一种改造的人乳头瘤病毒52型L1蛋白及其用途

一种改造的人乳头瘤病毒52型l1蛋白及其用途
技术领域
1.本技术涉及生物技术领域，具体涉及一种新型人乳头瘤病毒蛋白，及由其形成的五聚体或病毒样颗粒，以及人乳头瘤病毒蛋白、五聚体或人乳头瘤病毒样颗粒在制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)是一类感染上皮组织的无包膜小dna病毒，目前已鉴定200余型，根据其感染部位的不同可分为黏膜型和皮肤型，黏膜型hpv主要感染泌尿生殖器、肛周及口咽部的黏膜皮肤，又可分为有转化活性的致癌型和诱发良性增生的低危型，致癌型有20多种，包括12种常见的高危型(hpv16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59)及10余种相对少见的可能/可疑高危型(hpv26、-30、-34、-53、-66、-67、-68、-69、-70、-73、-82)，其持续感染可诱发约100％的宫颈癌、88％的肛门癌、70％的阴道癌、50％的阴茎癌、43％的阴户癌及72％的头颈癌，其中宫颈癌是世界范围第三高发的妇女恶性肿瘤(在15-44岁女性群体中为第二高发妇女恶性肿瘤，仅次于乳腺癌)，年发病例约57万，死亡约31.1万，其中超过80％的发生在不发达国家及地区。
3.hpv52是世界范围内相对常见的优势流行病毒株，在宫颈癌组织中的检出率为3.5％，位列第六位。且值得注意的是，在中国正常或低度病变宫颈组织中，hpv52的检出率达2.8％和16％，均位居首位，另外在中国南方宫颈癌组织中hpv52的检出率仅次于hpv16和hpv18，位居第三位。
4.hpv主要衣壳蛋白l1自组装的病毒样颗粒(virus-like particle，vlp)主要诱发型别特异性中和抗体及保护活性。目前上市的4种hpv预防性疫苗均为l1vlp混合疫苗，分别是利用昆虫表达系统生产的hpv16/-18l1vlp二价苗(cervarix)、利用酵母表达系统生产的hpv16/-18/-6/-11l1vlp四价苗(gardasil)和hpv16/-18/-31/-33/-45/-52/-58/-6/-11l1vlp九价苗(gardasil-9)、利用原核表达系统生产的hpv16/-18二价苗(cecolin)。但目前仅gardasil-9包含hpv52 l1vlp。
5.目前较为常用的vlp表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统及昆虫表达系统。对比已上市的cervarix和gardasil的临床数据发现，hpv16 l1vlp在cervarix中的含量(20μg)仅为gardasil中的(40μg)二分之一，hpv18 l1vlp在cervarix中的含量与gardasil的相同(均为20μg)，但cervarix诱发的针对hpv16、hpv18的型别特异性中和抗体滴度、交叉中和活性、记忆b细胞数目及cd4 t细胞反应水平均较gardasil的高，这表明cervarix的免疫活性较gardasil的强。另外，昆虫细胞表达体系具有许多优势，相比于原核表达体系，昆虫细胞表达体系与病毒的天然宿主细胞的遗传距离相对接近(均为真核多细胞生物)，不含内毒素，蛋白在其中多为可溶性表达，无包涵体困扰；相比于酵母表达体系，昆虫细胞易于裂解，纯化工艺相对简单，而酵母细胞壁的破碎需采用高压均质法，而且宿主蛋白较多，纯化难度相对更大。故昆虫表达系统更具有研发疫苗的优势。但昆虫表达系统的发酵成本相对较高，因此提高l1vlp的表达水平和产量从而降低疫苗生产成本尤为重要。
6.研究发现，根据宿主细胞的偏性密码子优化抗原基因可以提高其表达水平，如采用哺乳动物细胞偏性密码子优化hpv11 l1基因，其在人胚肾细胞(293t)中的表达水平提高了至少100倍；在昆虫及酵母表达系统中，分析比较了hpv16 l1变异株的表达水平及vlp产量，发现当高频变异位点突变为优势氨基酸时，会提高l1表达水平及vlp产量，但当高频变异位点联合其它位点突变时，则对l1表达水平的影响是不确定的；在昆虫表达系统中，采用c端截短的方法对bpv1 l1进行改造，发现截短型的bpv l1的组装效率提高3倍。目前尚未见c端截短对蛋白表达量的影响的报道；在原核表达体系中，采用n端截短法对hpv16、-18、-31、-33、-45、-52、-58、-6、-11型别的l1进行改造，发现可上调l1表达水平的n端截短的氨基酸数目因型别不同而异，且没有规律。
7.本技术发现，通过对l1的n端、c端及高频变异位点进行优化改造，可以显著提高52l1vlp表达水平及产量，而且生产获得的hpv52 l1vlp可诱发高滴度的型别特异性中和抗体。


技术实现要素：

8.本技术的一些实施方案，提供一种新的优化改造的hpv52 l1蛋白、由其组成的五聚体或病毒样颗粒，及含该五聚体或病毒样颗粒的疫苗，并研究该疫苗在预防hpv感染和感染相关疾病中的用途。
9.本发明人经研究出人意料地发现，适当地对hpv52 l1蛋白的高频突变位点进行氨基酸取代、并对其n端和/或c端进行部分删除或氨基酸取代，可提高hpv52l1蛋白在昆虫细胞表达系统中的表达量，该优化改造的蛋白可组装成vlp，并可诱发针对hpv52的保护性免疫反应。
10.因此，根据本技术的一些实施方案，涉及一种优化改造的hpv52 l1蛋白，与野生型hpv52 l1蛋白(例如ncbi数据库aei61557.1序列对应的氨基酸序列)相比，包含选自以下的修饰或其组合：
11.第447位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸；
