一种绣球菌干燥粉末的制备方法和生理机能活性剂及其应用与流程

一种绣球菌干燥粉末的制备方法和生理机能活性剂及其应用
1.本技术是申请日为2020年07月10日、申请号为202010660464.0、发明名称为《一种生理机能活性剂及其应用》的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种医药保健产品技术领域，尤其涉及一种绣球菌干燥粉末的制备方法和生理机能活性剂及其应用。


背景技术：

3.绣球菌，又名绣球菇，拉丁学名为sparassis crispa，是非褶孔菌目、绣球菌科、绣球菌属。绣球菌是名贵的食药兼用菌，生长在诸如落叶松之类的针叶树上，被誉为“万菇之王”，因其具有超高的激活免疫能力，在日本有“梦幻神奇菇”之称。绣球菌含有大量的蛋白质、碳水化合物、多种维生素、多种氨基酸及膳食纤维和灰分、矿物质等。其中，绣球菌含有大量的β-葡聚糖，β-葡聚糖是一种生物活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝、提高造血功能等多种功能。
4.日本专利jp4183326b2公开了一种绣球菌提取物，其在对绣球菌的生理活性进行研究的过程中，发现该绣球菌提取物中所含的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)为绣球菌中主要的生理活性物质。
5.然而，绣球菌生长缓慢，过去难以工业化人工种植绣球菌，日本专利 jp2002125460a发现，在相对较短的时间内可靠地人工种植绣球菌，并公开了一种无需复杂且昂贵的培养基料处理过程的培养方法。具体的，日本专利 jp2002125460a公开了一种在主要由木屑组成的培养基上培养绣球菌 mh-3(保藏编号ferm p-17221)的方法。虽然jp2002125460a公开的培养方法能够控制成本在短期内人工栽培绣球菌，但是其培养得到的绣球菌mh-3 中，生理活性物质β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的含量较低。
6.此外，ohno等人(ohno大野尚仁,naohito宿前利郎,miura中岛三博, 等.antitumor1,3-β-glucan from cultured fruit body of sparassiscrispa[j].biological&pharmaceutical bulletin,2000,23(7):861-872.)通过建立白细胞减少症小鼠的实验模型，报道了绣球菌mh-3(保藏编号ferm p-17221) 的干燥粉末具有免疫功能增强作用。
[0007]
因此，目前仍无法提供一种培养绣球菌mh-3的方法，能够稳定提高其活性成份β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的含量。


技术实现要素：

[0008]
为此，需要提供一种含有高浓度的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的绣球菌粉末，以提供新的生理机能活性剂，其含有该绣球菌粉末的提取物。
[0009]
为实现上述目的，本发明的第一方面，发明人提供了一种生理机能活性剂，其包括由绣球菌干燥粉末提取得到的绣球菌提取物作为第一活性成分；
[0010]
所述绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量％的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)，且所述绣球菌干燥粉末由绣球菌mh-3(国际特许微生物保藏编号fermbp-17221)制备得到。
[0011]
优选的，所述绣球菌干燥粉末的制备方法包括以下步骤：
[0012]
(1)第一培养工序：将所述绣球菌mh-3接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，将冷冻保藏的绣球菌mh-3复苏，得到第一代培养菌株；
[0013]
(2)第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在第一蘑菇栽培用瓶内，将所述第一代培养菌株接种至所述第一蘑菇栽培用瓶内进行培养，使复苏后的绣球菌mh-3生长出菌丝体，得到第二代培养菌株，所述培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营养素；
[0014]
(3)第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第一真菌床袋内，将所述第二代培养菌株接种至所述第一真菌床袋内进行培养，使第二代培养菌株继续生长，在培养60日～90日后，产生菌丝体，再继续培养10日～40 日内，产生子实体原基，得到第三代培养菌株；
[0015]
(4)第四培养工序：将所述绣球菌mh-3，所述第二代培养菌株的菌丝、子实体，以及所述第三代培养菌株的菌丝、子实体的混合体，接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株；
[0016]
(5)第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在第二蘑菇栽培用瓶内，将所述第一代配合菌接种至所述第二蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代配合菌株；
[0017]
(6)第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内，将所述第二代配合菌株接种至所述第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配合菌株；
[0018]
(7)干燥工序：将所述第三代配合菌株进行干燥处理，得到所述绣球菌干燥粉末。
[0019]
优选的，在本发明第一方面所述的生理机能活性剂中，所述绣球菌提取物采用热水提取法，或热碱水提取法，或冷碱水提取法提取得到。
[0020]
优选的，在本发明第一方面所述的生理机能活性剂中，所述绣球菌提取物的含量为50～330mg/50kg体重。
[0021]
优选的，在本发明第一方面所述的生理机能活性剂中，还包括由少孢根霉制备得到的酶发酵物、大豆发酵异黄酮以及矿物质吸收促进剂中的至少一种作为第二活性成分；
[0022]
优选的，所述酶发酵物的含量为25～165mg/50kg体重；
[0023]
优选的，所述大豆发酵异黄酮的含量为25～150mg/50kg体重；
[0024]
