质霉属(humicola)、伊萨酵母属(issatchenkia)、毛孢子菌属(trichosporon)、酒香酵母属(brettanomyces)、管囊酵母属(pachysolen)、耶氏酵母属(yarrowia)、yamadazyma或埃希氏菌属(escherichia)，优选地，所述重组细胞是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)细胞、克鲁斯假丝酵母(candida krusei)细胞、东方伊萨酵母(issatchenkia orientalis)细胞或大肠杆菌(escherichia coli)细胞。在一个实施方案中，重组细胞是如在本文的一般定义中定义的细胞。
[0097]
在本公开的实施方案中，一种或多种甜菊糖苷的回收总产率可增加至少10％，例如至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在本公开的实施方案中，总产率可增加至高达40％，例如高达45％、高达50％、高达55％、高达60％、高达65％、高达70％、高达80％、高达85％、高达90％或高达95％的总产率。
[0098]
一般定义
[0099]
在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包括/包含(comprise)”、“包含/包括(include)”和“具有(having)”以及诸如“包括/包含(comprises/comprising)”和“包含/包括(includes/including)”的变型将被包含性地解释。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可能包括未具体叙述的其他要素或整数。
[0100]
冠词“一种(a/an)”在本文中用于指代一个或多于一个(即，一个或至少一个)的该冠词的语法对象。举例来说，“要素”可以表示一个要素或多于一个要素。
[0101]
当与数值(例如，约10)结合使用时，词语“约”或“近似”优选地意味值可以是给定值(10)加减该值的10％或加减该值的5％。
[0102]
甜菊糖苷在本文中被定义为以下中的任一者：甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜茶苷、杜克甙b、杜克甙a、莱鲍迪甙b、莱鲍迪甙g、蛇菊苷、莱鲍迪甙c、莱鲍迪甙f、莱鲍迪甙a、莱鲍迪甙i、莱鲍迪甙e、莱鲍迪甙h、莱鲍迪甙l、莱鲍迪甙k、莱鲍迪甙j、莱鲍迪甙m、莱鲍迪甙m2、莱鲍迪甙d、莱鲍迪甙d2、莱鲍迪甙n、莱鲍迪甙o、莱鲍迪甙a、在甜叶菊中发现的其他甜菊糖苷，或合成甜菊糖苷。本公开的优选甜菊糖苷是莱鲍迪甙m(reb-m)。
[0103]
当关于核酸或蛋白质使用时，术语“重组”是指该核酸或蛋白质如果与其天然形式
相比则已经通过人工干预进行了序列修饰。当涉及细胞时，术语“重组”表示该细胞的基因组如果与其天然形式相比则已经通过人为干预进行了序列修饰。术语“重组”与“经遗传修饰的”同义。
[0104]
可以通过常规转化或转染技术将如本文所公开的核酸构建体或多核苷酸引入细胞，例如原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在指代本领域技术人员众所周知的用于将外来核酸(例如，dna)引入重组细胞中的多种本领域公认的技术。
[0105]
如本文所定义的“细胞”是适用于遗传操作的生物体，并且其可以以可用于目标产物工业生产的细胞密度进行培养。合适的生物体可以是微生物，例如可以保持在发酵装置中的微生物。关于本公开，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(international code of nomenclature of prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(international code of nomenclature)(melbourne法)所限定的。细胞可以是在自然界中存在的细胞，或者是源自亲本细胞的遗传操纵或经典诱变后的细胞。
[0106]
如本文所用，重组细胞是用如本文所定义的一种或多种核苷酸序列遗传修饰或转化/转染的细胞。一种或多种此类核苷酸序列的存在可以改变微生物产生甜菊醇或甜菊糖苷，特别是一种或多种甜菊糖苷的能力。非重组细胞，即未经转化/转染或遗传修饰的细胞，其通常不包含使得细胞能够产生甜菊糖苷的核酸序列中的一种或多种核苷酸序列。因此，非重组细胞通常是不天然产生甜菊糖苷的细胞，但是天然产生甜菊醇或甜菊糖苷并且已经根据本公开进行了修饰的细胞被认为是根据本公开的重组细胞。
[0107]