12.删除n端的1至20个连续的或不连续的氨基酸；
13.删除c端的1至25个连续的或不连续的氨基酸；
14.取代n端第1位至第20位中的一个或多个氨基酸；
15.取代c端第1位至第25位中的一个或多个氨基酸。
16.具体地，根据本技术的一些实施方案，提供了一种优化改造的hpv52 l1蛋白，其中所述改造的hpv52 l1蛋白与野生型hpv52 l1蛋白相比，具有选自以下的任一项特征或组合：
17.第447位氨基酸由天冬氨酸(d)突变为谷氨酸(e)；
18.删除n端的1-20个连续/不连续的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)；
19.删除n端的13个氨基酸并取代为丝氨酸(s)、丝氨酸-谷氨酸(se)、丝氨酸-谷氨酸-精氨酸(ser)、或脯氨酸-丝氨酸-谷氨酸-丙氨酸-苏氨酸(pseat)；
20.删除c端1-25个连续/不连续的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个)；
21.将c端1-23位氨基酸中的1个或多个碱性氨基酸取代为极性不带电荷氨基酸、非极性氨基酸和/或酸性氨基酸。
22.在具体的实施方案中，所述的碱性氨基酸为精氨酸(r)和/或赖氨酸(k)。
23.在具体的实施方案中，所述的极性不带电荷氨基酸为甘氨酸(g)、丝氨酸(s)和/或苏氨酸(t)。
24.在具体的实施方案中，所述非极性氨基酸为丙氨酸(a)和/或缬氨酸(v)。
25.在具体的实施方案中，所述酸性氨基酸为天冬氨酸(d)和/或谷氨酸(e)。
26.在具体的实施方案中，本技术所述优化改造的hpv52 l1蛋白在seq id no.1所示序列(ncbi数据库aei61557.1序列对应的氨基酸序列)基础上进行改造。
27.在具体的实施方案中，所述改造的hpv52 l1蛋白选自52l1d447eδc19、52l1δn2、52l1δn4、52l1δn5、52l1δn8、52l1δn10、52l1δn13、52l1δn15、52l1δn18、52l1δn20、52l1cs1、52l1cs2、52l1cs3、52l1cs4、52l1cs5、52l1cs6、52l1cs7、52l1cs8、52l1cs9、52l1δn13cs1、52l1δn13cs2、52l1δn13cs3、52l1ns1δc19、52l1ns1δc25、52l1ns2δc19、52l1ns3δc19、52l1ns4δc19、52l1δn14δc25，其氨基酸序列如seq id no.2至seq id no.29所示。
28.野生型hpv52 l1蛋白也可来自但不限于ncbi数据库abu55797.1、aei61589.1、aif71344.1、apq44868.1、aei61581.1、aif71350.1、cad1814034.1等来自hpv52变异株的l1蛋白，相应变异株的c端改造l1蛋白，其修饰与上述改造的hpv52 l1蛋白相同，如通过序列比较来评价。
29.根据本技术的一些实施方案，提供编码本技术优化改造的hpv52 l1蛋白的多核苷酸。优选的，所述多核苷酸采用常用的表达系统的密码子优化，如大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等。特别优选地，所述多核苷酸采用昆虫细胞密码子优化。
30.根据本技术的一些实施方案，提供含有上述多核苷酸的载体，优选地，所述载体选自质粒、重组bacmid和重组杆状病毒。
31.根据本技术的一些实施方案，提供包含上述载体的细胞。优选地，所述细胞为大肠杆菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞，特别优选地，所述细胞为昆虫细胞。
32.根据本技术的一些实施方案，提供一种hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，该多聚体或病毒样颗粒含有上述改造的hpv52 l1蛋白，或由上述改造的hpv52 l1蛋白形成。
33.根据本技术的一些实施方案，提供一种预防hpv感染或hpv感染相关病变的疫苗，该疫苗含有上述多聚体或病毒样颗粒，其中所述多聚体或病毒样颗粒的含量为能诱发保护性免疫反应的有效量。优选地，该疫苗还可包含至少一种选自其他嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的hpv的五聚体或病毒样颗粒，这些五聚体或病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。上述疫苗通常还包含疫苗用赋形剂或载体。
34.在具体的实施方案中，所述疫苗含有上述hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，以及至少1种选自hpv2、-5、-6、-7、-8、-11、-16、-18、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34、-35、-38、-39、-40、-43、-44、-45、-51、-53、-56、-57、-58、-59、-61、-66、-67、-68、-69、-70、-73、-74、-77、-81、-82、-83、-85、-91的l1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