优选的，所述矿物质吸收促进剂的含量为25～150mg/50kg体重。
[0025]
优选的，所述矿物质吸收促进剂包含通过对野草类、蔬菜类、果实类、蘑菇类和海藻类中的一种或多种的提取液或榨汁液进行酒精发酵和/或乳酸发酵而获得的发酵产物。
[0026]
本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述的生理机能活性剂在作为提高人体生理机能活性的保健品或药物中的应用。
[0027]
优选的，所述生理机能活性剂的施用对象为18岁以上的人。
[0028]
优选的，所述生理机能活性剂的施用方法为持续进行多次施用。
[0029]
优选的，所述生理机能活性剂的施用对象为没有食用绣球菌经验的人。
[0030]
区别于现有技术，上述技术方案提供的生理机能活性剂包括由绣球菌干燥粉末提取得到的绣球菌提取物作为第一活性成分；绣球菌干燥粉末由绣球菌mh-3(国际特许微生
物保藏编号ferm bp-17221)制备得到，且绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量％的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)。由于含有高浓度的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)，本发明的生理机能活性剂表现了出更优异的生理机能活性，包括癌症预防、治疗、糖尿病、高血压治疗、抗癌(肿瘤)作用、降血糖作用、免疫刺激作用、抗高血压作用等生理机能活性，特别适合作为提高人体生理机能活性的保健品或药物。
附图说明
[0031]
图1示出了不同品系小鼠中绣球菌提取物(β-1,3-d-葡聚糖(6分歧))(以下简称mhg)诱导脾细胞产生ifn-γ能力的试验结果；
[0032]
图2示出了不同周龄小鼠中mhg诱导脾细胞产生ifn-γ能力的试验结果，图中w表示周龄；
[0033]
图3示出了不同国家来源的人全血中mhg诱导产生il-s能力的比较结果；在图中，“j”表示日本人，“k”表示韩国人，“c”表示中国人，“e”表示英国人；
[0034]
图4示出了人全血中不同剂量mhg诱导产生il-s能力的比较结果；
[0035]
图5示出了在单独施用和组合施用时，mhg和map酶发酵物诱导产生淋巴细胞能力的比较结果，图中wbc表示白细胞，w表示周，map表示 map酶发酵物；
[0036]
图6示出了在单独施用和组合施用时，mhg和大豆发酵异黄酮的诱导产生淋巴细胞能力的比较结果，图中wbc表示白细胞，w表示周，isf表示大豆发酵异黄酮；
[0037]
图7示出了在单独施用和组合施用时，mhg和矿物质吸收促进剂的诱导产生淋巴细胞能力的比较结果，图中wbc表示白细胞，w表示周，p表示矿物质吸收促进剂。
具体实施方式
[0038]
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0039]
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0040]
本发明实施例中，使用的微生物——绣球菌mh-3菌株是属于绣球菌属的菌种，其已于1999年2月17日在日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所nibh(现名称为独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(nite-ipod))保藏，保藏登记号为ferm p-17221，并于2019 年12月5日根据布达佩斯条约移送国际保藏，被赋予国际特许微生物保藏编号ferm bp-17221。当然，本发明提供的绣球菌的培养方法也可以应用于其它种类的绣球菌种的培养中，并不局限于绣球菌mh-3菌株。
[0041]
本发明实施例中，使用的微生物——少孢根霉为map酵母，购自南方健康会社。
[0042]
本发明实施例中，绣球菌的培养方法，包括以下步骤：
[0043]
(1)第一培养工序：将绣球菌mh-3(国际特许微生物保藏编号fermbp-17221)接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代培养菌株。
[0044]
在第一培养工序中，添加至琼脂培养基中的营养成分可以为蛋白胨、爱表斯锭(ebios，啤酒酵母片)、香蕉粉、蜂蜜粉、小麦粉、氯化钙、琼脂粉、针叶树热水提取液等中的一种或多种。另外，还可以在琼脂培养基中添加小麦、麸皮、大麦和玉米麸皮等菌丝体活性
营养素。
[0045]
其中，针叶树热水提取液的实例包括：通过用40℃至80℃的热水对诸如落叶松和赤松之类的针叶树叶的碎片进行热水提取而获得的提取液。琼脂培养基优选斜面培养基，以增加菌丝体的培养基面积。此外，琼脂培养基的 ph值的取值范围优选为6.0至7.0的范围。优选的，琼脂培养基在试管中以倾斜的方式放置、灭菌、形成斜面固体培养基后，再接种绣球菌mh-3并培养。
[0046]
(2)第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在蘑菇栽培用瓶内，将第一代培养菌株接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代培养菌株，培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营养素。
[0047]
在第二培养工序中，针叶树细粒状碎屑包括，例如，通过将针叶树(例如，落叶松、赤松)的原木粉碎而获得的碎屑，并且优选的具有约0.1mm至10mm的颗粒度。菌丝体活性营养素包括，例如，小麦、麸皮、大麦和玉米麸皮等。优选的，菌丝体活性营养素的含量为整个培养基材的20重量％以下。
[0048]
蘑菇栽培用瓶的具体结构不作限制，可以使用市面上销售的可容纳 400g～500g培养基材的耐热塑料瓶。在蘑菇栽培用瓶中，将针叶树细粒状碎屑(150g～450g)、水和菌丝体活性营养素装填形成培养基材，加热灭菌后，使用接种器将第一代培养菌株接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养。
[0049]
培养条件可以在适合菌株生长的范围内适当地设定，例如温度18～ 25℃、湿度55％～75％。另外，培养室中的氧浓度优选为210,000ppm以上，并且培养室中的二氧化碳浓度优选为1,000ppm以下。此外，可以适当地设定培养时间，以菌丝体的产生为指标，例如，培养时间可以为60至90天。
[0050]
