一种具有粘弹性的海藻酸-壳聚糖生物惰性水凝胶的制作方法

1.本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种具有粘弹性的海藻酸-壳聚糖生物惰性水凝胶。


背景技术：

2.壳聚糖作为一种带正电荷的天然多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性。由于其具有良好的吸水保湿性能，作为水凝胶，在药物控制释放上具有良好的发展前途。海藻酸钠是一种广泛存在于各类棕色海藻中的天然高分子，可与多价阳离子形成简单的凝胶，成胶条件温和，该类凝胶对机体无毒性。海藻酸-壳聚糖水凝胶具有生物相容性好，模量可控等优点。
3.壳聚糖与海藻酸钠采用酰胺键交联，相较于传统的醛类，环氧类交联方式，没有残留活性基团，生物相容性好，材料致敏性低。4-(4,6-二甲氧基三嗪-2
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基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)作为交联剂使用，可以将氨基与多糖分子表面的羧基偶联在一起，相比于edc/nhs体系，具有更高的反应活性。
4.作为组织填充的水凝胶生物材料，需要具备生物惰性的特点，也即不造成细胞粘附等非特异性生物粘附，即可避免激活免疫排异系统。同时，也要求水凝胶材料同时具备粘弹性，粘弹性凝胶相较于纯弹性凝胶可以更好模拟体内组织的机械性能。
5.所以如何高效地制备一种具有粘弹性的海藻酸-壳聚糖生物惰性水凝胶是生物医用材料领域需要解决的重点问题。