35.在具体的实施方案中，所述疫苗含有上述hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，以及hpv6、-11、-16、-18、-26、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-56、-58、-59、-68及-73的l1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
36.在具体的实施方案中，所述疫苗含有上述hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，以及hpv6、-11、-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45及-58的l1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
37.在具体的实施方案中，所述疫苗含有上述hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，以及hpv6、-11、-16、-18及-58的l1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
38.在具体的实施方案中，所述疫苗含有上述hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，以及hpv16、-18及-58的l1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
39.在具体的实施方案中，所述疫苗含有上述hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，以及hpv16、-18的l1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
40.本技术涉及一种可进一步提高免疫反应的新型疫苗，其包含上述hpv52 l1多聚体(例如五聚体)或病毒样颗粒，及佐剂。优选地，所使用的佐剂为人用疫苗佐剂。
41.根据本技术的一些实施方案，提供上述改造的hpv52 l1蛋白、多聚体(例如五聚体)、病毒样颗粒、疫苗在预防hpv感染或hpv感染相关疾病中的用途。
42.相关术语的说明及解释
43.根据本技术，术语“昆虫细胞表达系统”包括昆虫细胞、重组杆状病毒、重组bacmid及表达载体。其中昆虫细胞来源于市场上可得到的细胞，在此举例但不限于：sf9，sf21，high five。
44.根据本技术，术语“野生型hpv52 l1蛋白”的例子包括但不限于ncbi数据库中编号为aei61557.1的序列对应的l1蛋白。
45.根据本技术，术语“赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子、阴离子或非离子型表面活性剂，举例但不限于聚山梨酯80(tween-80)，离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
46.根据本技术，术语“佐剂”是指在临床上可应用于人体的佐剂，包括当前已获得批准的和将来可能获得批准的各种佐剂。
47.根据本技术，本技术的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。
48.根据本技术，本技术疫苗优选单位剂型使用，其中单位剂型中优化改造的hpv52 l1蛋白病毒样颗粒的剂量为5μg-80μg，优选20μg-40μg。
附图说明
49.图1a及图1b显示了本技术实施例4中野生型hpv52 l1及其28种突变体在昆虫细胞中的表达鉴定。结果显示，野生型hpv52 l1及其28种突变体均可在昆虫细胞中表达。图1a的
泳道1至15分别表示野生型hpv52l1、52l1d447eδc19、52l1δn2、52l1δn4、52l1δn5、52l1δn8、52l1δn10、52l1δn13、52l1δn15、52l1δn18、52l1δn20、52l1cs1、52l1cs2、52l1cs3、52l1cs4；图2a的泳道1至14分别表示52l1cs5、52l1cs6、52l1cs7、52l1cs8、52l1cs9、52l1δn13cs1、52l1δn13cs2、52l1δn13cs3、52l1ns1δc19、52l1ns1δc25、52l1ns2δc19、52l1ns3δc19、52l1ns4δc19、52l1δn14δc25。
50.图2a至图2k显示了本技术实施例5中纯化后获得的野生型hpv52l1、52l1d447eδc19、52l1δn13、52l1cs5、52l1cs6、52l1cs7、52l1cs9、52l1δn13cs1、52l1δn13cs2、52l1ns3δc19、52l1ns4δc19突变体蛋白的动态光散射分析结果。结果显示野生型hpv52l1、52l1d447eδc19、52l1δn13、52l1cs5、52l1cs6、52l1cs7、52l1cs9、52l1δn13cs1及52l1δn13cs2重组蛋白形成的病毒样颗粒水化动力学直径分别为123.1nm、104.9nm、71.56nm、108.9nm、130.4nm、116nm、124nm、111.9nm、127.2nm及129.9nm，颗粒组装的百分比均为100％；52l1ns3δc19未组装。图2a表示野生型hpv52l1；图2b表示52l1d447eδc19；图2c表示52l1δn13；图2d表示52l1cs5；图2e表示52l1cs6；图2f表示52l1cs7；图2g表示52l1cs9；图2h表示52l1δn13cs1；图2i表示52l1δn13cs2；图2j表示52l1ns3δc19；图2k表示52l1ns4δc19。