(3)第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在真菌床袋内，将第二代培养菌株接种至真菌床袋内进行培养，得到第三代培养菌株。
[0051]
在第三培养工序中，培养基材可以使用和第二培养工序中相同的针叶树细粒状碎屑和菌丝体活性营养素。真菌床袋的材料和形态没有特别限定，例如可以使用市面上销售的可容纳2000g～3000g培养基材的真菌床袋。将针叶树细粒状碎屑(例如1000～2000g)、水和菌丝体活性营养素装填到真菌床袋中，作为培养基材料；加热灭菌后，使用接种器将第二代培养菌株接种至真菌床袋中进行培养。
[0052]
培养条件不作特别限定，可以在适合菌株生长的范围内适当地设定，例如温度18～25℃、湿度55％～75％。另外，培养室中的氧浓度优选为 210,000ppm以上，并且培养室中的二氧化碳浓度优选为1,000ppm以下。此外，可以适当地设定培养时间，以菌丝体和子实体原基的产生为指标，例如，可以设定约60至130天的时间。
[0053]
(4)第四培养工序：将绣球菌mh-3，第二代培养菌株的菌丝和/或子实体，以及第三代培养菌株的菌丝和/或子实体的混合体，接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株。
[0054]
在第四培养工序中，琼脂培养基的营养成分可以采用第一培养工序中的相同，优选的，琼脂培养基是斜面琼脂培养基。在由绣球菌mh-3，第二代培养菌株的菌丝和/或子实体，以及第三代培养菌株的菌丝和/或子实体组成的混合体中，可以使用通过将子实体的内表面和外表面切割成2mm至10mm 的正方形并分解组织而获得的子实体。培养条件不作特别
限制，培养温度可以设为18～25℃，培养天数可设为约45至90天。
[0055]
相比于绣球菌mh-3，上述各菌株的混合体中包含着更强大的突变菌株、进化菌株和优良菌株。通过使用这样的混合体，可以稳定地获得包含高浓度 (60重量％以上)、高纯度的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的绣球菌。
[0056]
(5)第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在蘑菇栽培用瓶内，将第一代配合菌接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代配合菌株。
[0057]
在第五培养工序中，关于构成培养基材的针叶树细粒状碎屑和菌丝体活性营养素，可以使用与第二培养工序同样的方法制备。另外，蘑菇栽培用瓶也可以使用与第二培养工序相同类型的培用瓶。此外，可以采用与第二培养工序相同的方式设定培养条件和培养时间。
[0058]
(6)第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内，将第二代配合菌株接种至第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配合菌株。
[0059]
在第六培养工序中，针叶树细粒状碎屑和菌丝体活性营养素，可以使用与第三培养工序同样的方法制备。另外，真菌床袋也可以使用与第三培养工序相同类型的真菌床袋。此外，可以采用与第三培养工序相同的方式设定培养条件和培养时间。
[0060]
本发明实施例中，绣球菌干燥粉末的制备方法包括以下步骤：
[0061]
干燥工序：将上述培养方法培养得到的第三代配合菌株干燥，得到绣球菌干燥粉末。
[0062]
优选的，在干燥工序中，用于干燥的第三代配合菌株为第三代配合菌株的子实体。干燥方法和条件可以适当设定，例如可以用在65℃～80℃的温度下干燥的方法，或者用冷冻干燥的方法。通过这样的方法将干燥的绣球菌粉碎成期望的尺寸，即可获得绣球菌干燥粉末。
[0063]
本发明实施例制备的绣球菌干燥粉末含有60重量％以上的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)。
[0064]
本发明实施例中，可以通过溶剂萃取的方法从绣球菌干燥粉末中提取得到含有β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的绣球菌提取物。
[0065]
在对绣球菌干燥粉末进行提取时，所用的溶剂可以使用水性溶剂或非水性溶剂，优选的，使用水性溶剂。水性溶剂包括水或者通过向水中添加碱或其他碱性物质而获得的碱性水、通过添加与醇相容的有机溶剂而获得的水性溶剂、含有酸或酸性物质的酸性水等。另外，非水性溶剂的实例包括极性有机溶剂，例如二甲基亚砜(dmso)和二甲基甲酰胺(dmf)。
[0066]
当用水对绣球菌干燥粉末进行提取时，优选使用热水提取。这种情况下的热水温度优选控制在80～125℃的范围内。
[0067]
本发明的生理机能活性剂包括由绣球菌干燥粉末提取得到的绣球菌提取物作为第一活性成分，所述绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量％的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)。
[0068]
β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)已知具有癌症预防、治疗、糖尿病、高血压治疗、抗癌(肿瘤)作用、降血糖作用、免疫刺激作用、抗高血压作用等生理机能活性。
[0069]
因此，本发明实施例的生理机能活性剂可以直接使用其活性成分——绣球菌提取物，也可以通过添加药学上可接受的载体、添加剂等来配制药剂。
[0070]
上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶解剂、溶解辅助剂、着色剂、除味除臭剂、安定化剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、ph调整剂、防腐剂、抗氧化剂、吸附载体等，可以根据常法进行适当地使用。
[0071]
本发明的生理机能活性剂在制备时，可选择的添加剂包括但不限于：精制水、食盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等药学上可接受的有机溶剂，动植物油、乳糖、甘露醇、山梨醇、结晶纤维素、羟脯氨酸纤维素、淀粉、玉米淀粉、无水硅酸、硅酸铝镁、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯烃、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性右旋糖苷、羧甲基钠、卵磷脂、甲基纤维素、乙基纤维素、溴仿(三溴甲烷)、阿拉伯树胶、锰、霉素、琼脂、聚乙烯二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、肉毒杆菌酸辛酯、肉豆蔻酸异丙烯、高级醇、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白等。