在本公开的实施方案中，重组细胞，可互换地称为宿主细胞，可以是例如多细胞生物体或其细胞或单细胞生物体。重组细胞可以是原核、古细菌或真核细胞。
[0108]
原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、动物、昆虫宿主细胞。
[0109]
真核宿主细胞可以是真菌宿主细胞。
[0110]
真核细胞可以是真菌，例如丝状真菌或酵母。
[0111]
丝状真菌菌株包括但不限于以下菌株：支顶孢属(acremonium)、曲霉属(aspergillus)、伞菌属(agaricus)、短梗霉属(aureobasidium)、隐球菌属(cryptococcus)、棒囊壳属(corynascus)、金孢子菌属(chrysosporium)、丝梗霉属(filibasidium)、镰刀菌属(fusarium)、腐质霉属(humicola)、巨座壳属(magnaporthe)、红曲霉属(monascus)、毛霉属(mucor)、毁丝霉属(myceliophthora)、被孢霉属(mortierella)、新美鞭菌属(neocallimastix)、脉孢菌属(neurospora)、拟青霉属(paecilomyces)、青霉菌属(penicillium)、瘤胃壶菌属(piromyces)、平革菌属(phanerochaete)、柄孢壳菌属(podospora)、密孔菌属(pycnoporus)、根霉属(rhizopus)、裂褶菌属(schizophyllum)、粪壳菌属(sordaria)、篮状菌属(talaromyces)、踝节菌属(rasamsonia)、热子囊菌属(thermoascus)、梭孢壳属(thielavia)、弯颈霉属(tolypocladium)、栓菌属(trametes)和木霉属(trichoderma)。可以充当宿主细胞的优选丝状真菌菌株属于以下物种：黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、烟曲霉(aspergillus fumigatus)、产黄青霉菌(penicillium chrysogenum)、橘青霉(penicillium citrinum)、产黄头孢霉(acremonium chrysogenum)、里氏木霉
(trichoderma reesei)、踝节菌属埃默森蓝状菌(rasamsonia emersonii)(以前称为埃默森篮状菌(talaromyces emersonii))、酱油曲霉(aspergillus sojae)、鲁克文金孢子菌(chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(myceliophtora thermophyla)。
[0112]
真核宿主细胞可以是酵母细胞。优选的酵母宿主细胞可以选自以下属：酵母属(saccharomyces)(例如，酿酒酵母(s.cerevisiae)、贝酵母(s.bayanus)、巴氏酵母(s.pastorianus)、卡氏酵母(s.carlsbergensis))、酒香酵母属(brettanomyces)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、假丝酵母属(candida)(例如，克鲁斯假丝酵母(c.krusei)、拉考夫假丝酵母(c.revkaufi)、铁红假丝酵母(c.pulcherrima)、热带假丝酵母(c.tropicalis)、产朊假丝酵母(c.utilis))、伊萨酵母属(issatchenkia)(例如，东方伊萨酵母(i.orientalis))、毕赤酵母属(pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(p.pastoris))、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、汉逊酵母(hansenula)、克勒克酵母属(kloeckera)、管囊酵母属(pachysolen)、许旺酵母属(schwanniomyces)、毛孢子菌属(trichosporon)、耶氏酵母属(yarrowia)(例如，解脂耶氏酵母(y.lipolytica)，原来被分类为解脂假丝酵母(candida lipolytica))、yamadazyma。
[0113]