51.图3a至图3i显示了本技术实施例6中纯化后获得的野生型hpv52 l1、52l1d447eδc19、52l1cs5、52l1cs6、52l1cs7、52l1cs9、52l1δn13cs1、52l1δn13cs2及52l1ns4δc19的vlp的透射电镜观察结果。视野中可见大量的直径约40-55nm的病毒样颗粒，颗粒的大小与理论值相符，均一度好。bar＝100nm。图3a表示野生型hpv52l1；图3b表示52l1d447eδc19；图3c表示52l1cs5；图3d表示52l1cs6；图3e表示52l1cs7；图3f表示52l1cs9；图3g表示52l1δn13cs1；图3h表示52l1δn13cs2；图3i表示52l1ns4δc19。
52.图4显示了本技术实施例7中的野生型hpv52l1、52l1d447eδc19、52l1δn13、52l1cs5、52l1cs6、52l1cs7、52l1cs9、52l1δn13cs1、52l1δn13cs2、52l1ns3δc19及52l1ns4δc19 vlp接种小鼠后免疫血清hpv52中和抗体滴度的分析。***：p《0.001。
具体实施方式
53.下面将通过非限制性实施例进一步说明本技术，本领域技术人员公知，在不背离本技术精神的情况下，可以对本技术做出许多修改，这样的修改也落入本技术的范围。下面的实施例仅用于说明本技术，而不应视为限定本技术的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本技术的范围已界定在所附的权利要求中。
54.除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本技术的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本技术。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。
55.实施例1：突变l1蛋白的基因的合成及表达载体构建
56.28种突变l1蛋白，分别为：
57.1)52l1d447eδc19：模版为全长hpv52 l1基因(序列如seq id no.1所示)，其对应的氨基酸序列为ncbi数据库中编号为aei61557.1的序列(序列如seq id no.30所示)。编码hpv52 l1d447eδc19的多核苷酸序列经昆虫密码子优化设计，构建方式为删除hpv52 l1昆虫细胞密码子优化基因骨架的核苷酸1453-1509，并将核苷酸1339-1341由gac突变为gag(氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.31所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
58.2)52l1δn2：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-6(氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.32所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
59.3)52l1δn4：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-12(氨基酸序列如seq id no.4所示，核苷酸序列如seq id no.33所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
60.4)52l1δn5：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-15(氨基酸序列如seq id no.5所示，核苷酸序列如seq id no.34所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
61.5)52l1δn8：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-24(氨基酸序列如seq id no.6所示，核苷酸序列如seq id no.35所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
62.6)52l1δn10：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-30(氨基酸序列如seq id no.7所示，核苷酸序列如seq id no.36所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
63.7)52l1δn13：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-39(氨基酸序列如seq id no.8所示，核苷酸序列如seq id no.37所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
64.8)52l1δn15：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-45(氨基酸序列如seq id no.9所示，核苷酸序列如seq id no.38所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