[0072]
本发明的生理机能活性剂可以通过口服、直肠、静脉、肌肉注射或胃肠外给药等方式施用于目标对象。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如液体(例如注射剂)、分散剂、混悬剂、片剂、丸剂、滴丸、粉剂、栓剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、糖浆剂、冲剂、胶囊剂、喷雾剂、缓释剂、注射剂、锭剂、吸入剂、药膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、贴剂等；也可使其活性成分与一种或多种载体或其它药物混合，制成所需剂型。
[0073]
通过将本发明实施例的生理机能活性剂配合到功能性食品(饮料)中，能够赋予功能性食品(饮料)以各种生理机能活性效果。
[0074]
本发明的功能性食品(饮料)在制备时，可以选择的配合用的成分包括但不限于：糖类、糖醇类、肉类和鱼类提取物、蛋白质、肽、氨基酸类、食物纤维、维生素类、淀粉类、糊精、油脂类、酒精类、盐类、调味料、香辛料、保存料、甜味料、着色料、品质改良剂、香料等。
[0075]
另外，β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的美白效果、皱纹改善等效果也广为人知。因此，通过将本发明实施例的生理机能活性剂配合到化妆品中，能够对化妆料赋予这些效果。
[0076]
本发明的功能性化妆品在制备时，可以选择的配合用的成分包括但不限于：水(精制水、温泉水、深层水等)、油剂、表面活性剂、金属肥皂、保湿剂、凝胶化剂、酒精类、水溶性高分子、粉末、ph调整剂、皮膜形成剂、树脂、紫外线防御剂、包接化合物、抗菌剂、香料、除臭剂、盐类、清凉剂可配合动物、微生物提取物、植物提取物、血液循环促进剂、捕收剂、抗脂泄漏剂、活性氧消除剂、细胞赋活剂、角质溶解剂、酶、激素类、维生素类等。
[0077]
在本发明实施例的生理机能活性剂施用于人体时，以绣球菌提取物的含量为基准，其最适施用量为50～330mg/50kg体重。当施用量超出这个范围时，即使浓度加大，其对人体生理机能活性的促进效果无更明显的提高。
[0078]
另外，本发明的生理机能活性剂及包含该生理机能活性剂的功能性食品的施用对象为18岁以上的人。本发明生理机能活性剂，在给少年期至青年
·
成年期(18岁以上)的人施用时，生理活性效果更显著。
[0079]
此外，本发明的生理机能活性剂中包含的绣球菌提取物一旦经口服用，便会通过刺激性感受其活性效果，在第二次口服时，感受性有明显增加倾向。因此，为了提高生理功能活性效果，优选连续多次施(食)用本发明的生理机能活性剂及包含该生理机能活性剂的功能性食品。
[0080]
来自有蘑菇食文化国家/地区的人和吃蘑菇类的人对本发明绣球菌提取物中的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的抗体具有更强的感受性，而来自无蘑菇食文化国家的人和不吃蘑
菇类的人对绣球菌提取物的抗体感受性低。因此，将本发明的生理机能活性剂及包含该生理机能活性剂的功能性食品给没有吃过绣球菌的人服用，能够提高其感受性；通过两次以上的摄取能够发挥绣球菌提取物的生理机能活性效果。
[0081]
优选的，除了绣球菌提取物(β-1,3-d-葡聚糖(6分歧))，本发明的生理机能活性剂还含有从少孢根霉中产生的酶发酵物(map酶发酵物)。优选的，在本发明的生理机能活性剂中，酶发酵物的含量为25～165mg/50kg体重。作为根霉属细菌，可以使用可商购的细菌，例如购自南方健康会社的map酵母等。
[0082]
通过将本发明的绣球菌提取物(β-1,3-d-葡聚糖(6分歧))和map酶发酵物配合制备成生理机能活性剂，并将此生理机能活性剂施用于人，相比于单独施用仅含有绣球菌提取物的生理机能活性剂，更能促进淋巴细胞的增加。因此，通过将map酶发酵物添加到本发明的生理机能活性剂，能够进一步增强其生理机能活性效果。
[0083]
优选的，除了绣球菌提取物(β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)，本发明的生理机能活性剂还含有大豆发酵异黄酮。优选的，在本发明的生理机能活性剂中，大豆发酵异黄酮的含量为25～150mg/50kg体重。
[0084]
通过将本发明的绣球菌提取物(β-1,3-d-葡聚糖(6分歧))和大豆发酵异黄酮配合制备成生理机能活性剂，并将此生理机能活性剂施用于人，相比于单独施用仅含有绣球菌提取物的生理机能活性剂，更能促进淋巴细胞的增加。因此，通过将大豆发酵异黄酮添加到本发明的生理机能活性剂，能够进一步增强其生理机能活性效果。
[0085]
优选的，除了绣球菌提取物(β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)，本发明的生理机能活性剂还含有矿物质吸收促进剂。优选的，在本发明的生理机能活性剂中，矿物质吸收促进剂的含量为25～150mg/50kg体重。可选的，矿物质吸收促进剂可以使用日本专利jp5626970b2公开的矿物质吸收促进剂，该矿物质吸收促进剂包含通过对野草类、蔬菜类、果实类、蘑菇类和海藻类中的一种或多种的提取液或榨汁液进行酒精发酵和/或乳酸发酵而获得的发酵产物。
[0086]
通过将本发明的绣球菌提取物(β-1,3-d-葡聚糖(6分歧))和矿物质吸收促进剂制备成生理机能活性剂，并将此生理机能活性剂施用于人，能够进一步提高生理机能活性效果。
[0087]
本发明的生理机能活性剂，其搭配使用方式不限于以上实施形态。接着，通过具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不限定于以下的实施方式。
[0088]
实施例1绣球菌干燥粉末的制备
[0089]
(1)第一培养工序(试管培养)
[0090]
主要器具采用了试管和斜面琼脂培养基(以下记载为“k-2”)。
[0091]
具体来说，k-2的组成是纯净水1l，蛋白胨1.2g，爱表斯锭(ebios，啤酒酵母片，购自日本朝日集团食品株式会社)3.6g，氯化钙0.6g，粉末琼脂 15g，针叶树热水提取液(10ml)，菌丝体活性营养素(kn-1)3.0g，斜面培养基的ph值为6.0～7.0。
[0092]