原核宿主细胞可以是细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。细菌的示例包括但不限于属于以下属的细菌：芽孢杆菌属(bacillus)(例如，枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(b.puntis)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)、短小芽孢杆菌(b.pumilus))、不动杆菌属(acinetobacter)、诺卡氏菌属(nocardia)、黄色杆菌属(xanthobacter)、埃希氏菌属(escherichia)(例如，大肠杆菌(e.coli)(例如，菌株dh 1ob、stbl2、dh5-α、db3、db3.1)、db4、db5、jdp682和ccda-over(例如，美国申请号09/518,188)))、链霉菌属(streptomyces)、欧文氏菌属(erwinia)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、沙雷氏菌属(serratia)(例如粘质沙雷氏菌(s.marcessans))、假单胞菌属(pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))、沙门氏菌属(salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)、伤寒沙门氏菌(s.typhi))。细菌还包括但不限于光合细菌(例如，绿色非硫细菌(例如，绿屈挠菌属(choroflexus)细菌(例如，橙色绿屈挠菌(c.aurantiacus))、绿丝菌属(chloronema)(例如，巨大绿丝菌(c.gigateum))、绿色硫细菌(例如，绿菌属(chlorobium)细菌(例如，泥生绿菌(c.limicola))、暗网菌属(pelodictyon)(例如，微黄暗网菌(p.luteolum))、紫色硫细菌(例如，着色菌属(chromatium)(例如，奥氏着色菌(c.okenii))，以及紫色非硫细菌(例如，红螺菌属(rhodospirillum)(例如，深红螺菌(r.rubrum)、红细菌属(rhodobacter)(例如类球红细菌(r.sphaeroides)、荚膜红细菌(r.capsulatus)，和红微菌属(rhodomicrobium)细菌(例如，万尼氏红微菌(r.vanellii))。
[0114]
本文中提及的专利文献或作为现有技术给出的其他事项不应被视为承认该文献或事项是已知的，或者该文献或事项所包含的信息是在任何请求项的优先权日期时的公知常识的一部分。
[0115]
本文所述的每篇参考文献的公开内容均以引用方式整体并入本文。
[0116]
本公开通过以下非限制性实施例进一步说明：
[0117]
实施例
[0118]
实施例1.发酵液中沉淀的甜菊糖苷的溶解
[0119]
介绍
[0120]
随着菌株生产率的提高和发酵液中甜菊糖苷(如reb-a和reb-m)滴度的增加，甜菊糖苷中的部分甜菊糖苷可能在发酵过程期间沉淀。在培养液离心后，这种沉淀在细胞沉淀的顶部上可见为白色层(参见图1)。从下游加工(down stream processing,dsp)的角度来看，这种沉淀是非期望的，因为只有溶解的产物才能在dsp过程中进一步加工。开发了一种方法，其中将发酵液中沉淀的甜菊糖苷重新溶解，与此同时基本上阻止了宿主细胞的裂解。
[0121]
材料和方法
[0122]
基本上根据wo2015007748中所述的方法提供包含甜菊糖苷(包括reb-m)的发酵液。
[0123]
将发酵液在介于45摄氏度与90摄氏度之间的不同温度进行90秒的热休克。在热休克后，对发酵液进行离心，以将细胞与含有甜菊糖苷的上清液分离。通过测量上清液干重的增加以及通过测量沉淀体积来确定细胞裂解的量。使用lc-uv测定上清液中reb-m的量。
[0124]
对热休克样本的上清液执行超滤测试，以确定热休克是否影响超滤性能。在超滤之前，将上清液样本的ph调节至ph 3.5，将上清液样苯在70℃孵育两个小时，并通过以60摄氏度和7000g离心20分钟来澄清。
[0125]
结果
[0126]
在介于45摄氏度与90摄氏度之间的不同温度下对发酵液进行90秒钟的热休克的结果如在此的下表1中所示。
[0127]
表1.
[0128][0129]
在60℃加热导致了中间层消失，即甜菊糖苷的重新溶解。高于60℃时，大量细胞裂解发生，如由细胞沉淀体积的减少所指示。加热至60℃重复两次，以证明可重复性并证实观察到的产率增加。结果描述于表2中。
[0130]
表2
[0131][0132]
虽然沉淀体积减少了2-5％，由此表明有一定的细胞裂解，但上清液中干物质的增加很少，表明细胞裂解对整体的影响很小。60℃热休克后上清液的超滤通量是正常的。在较高的温度下，超滤通量急剧下降。当使用热休克对沉淀的甜菊糖苷进行重新溶解时，甜菊糖苷回收的总产率增加了40％-60％，达到总体90％-95％。
[0133]
在后续实验中，确定发酵液的热休克持续时间可缩短至30秒，这足以溶解所有沉淀的甜菊糖苷(数据未显示)。