65.9)52l1δn18：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-54(氨基酸序列如seq id no.10所示，核苷酸序列如seq id no.39所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
66.10)52l1δn20：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为删除hpv52 l1d447eδc19核苷酸4-60(氨基酸序列如seq id no.11所示，核苷酸序列如seq id no.40所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
67.11)52l1cs1：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为将hpv52 l1d447eδc19核苷酸1447-1449由aaa突变为gga，并在核苷酸1452后接入核苷酸序列aaaggtcctgcatcgagcgctcctagaacgtcgacggacggctcgggagtgggacgc(氨基酸序列如seq id no.12所示，核苷酸序列如seq id no.41所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
68.12)52l1cs2：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建
方式为将hpv52 l1d447eδc19核苷酸1447-1449由aaa突变为gga，并在核苷酸1452后接入核苷酸序列aaaggtcctgcatcgagcgctcctagaacgtcgacggacggctcgggagtggacggc(氨基酸序列如seq id no.13所示，核苷酸序列如seq id no.42所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
69.13)52l1cs3：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为将hpv52 l1d447eδc19核苷酸1447-1449由aaa突变为gga，并在核苷酸1452后接入核苷酸序列ggatcgcctgcatcgagcgctcctagaacgtcgacggacggctcgggagtgaaacgc(氨基酸序列如seq id no.14所示，核苷酸序列如seq id no.43所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
70.14)52l1cs4：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为将hpv52 l1d447eδc19核苷酸1447-1449由aaa突变为gga，并在核苷酸1452后接入核苷酸序列ggatcgcctgcatcgagcgctcctagaacgtcgacggacggctcgggagtggaccgc(氨基酸序列如seq id no.15所示，核苷酸序列如seq id no.44所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
71.15)52l1cs5：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为在hpv52 l1d447eδc19核苷酸1452后接入核苷酸序列gctggtcctgcctcttccgcacccgcgacttcaaccgctgccggcggagttgggtcg(氨基酸序列如seq id no.16所示，核苷酸序列如seq id no.45所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
72.16)52l1cs6：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为在hpv52 l1d447eδc19核苷酸1452后接入核苷酸序列gaagctcctgcctcttccgcacccggtacttcaaccggctcgaaagcggttgctgga(氨基酸序列如seq id no.17所示，核苷酸序列如seq id no.46所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
73.17)52l1cs7：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为在hpv52 l1d447eδc19核苷酸1452后接入核苷酸序列gctggtcctgcttcctcagctccagctacctcaaccgacggttctggtgtgaagcgc(氨基酸序列如seq id no.18所示，核苷酸序列如seq id no.47所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
74.18)52l1cs8：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为在hpv52 l1d447eδc19核苷酸1452后接入核苷酸序列gctggtcctgcttcctcagctccacgtacctcaaccgacggttctggtgtgaagcgc(氨基酸序列如seq id no.19所示，核苷酸序列如seq id no.48所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