将上述k-2保存在试管里。另外，k-2的灭菌条件设为110～115℃，压力2气压；灭菌30分钟后，放置冷却。在该k-2里接种并培养绣球菌mh-3(国际特许微生物保藏编号fermbp-17221)，得到了第一代试管培养菌株(以下记载为n-1)。
[0093]
(2)第二培养工序(瓶装培养)
[0094]
准备培养基的瓶容器和培养基材。瓶容器采用能容纳400g～500g培养基材的蘑菇栽培用的耐热塑料瓶(市面上销售的即可)。
[0095]
作为培养基材的菌株培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片 (装填重量为150g～450g)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(kn-2)20％以下构成(总装填重量为400g～500g)。
[0096]
该菌株培养基经过灭菌温度120～121℃、压力2气压3小时处理后，置于18℃以下的环境12小时进行冷却。此后，在洁净室内使用接种器在菌株培养基上接种n-1。培养室的温度保持在18～25℃、湿度55％～75％之间。另外，培养室内的氧气浓度注意维持在210,000ppm以下，室内的二氧化碳浓度不超过1,000ppm。在培养室培养n-1，经过培养期间60日～90日，即可产生菌丝体。在下文中，第二培养工序得到的第二代培养菌株记为“mh-819”。
[0097]
(3)第三培养工序(菌床培养)
[0098]
为了培育绣球菌的菌体，准备了可以容纳2000g～3000g培养基材的菌床袋。
[0099]
作为培养基材的菌床培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片 (装填重量为1000g～2000g)，水65％，菌丝体活性营养素(kn-3)20％以下组成(总装填重量2000g～3000g)。该菌床培养基先经过温度120～121℃、压力 2气压的灭菌处理3小时后，再在18℃以下的环境放置12小时进行冷却。
[0100]
此后，在洁净室内使用接种器，将mh-819接种到菌床培养基。培养室维持在温度18～25℃，湿度55％～75％中。另外，培养室内的氧气浓度注意维持在210,000ppm以下，室内的二氧化碳浓度不超过1,000ppm。在培养室培养mh-819，经过培养期间60日～90日后，即可产生菌丝体，菌丝体产生后10日～40日内，产生子实体原基。在下文中，第三培养工序得到的第三代培养菌株记为“mh-835”。
[0101]
(4)第四培养工序(试管培养)
[0102]
准备斜面琼脂培养基k-2(试管)。斜面琼脂培养基由纯净水1l，蛋白胨 1.2g，爱表斯锭3.6g，氯化钙0.6g，粉末琼脂15g，针叶树热水提取液(10ml)，菌丝体活性营养素(kn-1)3.0g。同时，试管的斜面琼脂培养基的ph值为6.0～ 7.0。斜面琼脂培养基的灭菌环境设为110～115℃，压力2气压；灭菌30分钟后，放置冷却。
[0103]
将在第一培养工序中使用的绣球菌mh-3(国际特许微生物保藏编号 ferm bp-17221)、mh-819的菌丝体和子实体(组织分解)以及mh-835的菌丝体和子实体(组织分解)的混合体，在清洁室内，使用接种器接种至斜面琼脂培养基k-2(试管)中进行培养，得到第一代配合菌株。培养温度控制在 18℃～25℃之间。经过培养天数45日～90日，即可产生菌丝体。在下文中，第四培养工序得到的第一代配合菌株记为“mh-78”。
[0104]
(5)第五培养工序(瓶装培养)
[0105]
准备培养基的瓶容器和培养基材。培养基的瓶容器使用蘑菇栽培用的耐热塑料瓶。
[0106]
作为培养基材的菌株培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎屑 (装填重量为420g～480g)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(kn-4)20％以下组成。该菌株培养基经过温度120～121℃、压力2气压的灭菌处理3小时后，置于18℃以下的环境12小时进行冷却。培养室温度保持在18～25℃、湿度 55％～75％之间。同时，培养室内的氧气浓度注意保持在210,000ppm以下，二氧化碳的浓度不超过1,000ppm。
[0107]
在清洁室里使用接种器，将mh-78接种到菌株培养基中进行培养，得到第二代配合菌株。经过培养期间60日～90日，即产生菌丝。在下文中，第五培养工序得到的第二代配合菌株记为“mh-78a”。
[0108]
(6)第六培养工序(菌床培养)
[0109]
准备用于培育绣球菌菌体的菌床袋。
[0110]
作为培养基材的菌床培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片 (装填重量为2.4kg～2.8kg)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(kn-5)20％以下组成。该菌床培养基先经过温度120～121℃、压力2气压的灭菌处理3 小时后，再在18℃以下的环境放置12小时进行冷却。培养室温度保持在18～ 25℃、湿度55％～75％之间。同时，培养室内的氧气浓度注意保持在 210,000ppm以下，二氧化碳的浓度不超过1,000ppm。
[0111]
此后，在洁净室内使用接种器，将mh-78a接种到菌床培养基中进行培养，得到第三代配合菌株。经过培养期间60日～90日后，即可产生菌丝体，菌丝体产生后10日～40日内，产生子实体原基。在下文中，第六培养工序得到的第三代配合菌株记为“mh-78b”。
[0112]
(7)粉末化工序
[0113]
把mh-78b置于65℃～80℃环境中12小时～18小时使之干燥，通过100目筛或200目筛，得到绣球菌干燥粉末，记载为mh-3-a。
[0114]
实施例2绣球菌干燥粉末的成分分析
[0115]
以实施例1中得到的绣球菌干燥粉末(mh-3-a)作为待测样品a、b，在财团法人日本食品分析中心进行了成分分析(每100g)。结果如表1所示。
[0116]
表1绣球菌干燥粉末(mh-3-a)的成分分析表
[0117]
分析试验项目a(mh-3-a)结果数值b(mh-3-a)结果数值水分4.9g3.0g蛋白质3.1g3.4g脂质1.4g1.1g灰分1.1g1.0g碳水化合物89.5g91.5g能量192kcal195kcal钠3.1mg3.6mgβ-1,3-d-葡聚糖(6分歧)61.9g63.2g
[0118]
如表1所示，在实施例1中得到的绣球菌干燥粉末(mh-3-a)a和b中，每100g包含60g以上(60重量％以上)的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)。