技术实现要素：

6.本发明涉及一种具有粘弹性的海藻酸-壳聚糖生物惰性水凝胶，提供该水凝胶的制备方法以及力学特征和细胞粘附表征。本发明提供的海藻酸-壳聚糖生物惰性复合水凝胶可用于组织填充领域，对于组织缺损修复治疗具有重要的实用价值。
7.本发明目的是提供一种具有粘弹性的海藻酸-壳聚糖生物惰性水凝胶。基本原理是采用dmtmm作为交联剂，通过酰胺键交联海藻酸钠与壳聚糖，通过调节配方可以得到不同模量的凝胶。利用生物大分子自身的粘弹性，合理调节交联程度，便可实现粘弹性。并调节海藻酸钠中羧基与壳聚糖中氨基的比例为1：1，达到两性离子与电荷中性的效果，得到生物惰性的水凝胶，可用于组织填充。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.所述的海藻酸-壳聚糖生物惰性复合水凝胶由壳聚糖，海藻酸钠交联合成， 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)作为交联剂；
10.(1)在乙酸溶液中溶解海藻酸钠制得海藻酸钠溶液；
11.(2)在步骤(1)中制得的海藻酸钠溶液中加入壳聚糖制得海藻酸钠-壳聚糖复合物溶液，保证羧基氨基比例1：1；
12.(3)在步骤(2)中制得的海藻酸钠-壳聚糖复合物溶液中加入dmtmm，使海藻酸钠和
壳聚糖充分交联，在一定温度与一定反应时间条件下制得所述的海藻酸
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壳聚糖复合水凝胶。
13.优选的，步骤(1)所述的乙酸溶液质量浓度为5-100mg/ml。
14.优选的，步骤(1)所述的海藻酸钠溶液质量浓度为5-100mg/ml。
15.优选的，步骤(2)所述的壳聚糖氨基的量与海藻酸钠羧基的量之比为1:1。
16.优选的，步骤(2)所述的海藻酸钠-壳聚糖复合物溶液ph值为5-9。
17.优选的，步骤(3)所述的dmtmm物质的量与海藻酸钠物质的量之比为1-5:1。
18.优选的，步骤(3)所述的海藻酸钠-壳聚糖充分交联的方式为酰胺键交联。
19.优选的，所述的海藻酸-壳聚糖生物惰性复合水凝胶储能模量1-10000pa范围，损耗模量1-10000pa范围。
20.优选的，所述的海藻酸-壳聚糖生物惰性复合水凝胶具有生物惰性，抵抗细胞粘附。
21.本发明的优点在于采用dmtmm作为高效交联剂，相比于传统的edc/nhs体系活性更高，酰胺键交联方式相比于传统醛类、环氧类交联方式没有残留活性基团。由于生物大分子的粘弹性，合理调控交联程度，可得到具有粘弹性的水凝胶。该类水凝胶可以更好地模拟体内组织，具有生物惰性，可有效抑制系内细胞粘附与免疫反应，在组织填充领域具有良好的应用前景。
附图说明
22.图1是不同质量浓度与dmtmm用量制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶照片图；
23.图2是不同质量浓度与dmtmm用量制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶储能模量-应变关系图；
24.图3是不同质量浓度与dmtmm用量制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶损耗模量-应变关系图；
25.图4是不同质量浓度与dmtmm用量制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶储能模量-角频率关系图；
26.图5是不同质量浓度与dmtmm用量制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶损耗模量-角频率关系图；
27.图6是质量浓度为20mg/ml壳聚糖，1eqdmtmm制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶抗细胞粘附图片；
28.图7是质量浓度为20mg/ml壳聚糖，2eqdmtmm制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶抗细胞粘附图片；
29.图8是质量浓度为20mg/ml壳聚糖，3eqdmtmm制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶抗细胞粘附图片；
30.图9是质量浓度为30mg/ml壳聚糖，1eqdmtmm制得的海藻酸-壳聚糖水凝胶抗细胞粘附图片。
具体实施方式
31.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限
于此。
32.实施例1
33.取10mg壳聚糖(阿拉丁，脱乙酰度≥95％)加入到500μl质量百分比浓度为2％的乙酸溶液中，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min得到质量浓度为20mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入12.28mg海藻酸钠，保证羧基氨基比例1：1，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min，高频超声波清洗器超声15min得到海藻酸钠-壳聚糖复合溶液。然后按照海藻酸钠物质的量等当量加入17.12mgdmtmm，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min使dmtmm完全溶解，测得溶液ph值为5-6。
34.将海藻酸钠-壳聚糖复合溶液放入37℃孵育箱中恒温8h，得到海藻酸-壳聚糖复合水凝胶。
35.实施例2
36.取10mg壳聚糖(阿拉丁，脱乙酰度≥95％)加入到500μl质量百分比浓度为2％的乙酸溶液中，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min得到质量浓度为20mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入12.28mg海藻酸钠，保证羧基氨基比例1：1，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min，高频超声波清洗器超声15min得到海藻酸钠-壳聚糖复合溶液。然后按照海藻酸钠物质的量的2倍当量加入34.24mgdmtmm，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min使dmtmm完全溶解，测得溶液ph值为5-6。
37.将海藻酸钠-壳聚糖复合溶液放入37℃孵育箱中恒温8h，得到海藻酸-壳聚糖复合水凝胶。
38.实施例3
39.取10mg壳聚糖(阿拉丁，脱乙酰度≥95％)加入到500μl质量百分比浓度为2％的乙酸溶液中，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min得到质量浓度为20mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入12.28mg海藻酸钠，保证羧基氨基比例1：1，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min，高频超声波清洗器超声15min得到海藻酸钠-壳聚糖复合溶液。然后按照海藻酸钠物质的量的3倍当量加入51.36mgdmtmm，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min使dmtmm完全溶解，测得溶液ph值为5-6。