75.19)52l1cs9：模版为hpv52 l1d447eδc19基因(序列如seq id no.30所示)，构建方式为将hpv52 l1d447eδc19核苷酸1441-1443由aga突变为ggt，将核苷酸1447-1449由aaa突变为ggc，并在hpv52 l1d447eδc19核苷酸1452后接入核苷酸序列tcgggtcctgcctcgagcgcccctagaacgtcgacgggtggctcggccgtgggtagc(氨基酸序列如seq id no.20所示，核苷酸序列如seq id no.49所示)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
76.20)52l1δn13cs1：模版为hpv52 l1δn13基因(序列如seq id no.37所示)，构建方式为将hpv52 l1δn13核苷酸1411-1416由aaactg突变为ggcttg，并在核苷酸1416后接入核苷酸序列tcgggtcctgcctcgagcgcccctagaacgtcgacgggtggctcggccgtgggtagc(氨基酸序列如seq id no.21所示，核苷酸序列如seq id no.50所示)，由上海生工生物工程技术服务
52l1cs9、pfastbac1-52l1δn13cs1、pfastbac1-52l1δn13cs2、pfastbac1-52l1δn13cs3、pfastbac1-52l1ns1δc19、pfastbac1-52l1ns1δc25、pfastbac1-52l1ns2δc19、pfastbac1-52l1ns3δc19、pfastbac1-52l1ns4δc19、pfastbac1-52l1δn14δc25。上述酶切、链接及克隆构建方法都是公知的，例如专利cn101293918b。
86.实施例2：hpv52 l1突变体基因的重组bacmid及重组杆状病毒的构建体
87.分别使用包含hpv52 l1突变体基因的重组表达载体pfastbac1-52l1d447eδc19、pfastbac1-52l1δn2、pfastbac1-52l1δn4、pfastbac1-52l1δn5、pfastbac1-52l1δn8、pfastbac1-52l1δn10、pfastbac1-52l1δn13、pfastbac1-52l1δn15、pfastbac1-52l1δn18、pfastbac1-52l1δn20、pfastbac1-52l1cs1、pfastbac1-52l1cs2、pfastbac1-52l1cs3、pfastbac1-52l1cs4、pfastbac1-52l1cs5、pfastbac1-52l1cs6、pfastbac1-52l1cs7、pfastbac1-52l1cs8、pfastbac1-52l1cs9、pfastbac1-52l1δn13cs1、pfastbac1-52l1δn13cs2、pfastbac1-52l1δn13cs3、pfastbac1-52l1ns1δc19、pfastbac1-52l1ns1δc25、pfastbac1-52l1ns2δc19、pfastbac1-52l1ns3δc19、pfastbac1-52l1ns4δc19、pfastbac1-52l1δn14δc25转化大肠杆菌dh10bac感受态，筛选获得重组bacmid。然后用重组bacmid转染昆虫细胞sf9，在sf9内扩增重组杆状病毒。重组bacmid的筛选及重组杆状病毒的扩增方法都是公知的，例如专利cn101148661b。
88.实施例3：hpv52 l1突变体基因在sf9细胞中的表达
89.sf9细胞分别接种28种hpv52 l1突变体基因的重组杆状病毒，进行hpv52 l1突变体蛋白的表达，27℃培养约80h后收发酵液，3000rpm离心15min，弃上清，用pbs洗涤细胞后，用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的，例如专利cn101148661b。
90.实施例4：hpv52 l1突变体蛋白的表达鉴定及表达量比较
91.取实施例3中所述表达不同hpv52 l1突变体及野生型hpv52 l1的细胞各1
×
106个，重悬于200μl pbs溶液中，采用超声破碎法(宁波新芝超声破碎仪，2#探头，100w，超声5s，间隔7s，总时间3min)破碎细胞，13000rpm高速离心30分钟，收取裂解上清，采用bca法测定各裂解上清中的总蛋白浓度并用pbs将其统一稀释至20ng/μl，分别各取10μl(即200ng)稀释后的裂解上清，加入6
×
上样缓冲液2μl，75℃变性8min，进行sds-page电泳及western印记鉴定并比较各突变体裂解上清中的l1蛋白含量(大小约为55kda)，各突变体l1蛋白的表达鉴定如图1所示，各突变体l1蛋白的表达量比较如表1所示，sds-page电泳及western印记鉴定的方法是公开的，例如专利cn101148661b。