[0119]
实施例3绣球菌干燥粉末(mh-3-a)的溶媒提取
[0120]
对绣球菌干燥粉末(mh-3-a)进行提取，并测定了糖蛋白比的成分量。
[0121]
采用下述方法从绣球菌干燥粉末中提取绣球菌提取物，并测定其成分量。
[0122]
1、“热水提取1倍”法：从绣球菌子实体，用温风干燥制得的，过100 目筛得到的干燥粉末50g。在50g干燥粉末中加入700ml etoh(乙醇)，放置 2天进行脱脂处理，得到提取物和残渣组分(或沉淀组分)。然后，在残渣组分中加入500ml热水(121℃)，自动高压灭菌处理2小时，得到提取物
①
和残渣组分
②
。接着，将提取物
①
和残渣组分
②
分开。在提取物
①
中加入4l 乙醇，在4℃下，进行5分钟的3000rpm搅拌处理，在得到的沉淀组分中加入400ml 50％
乙醇(200ml水 200ml乙醇)，进行3000rpm搅拌处理5分钟，再加入丙酮，放置1天得到了热水提取物
③
。
[0123]
2、“热水提取4倍”法：在提取物
①
中加入4l乙醇，在4℃下，进行5 分钟的3000rpm搅拌处理，在得到的沉淀组分中加入400ml 50％乙醇 (200ml水 200ml乙醇)，进行3000rpm搅拌处理5分钟，在得到的上清液中加入800ml乙醇，并进行5分钟的3000rpm搅拌处理，接着加入丙酮放置1天，得到热水提取物4倍。
[0124]
3、“冷碱提取(1)”法：在残渣组分
②
加入500ml的10％naoh/5％尿素, 在4℃中放置2天，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到冷碱提取物 (1)—
④
。
[0125]
4、“冷碱提取(2)”法，在
④
的残渣组分加入500ml的10％naoh/5％尿素，在4℃中放置2天，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到冷碱提取物(2)—
⑤
。
[0126]
5、“热碱提取”法：在
⑤
的残渣组分加入500ml的10％naoh/5％尿素，在65℃中处理1小时，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到热碱提取物—
⑥
。
[0127]
各组提取物成份量的测定：
[0128]
采用把葡萄糖作为标准物质的苯酚-硫酸法测定糖含量，并采用把牛血清白蛋白(bsa)作为标准物质的bca法测定蛋白含量。同时，关于糖组成，用2n-三氯乙酸完全加水分解、还原、乙酰化后，采用气相色谱法分析。测定结果如表2所示。
[0129]
表2各组提取物成份量的测定结果表
[0130][0131]
绣球菌干燥粉末(50g)，过100目筛
[0132]
用糖蛋白比分析可知，采用实施例1制备得到的绣球菌干燥粉末是含糖量为90％的高纯度多糖体。其中，“热水提取4倍”法得到的提取物的纯度尤其的高，而在“冷碱提取(1)”法得到的提取物中β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的含量高达8.97g/50g绣球菌干燥粉末。然而，ohno等人(ohno大野尚仁,naohito 宿前利郎,miura中岛三博,等.antitumor 1,3-β-glucan from cultured fruitbody of sparassis crispa[j].biological&pharmaceuticalbulletin,2000,23(7):861-872.)对绣球菌干燥粉末进行提取，其得到的提取物中糖含量仅为64～70％，蛋白含量仅为0.8～3.0％，β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)含量仅为0～3.68g/25g绣球菌干燥粉末，远低于本实施例制备得到的绣球菌提取物的糖含量。
[0133]
对比例绣球菌干燥粉末的制备和成分分析
[0134]
1、绣球菌干燥粉末的制备
[0135]
本对比例中采用的微生物为从山上采集而来的天然绣球菌(以下记载为“mh-1”)，
通过下述两阶段的方法培养得到绣球菌的子实体。
[0136]
(1)第1阶段，进行了mh-1的接种和培养。主要器具采用了试管和斜面琼脂培养基。
[0137]
试管内使用的琼脂培养基，由纯净水1l，蛋白胨1.2g，ebios 3.6g，氯化钙0.6g，hyponex 0.6ml，香蕉粉末48g，蜂蜜粉末18g，琼脂粉末20g 调制而成，ph值6.0～7.0。同时，琼脂培养基的灭菌条件为：在110～115℃、压力2气压下灭菌30分钟，之后冷却。在下文中，这种琼脂培养基记载为“k-1”。
[0138]
在上述方法制作的斜面琼脂培养基k-1中接种mh-1，开始菌株的培养。 mh-1在琼脂培养基中培育成长，在20℃中经过45日～90日的培养，若能产生菌丝体，则可确认绣球菌(mh-1)完成培养。此后每65日～120日反复进行mh-1接种。在下文中，这种试管培养菌株记载为“m-1”。
[0139]
(2)第2阶段，准备制作绣球菌子实体培养基的瓶容器和培养基材。
[0140]
主要器具使用市场上销售的蘑菇栽培用的耐热塑料瓶。其次，为了实现绣球菌子实体的生产，培养基材使用了锯末。
[0141]
耐热塑料瓶内装填的培养基材，由落叶松锯末1kg、纯净水500ml、蛋白胨1.0g、ebios 45g、氯化钙0.6g、香蕉粉末6g、蜂蜜粉末2g、小麦粉 100g、氯化镁0.5g制作而成。在下文中，这种瓶装培养基记载为“锯末培养基1”。该锯末培养基1的ph值调制为6.0～7.0，锯末培养基1的灭菌条件为：在120～121℃、压力2气压下灭菌30分钟，之后冷却。
[0142]
接着，在放冷后的锯末培养基1上接种m-1。在下文中，在锯末培养基 1上接种了m-1的培养基记载为“锯末培养基2”。
[0143]
锯末培养基2的培养条件维持在温度18～25℃、湿度55％～75％，开始培养绣球菌丝、子实体。m-1经过60日～90日的培养，促进菌丝成长，从而绣球菌的子实体的原基逐渐产生。此后，通过在温度18～25℃、湿度 75％～85％下20日～50日的培养，原基培养后产生了绣球菌子实体。在下文中，将该绣球菌子实体记载为“m-2”。
[0144]
接着，将获得的m-2，通过80℃～100℃、12小时～18小时用温风进行干燥，得到绣球菌干燥体，过100目筛使之粉末化，获得绣球菌干燥粉末。在下文中，将这种绣球菌干燥粉末记载为“m-3”。
[0145]
2、绣球菌干燥粉末m-3的成分分析
[0146]
绣球菌干燥粉末m-3的成分分析
[0147]