40.将海藻酸钠-壳聚糖复合溶液放入37℃孵育箱中恒温8h，得到海藻酸-壳聚糖复合水凝胶。
41.实施例4
42.取15mg壳聚糖(阿拉丁，脱乙酰度≥95％)加入到500μl质量百分比浓度为2％的乙酸溶液中，常温下用涡旋震荡器充分震荡10min得到质量浓度为30mg/ml 的壳聚糖溶液，然后加入18.42mg海藻酸钠，保证羧基氨基比例1：1，常温下用涡旋震荡器充分震荡10min，高频超声波清洗器超声20min得到海藻酸钠-壳聚糖复合溶液。然后按照海藻酸钠物质的量的等当量加入25.68mgdmtmm，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min使dmtmm完全溶解，测得溶液ph值为5-6。
43.将海藻酸钠-壳聚糖复合溶液放入37℃孵育箱中恒温8h，得到海藻酸-壳聚糖复合水凝胶。
44.对比实施例
45.取5mg壳聚糖(阿拉丁，脱乙酰度≥95％)加入到500μl质量百分比浓度为2％的乙
酸溶液中，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min得到质量浓度为10mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入6.14mg海藻酸钠，保证羧基氨基比例1：1，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min，高频超声波清洗器超声10min得到海藻酸钠-壳聚糖复合溶液。然后按照海藻酸钠物质的量等当量加入8.56mgdmtmm，常温下用涡旋震荡器充分震荡5min使dmtmm完全溶解，测得溶液ph值为5-6。
46.将海藻酸钠-壳聚糖复合溶液放入37℃孵育箱中恒温8h，无法得到海藻酸-壳聚糖复合水凝胶，反应产物为流动状态，无法进行力学性能测试。
47.测试例1
48.将上述实施例1-4以及对比实施例中所用反应容器倒置，结果如图1所示，可以看出，实施例1-4可以形成水凝胶，而对比实施例无法形成凝胶，呈流体状态。
49.测试例2
50.将上述实施例1-4中制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶放置于dhr流变仪，进行应变扫描，使应变从0.1％到800％，得到不同质量浓度与dmtmm用量下储能模量与应变的关系，结果如图2所示，可以看出，随着壳聚糖与海藻酸钠质量浓度的增加，水凝胶储能模量增加，弹性增加，而水凝胶储能模量与dmtmm用量关系不大，故可以通过调节壳聚糖与海藻酸钠质量浓度得到不同储能模量的海藻酸-壳聚糖复合凝胶。此测试例中，储能模量范围为1-1000pa。
51.测试例3
52.将上述实施例1-4中制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶放置于dhr流变仪，进行应变扫描，使应变从0.1％到800％，得到不同质量浓度与dmtmm用量下损耗模量与应变的关系，结果如图3所示，可以看出，随着壳聚糖与海藻酸钠质量浓度的增加，水凝胶损耗模量增加，粘性增加，而水凝胶损耗模量与dmtmm用量关系不大，故可以通过调节壳聚糖与海藻酸钠质量浓度得到不同损耗模量的海藻酸-壳聚糖复合凝胶。此测试例中，损耗模量范围为10-1000pa。
53.测试例4
54.将上述实施例1-4中制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶放置于dhr流变仪，进行频率扫描，使角频率从0.1rad/s到100rad/s，得到不同质量浓度与dmtmm 用量下储能模量与角频率的关系，结果如图4所示，可以看出，随着壳聚糖与海藻酸钠质量浓度的增加，水凝胶损耗模量增加，粘性增加，而水凝胶储能模量与 dmtmm用量关系不大，故可以通过调节壳聚糖与海藻酸钠质量浓度得到不同储能模量的海藻酸-壳聚糖复合凝胶，且储能模量随频率扫描一直上升，说明水凝胶存在一定粘性，同时具有弹性性质。材料具备粘弹性，比纯弹性材料更好地模拟体内组织的机械性能。此测试例中，储能模量范围为10-10000pa。
55.测试例5
56.将上述实施例1-4中制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶放置于dhr流变仪，进行频率扫描，使角频率从0.1rad/s到100rad/s，得到不同质量浓度与dmtmm 用量下损耗模量与应变的关系，结果如图5所示，可以看出，随着壳聚糖与海藻酸钠质量浓度的增加，水凝胶损耗模量增加，粘性增加，而水凝胶损耗模量与 dmtmm用量关系不大，故可以通过调节壳聚糖与海藻酸钠质量浓度得到不同损耗模量的海藻酸-壳聚糖复合凝胶，且损耗模量随频率扫描一直上升，说明水凝胶存在一定粘性，同时具有弹性性质。材料具备粘弹性，比纯弹性材
料更好地模拟体内组织的机械性能。此测试例中，损耗模量范围为10-10000pa。
57.测试例6
58.在实施例1制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶上面进行细胞培养，24h后采用免疫荧光显微镜观察细胞形态及粘附铺展情况。结果如图6所示，可以看出，细胞在水凝胶上未能粘附与铺展，说明所述的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶能够抵抗细胞粘附，具有生物惰性，也即不造成细胞粘附等非特异性生物粘附，即可避免激活免疫排异系统。
59.测试例7
60.在实施例2上制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶上面进行细胞培养，24h后采用免疫荧光显微镜观察细胞形态及粘附铺展情况。结果如图7所示，可以看出，细胞在水凝胶上未能粘附与铺展，说明所述的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶能够抵抗细胞粘附，具有生物惰性，也即不造成细胞粘附等非特异性生物粘附，即可避免激活免疫排异系统。
61.测试例8
62.在实施例3上制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶上面进行细胞培养，24h后采用免疫荧光显微镜观察细胞形态及粘附铺展情况。结果如图8所示，可以看出，细胞在水凝胶上未能粘附与铺展，说明所述的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶能够抵抗细胞粘附，具有生物惰性，也即不造成细胞粘附等非特异性生物粘附，即可避免激活免疫排异系统。
63.测试例9
64.在实施例4上制得的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶上面进行细胞培养，24h后采用免疫荧光显微镜观察细胞形态及粘附铺展情况。结果如图9所示，可以看出，细胞在水凝胶上未能粘附与铺展，说明所述的海藻酸-壳聚糖复合水凝胶能够抵抗细胞粘附，具有生物惰性，也即不造成细胞粘附等非特异性生物粘附，即可避免激活免疫排异系统。
65.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。