92.使用本发明人制备的hpv52l1单克隆抗体包被酶标板，80ng/孔，4℃孵育过夜；使用5％bsa-pbst室温封闭2h，再用pbst洗板3次。用pbs将裂解上清进行连续2倍稀释，并且将hpv52l1 vlp标准品也进行梯度稀释，浓度从2μg/ml-0.0625μg/ml，分别加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育1h。用pbst洗板3次，加入1：3000稀释的hpv52l1兔多抗，每孔100μl，37℃孵育1h。用pbst洗板3次，加入1：3000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠igg(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用pbst洗板5次，每孔加入100μl opd底物(sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2m硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算裂解上清中改造的hpv52l1蛋白及野生型hpv52l1蛋白的浓度。
93.结果如表1所示，不同的改造方式对hpv52l1蛋白的表达水平产生了不同影响，其中部分改造的hpv52l1蛋白表达量有所提高，特别是52l1δn13、52l1cs7、52l1cs9、52l1δ
n13cs1、52l1δn13cs2、52l1δn13cs3、52l1ns3δc19、52l1ns4δc19，表达水平均在50mg/l以上，远高于野生型hpv52l1蛋白。
94.表1.hpv52 l1突变体蛋白表达量分析
[0095][0096]
实施例5：l1突变体蛋白的纯化及动态光散射粒径分析
[0097]
取l1突变体的细胞发酵液适量，用pbs重悬细胞，加入pmsf至终浓度1mg/ml，超声破碎(宁波新芝超声破碎仪，2#探头，200w，超声5s，间隔7s，总时间10min)，13000rpm离心30min，收集上清并使用pbs将其稀释至3-4mg/ml，向其中加入饱和硫酸铵至硫酸铵饱和度为30％，于4℃沉淀1-2小时，13000rpm离心30min，用适量重悬缓冲液(20mm na3po4，50mm dtt，300mm nacl，ph6.8)将其重悬，冰上过夜。层析纯化步骤在室温进行，层析前使用0.45μm滤器过滤样品，依次使用sp-ff阳离子交换层析和q-hp阴离子交换层析(100mm nacl，20mm na3po4，10mm dtt，ph 6.8上样)纯化。纯化产物采用组装缓冲液(500mm nacl，2mm cacl2，2mm mgcl
·
6h2o，20mm hepes，0.01％tween 80，ph6.0)于4℃进行vlp组装，组装3天后将其转入稳定缓冲液(500mm nacl，10mm组氨酸，0.01％tween 80，ph7.2)于4℃稳定2天。纯化结
果显示，改造的52l1蛋白的纯化得率较野生型52l1均有所提高，特别是52l1δn13、52l1cs7、52l1cs9、52l1δn13cs1、52l1δn13cs2、52l1δn13cs3、52l1ns3δc19、52l1ns4δc19，纯化得率在15mg/l以上。以上纯化方法均是公开的，例如专利cn101293918b、cn1976718a等。
[0098]
取纯化后的蛋白溶液进行dls粒径分析(zetasizer nano zs 90动态光散射仪，malvern公司)，结果如图2及表2所示，除了52l1δn13外，其余突变体的水力学直径均在100nm以上，与hpv52l1的直径接近；52l1δn13的水力学直径仅为71.56nm，提示其组装度可能较低。
[0099]
表2.hpv52 l1突变体蛋白dls分析
[0100]
蛋白名称水力学直径(nm)pdihpv52l1123.10.13452l1d447eδc19104.90.14252l1δn1371.560.14152l1cs5108.90.12652l1cs6130.40.11152l1cs71160.13552l1cs91240.14352l1δn13cs1111.90.0952l1δn13cs2127.20.13952l1ns3δc19149.40.23452l1ns4δc19129.90.125
[0101]
实施例6：hpv52 l1突变体vlp的透射电镜观察
[0102]
按照实施例5所述的层析纯化方法，对hpv52l1及其突变体蛋白分别进行纯化及组装，用组装好的vlp制备铜网，并用1％醋酸铀进行染色，充分干燥后使用jm-1400电镜(奥林巴斯)进行观察。hpv52 l1、hpv52 l1d447eδc19、hpv52 l1cs5、hpv52 l1cs6、hpv52 l1cs7、hpv52 l1cs9、hpv52 l1δn13cs1、hpv52 l1δn13cs2、hpv52 l1ns4δc19 vlp的透射电镜图分别如图3a-3i所示，这些突变体直径均在40-55nm之间。铜网制备及电镜观察的方法均是公开的，例如专利cn101148661b。
[0103]
实施例7：hpv52 l1突变体vlp的小鼠免疫及中和抗体滴度测定
[0104]
取4-6周龄的balb/c雌性小鼠，随机分组，每组5只，用0.1μg vlp免疫小鼠，皮下注射，于0、2、4周免疫，第3次免疫后2周尾部采血，分离血清。
[0105]
使用hpv52假病毒对免疫血清的中和抗体滴度进行检测，结果如表3及图4所示，52l1d447eδc19、52l1cs5、52l1cs6、52l1cs7、52l1cs9、52l1δn13cs1、52l1δn13cs2、52l1ns4δc19等昆虫细胞表达体系生产的vlp免疫血清的中和活性与hpv52l1的相当，而52l1δn13免疫血清无中和活性。假病毒制备及假病毒中和实验的方法均是公开的，例如专利cn104418942a。