以上述方法制备得到的绣球菌干燥粉末(m-3)作为待测样品c，在财团法人日本食品分析中心进行了成分分析(每100g)。结果如表3所示。
[0148]
表3绣球菌干燥粉末(m-3)的成分分析表
[0149]
分析试验项目c(m-3)结果数值水分8.8g蛋白质6.9g脂质0.8g纤维6.3g灰分3.1g糖分74.1gβ1,3-d-葡聚糖(6分歧)43.6g
[0150]
如表3所示，绣球菌干燥粉末(m-3)中含有43.6g/100g的β-1,3-d-葡聚糖 (6分歧)，蛋白质和糖分含量较少。与实施例1中制备得到的绣球菌干燥粉末(mh-3-a)相比，绣球菌干燥粉末(m-3)的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的含量较少。
[0151]
采用实施例1的绣球菌干燥粉末的制备方法，在第四培养工序中得到了由绣球菌mh-3(国际特许微生物保藏编号ferm bp-17221)、该绣球菌mh-3 培育出的mh-819的菌丝体和子实体(组织分解)以及mh-835的菌丝体和子实体(组织分解)的混合体。该混合体中包含着更强大的变异株、进化株和优良株菌种。虽然绣球菌的菌株对环境的适应性较弱，仅靠菌类的种族系的保存和培养很难，但根据本发明的绣球菌干燥粉末的制备方法，可以稳定地获得包含高浓度(60重量％以上)、高纯度的β-1,3-d-葡聚糖(6分歧)的绣球菌干燥粉末。
[0152]
实施例4绣球菌提取物的感受性试验
[0153]
1、各种小鼠品系的探讨
[0154]
采用实施例2中提及的“冷碱提取(1)”法提取实施例1中获得的绣球菌干燥粉末，以获得绣球菌提取物(以下记载为“mhg”)。
[0155]
测试了不同品系的小鼠对mhg的感受性。具体来说，测试了各种近交系小鼠的脾细胞的mhg感受性。从8个小鼠品系中，即c57bl/6，c3h/hen， c3h/hej，akr/n，balb/c，cba/j，dba/1和dba/2(以下称为“h小鼠”) 摘离出脾脏。
[0156]
将脾细胞与mhg(100mg/ml)共存培养48小时，并通过elisa测定培养基上清液中的ifn-γ的产生，测定结果如图1所示。由图1可知，来自 c57bl/6，c3h/hen，c3h/hej，akr/n，balb/c和cba/j小鼠的白细胞对mhg诱导产生的ifn-γ非常少；然而，dba/1和h小鼠的白细胞，在 mhg的诱导下，产生了大量的ifn-γ。因此，可知来自dba/1和h小鼠的白细胞对mhg具有较高的感受性，很强地诱导ifn-γ产生。
[0157]
由此表明，根据国家食蘑菇文化的有无和人种的不同，人体对mhg的感受性也不同。
[0158]
2、性别、年龄和环境因素影响的测定
[0159]
(1)为了进一步研究mhg的感受性，对不同年龄、性别和饲养环境的h 小鼠进行了比较研究。
[0160]
首先，研究了相同年龄的h小鼠的性别差异。小鼠中形成的肠道细菌层取决于它们的饲养环境。众所周知，肠道细菌层的差异与免疫反应有关。因此，分别从三家动物公司购买了相同年龄的雄性、雌性h小鼠，并测定了其对mhg的感受性。
[0161]
从8-9周龄的雄性、雌性h小鼠中摘离出了脾脏。将脾细胞与 mhg(100mg/ml)共存培养48小时，并通过elisa测定培养基上清液中的 ifn-γ的产生。elisa测定结果表明，无论是来自哪个动物公司的小鼠，mhg 都会诱导ifn-γ的产生，其诱导能力没有差异；此外，无论是雄性、雌性h 小鼠，mhg均可诱导ifn-γ的产生，其诱导能力没有差异。
[0162]
(2)接下来探讨实验鼠的年龄对mhg感受性的影响。
[0163]
从3、8和17周龄的雄性h小鼠中摘离出脾脏。将脾细胞与 mhg(100mg/ml)共存培养48小时，并通过elisa测定培养基上清液中的 ifn-γ的产生，测定结果如图2所示。
[0164]
如图2所示，来自8周龄至17周龄h小鼠的脾细胞对mhg有较高的感受性，并显示出明显的ifn-γ产生；而来自3周龄h小鼠的脾细胞中由 mhg诱导产生的ifn-γ明显少于8周龄至17周龄的。由此可知，实验鼠的年龄会影响mhg诱导ifn-γ的产生。
[0165]
上述测定结果表明，低周龄实验鼠对mhg的感受性低，并且mhg感受性细胞会在8周龄以上的h小鼠中出现。另外，在19周龄h小鼠中检测到的抗体滴度要高于在8周龄小鼠中的抗体滴度。
[0166]
实验鼠2年相当于人类的老壮年，其寿命仅为3岁(相当于人类90岁)。因此，根据使用mhg的人的年龄不同，抗体和受体的反应也有所不同。由此可知，给少年期、青年期、成年期(即18岁以上)的人服用，mhg的生理活性效果会更加显著。
[0167]
(3)另外，当首次向h小鼠口服给予mhg时，与安慰剂组(生理盐水组) 相比，其体内的抗体反应，即对mhg的感受性增加。换言之，一旦口服给予mhg，就会因刺激而产生感受性，并且在第二次及之后继续服用，则感受性趋于显著增加。因此，通过连续多次服用，可以进一步提高mhg的生理机能活性效果。
[0168]
(4)图3是示出通过向人全血中添加mhg而进行的il-s产生的比较试验的结果图；在图中，“j”表示日本人，“k”表示韩国人，“c”表示中国人，“e”表示英国人。
[0169]
如图3所示，在对人体血液的测试中，来自有蘑菇食文化国家/地区的人和吃蘑菇类的人对mhg抗体具有更强的感受性(因为其体内有mhg抗体)；而那些来自无蘑菇食文化的国家/地区和不吃蘑菇类的人对mhg抗体的感受性较低。
[0170]
由上述结果可知，没有绣球菌食用经验的人在摄取mhg后，能提高其对mhg的感受性，因此可以通过第二次及多次的摄取来发挥mhg的生理机能活性效果。
[0171]
实施例5绣球菌提取物的施用量和最适浓度的探讨
[0172]
对绣球菌提取物mhg的施用量和最适浓度进行了测定。
[0173]
图4是示出通过向人全血中添加不同剂量(2μg～50μg)的mhg而进行的 il-s产生的比较试验的结果图。如图4所示，在对人体血液的测试中，相比于2μg和50μg，添加了10μgmhg的人全血表现出更强的il-s产生能力。
[0174]
在小鼠的口服试验中，对小鼠施用30μg～300μg/30g的施用剂量，并对施用量和作用效果(淋巴细胞数量)进行了测定，测定结果发现作用效果与施用量不成比例，在200μg/30g的施用剂量下，淋巴细胞数量增加量最高；而继续增加施用剂量，并未观察到更好的效果，因此确认了低浓度的效果。
[0175]
基于此，对mhg的最适浓度进行了探讨。从h小鼠中摘离出脾脏，并在mhg(500、250、125、62.5、31.3、15.7、0mg/ml)共存下培养脾细胞48 小时。通过elisa测定培养基上清液中的ifn-γ产生。根据mhg浓度，不同强度地增强了ifn-γ产生，并在100～200mg/ml时显示出了最大的活性。但是，高浓度的mhg(500mg/ml)反而降低了诱导ifn-γ产生的能力。
[0176]
接着，测定了由mhg产生的ifn-γ的物理活性。从h小鼠中摘离出脾脏，在mhg(100mg/ml)共存下培养脾细胞24～92小时，并通过elisa测定培养基上清液中的ifn-γ产生。在培养48小时后，观察到由mhg诱导的 ifn-γ产生，并在72小时后达到峰值。
[0177]
通过上述试验，在细胞水平上，mhg的剂量范围为2μg～10μg，最适剂量为10μg；在h小鼠动物体内水平上，mhg的施用剂量范围为30μg～ 200μg/30g，最佳施用剂量为200μg/30g；在h小鼠动物体外水平上，mhg 的最适浓度为100～200mg/ml，并且上述剂量/浓度并非作用于癌症患者、作为治疗辅助剂时的最适剂量/浓度，而是健康受试者的正常摄取量。
[0178]
对h小鼠的最佳施用剂量30μg～200μg/30g进行换算后，人在日常饮食中，或者在日常摄取的膳食补充剂、健康与美容补充剂中，mhg的最佳施用量为50～330mg/50kg体重，
并且无需大量服用。
[0179]
实施例6绣球菌提取物与功能性物质的协同效果
[0180]
探讨了mhg对食品机能性成分功能的增效作用。
[0181]
(a)map酵素发酵物
[0182]
使用的生物材料包括：mhg和少孢根霉(南方健康会社的map酵母)中生产的酶发酵物(map酶发酵物)。采集人的血液，向人全血中单独添加10μg 的mhg，单独添加5μg的酶发酵物，以及同时添加mhg和酶发酵物(10μgmhg 5μg酶发酵物)，测定体外淋巴细胞数量的变化。
[0183]
图5示出了在单独施用和组合施用时，mhg和map酶发酵物诱导产生淋巴细胞能力的比较结果，图中wbc表示白细胞，w表示周，map表示 map酶发酵物。从图5中可以看出，单独添加mhg时，能看到淋巴细胞的增加；单独添加map酶发酵物时，其并没有表现出机能活性效果；当mhg 与map酶发酵物并用时，淋巴细胞的数量比单独添加mhg时增加了。
[0184]
此外，在小鼠的口服试验中，对h小鼠单独服用mhg(200μg/30g体重) 时，淋巴细胞有所增加；当单独服用map酶发酵物(100μg/30g体重)时，其并没有表现出机能活性效果；当mhg与map酶发酵物并用时(200μg/30g 体重的绣球菌提取物mhg 100μg/30g体重的map酵素发酵物)，淋巴细胞的数量比单独服用mhg时增加了。
[0185]
对h小鼠的服用剂量进行换算后，人在日常饮食中，或者在日常摄取的膳食补充剂、健康与美容补充剂中，mhg和map酶发酵物的最佳并用施用量为330mg/50kg体重的绣球菌提取物mhg 165mg/50kg体重的map酵素发酵物，并且无需大量服用。
[0186]
(b)大豆发酵异黄酮
[0187]
大豆发酵异黄酮被认为是荷尔蒙类物质，对女性有益的研究很多，很少有关于其对小鼠进行口服研究的报道。并且，在本发明的先前基础试验中，均无法通过口服证实大豆发酵异黄酮对雌雄小鼠都有很大的生理活性。
[0188]
在本实施例中，采集人的血液，向人全血中单独添加10μg的mhg，单独添加5μg的大豆发酵异黄酮，以及同时添加mhg和大豆发酵异黄酮(10μgmhg 5μg大豆发酵异黄酮)，检测了体外淋巴细胞数量的变化。
[0189]
图6示出了在单独施用和组合施用时，mhg和大豆发酵异黄酮的诱导产生淋巴细胞能力的比较结果，图中wbc表示白细胞，w表示周，isf表示大豆发酵异黄酮。从图6中可以看出，单独添加mhg时，能看到淋巴细胞的增加；单独添加大豆发酵异黄酮时，其并没有表现出机能活性效果；当 mhg与大豆发酵异黄酮并用时，淋巴细胞的数量比单独添加mhg时增加了。
[0190]
此外，在小鼠的口服试验中，对h小鼠单独服用mhg(200μg/30g体重) 的情况下，能看到淋巴细胞的增加；在单独服用大豆发酵异黄酮(90μg/30g 体重)时，其并没有表现出机能活性效果；当mhg与大豆发酵异黄酮并用时 (200μg/30g体重的绣球菌提取物mhg 90μg/30g体重的大豆发酵异黄酮)，淋巴细胞的数量比单独服用mhg时增加了。
[0191]
对h小鼠的服用剂量进行换算后，人在日常饮食中，或者在日常摄取的膳食补充剂、健康与美容补充剂中，mhg和大豆发酵异黄酮的最佳并用施用量为330mg/50kg体重的绣球菌提取物mhg 150mg/50kg体重的大豆发酵异黄酮，并且无需大量服用。
[0192]
(c)矿物质吸收促进剂
[0193]
在本实施例中研究了矿物质吸收促进剂与mhg的协同增效作用。
[0194]
矿物质吸收促进剂选用日本专利jp5626970b2公开的矿物质吸收促进剂，该矿物质吸收促进剂包含通过对野草类、蔬菜类、果实类、蘑菇类和海藻类中的一种或多种的提取液或榨汁液进行酒精发酵和/或乳酸发酵而获得的发酵产物。
[0195]
在本实施例中，采集人的血液，向人全血中单独添加10μg的mhg，单独添加5μg的矿物质吸收促进剂，以及同时添加mhg和矿物质吸收促进剂 (10μg mhg 5μg矿物质吸收促进剂)，检测了体外淋巴细胞数量的变化。
[0196]
图7示出了在单独施用和组合施用时，mhg和矿物质吸收促进剂的诱导产生淋巴细胞能力的比较结果，图中wbc表示白细胞，w表示周，p表示矿物质吸收促进剂。从图7中可以看出，单独添加mhg时，能看到淋巴细胞的增加；单独添加矿物质吸收促进剂时，其并没有表现出机能活性效果；当mhg与矿物质吸收促进剂并用时，淋巴细胞的数量比单独添加mhg时增加了。
[0197]
此外，在小鼠的口服试验中，对h小鼠单独服用mhg(200μg/30g体重) 时，能看到淋巴细胞的增加；单独服用矿物质吸收促进剂(90μg/30g体重)时，其并没有表现出机能活性效果；当mhg与矿物质吸收促进剂并用时(200μg/30g体重的绣球菌提取物mhg 90μg/30g体重的矿物质吸收促进剂)，淋巴细胞的数量比单独服用mhg时增加了。
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对h小鼠的服用剂量进行换算后，人在日常饮食中，或者在日常摄取的膳食补充剂、健康与美容补充剂中，mhg和矿物质吸收促进剂的最佳并用施用量为330mg/50kg体重的绣球菌提取物mhg 150mg/50kg体重的矿物质吸收促进剂，并且无需大量服用。
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需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。