[0106]
表3.hpv52 l1突变体在小鼠体内诱发的针对hpv52假病毒的中和抗体滴度
[0107]
抗原名称平均中和抗体滴度hpv52l18960
52l1d447eδc191024052l1δn13《2552l1cs51152052l1cs6832052l1cs71088052l1cs9960052l1δn13cs11152052l1δn13cs2960052l1ns4δc1910880
[0108]
综上所述，发明人发现，对hpv52l1的氨基酸序列进行改造，获得的突变体表达水平各不相同，组装程度、免疫活性均可能受到突变改造的影响，且没有明显的规律。因此，采用氨基酸序列改造的方法获得表达水平高、可有效组装、免疫活性好的hpv52l1突变体，具有不可预见性。本技术中筛选获得的优化改造的hpv52l1突变体可用于多价hpv预防性疫苗的配制及广谱hpv预防性疫苗的构建，具有很好的研发前景。
[0109]
序列说明
[0110]
seq id no.1：hpv52l1
[0111]
msvwrpseatvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkdymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpklkrpassaprtstkkkkvkr
[0112]
seq id no.2：52l1d447eδc19
[0113]
msvwrpseatvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpkl
[0114]
seq id no.3：52l1δn2
[0115]
mvwrpseatvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpkl
[0116]
seq id no.4：52l1δn4
[0117]
mrpseatvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpkl
[0118]
seq id no.5：52l1δn5
[0119]
mpseatvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpkl
[0120]
seq id no.6：52l1δn8
[0121]
matvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpkl
[0122]
seq id no.7：52l1δn10
[0123]
mvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpkl
[0124]
seq id no.8：52l1δn13
[0125]
mppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqf
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[0126]
seq id no.9：52l1δn15
[0127]
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[0128]
seq id no.10：52l1δn18
[0129]
mskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpkl
[0130]
seq id no.11：52l1δn20
[0131]
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[0132]
seq id no.12：52l1cs1
[0133]
msvwrpseatvylppvpvskvvstdeyvsrtsiyyyagssrlltvghpyfsikntssgngkkvlvpkvsglqyrvfriklpdpnkfgfpdtsfynpetqrlvwactgleigrgqplgvgisghpllnkfddtetsnkyagkpgidnreclsmdykqtqlcilgckppigehwgkgtpcnnnsgnpgdcpplqlinsviqdgdmvdtgfgcmdfntlqasksdvpidicssvckypdylqmasepygdslffflrreqmfvrhffnragtlgdpvpgdlyiqgsnsgntatvqssaffptpsgsmvtsesqlfnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmtlcaevkkestyknenfkeylrhgeefdlqfifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpglkgpassaprtstdgsgvgr
[0134]
seq id no.13：52l1cs2
[0135]
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fifqlckitltadvmtyihkmdatiledwqfgltpppsasledtyrfvtstaitcqkntppkgkedplkeymfwevdlkekfsadldqfplgrkfllqaglqarpglkgpassaprtstdgsgvdg
[0136]
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