一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记InDel-K2及其应用

一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记indel-k2及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记indel-k2及其应用。


背景技术：

2.上世纪60年代以来，以半矮秆小麦和水稻新品种培育为标志的“绿色革命”带来了全球粮食产量大幅增长，解决了世界范围内人口快速增长所引发的粮食危机。利用植物自身内源赤霉素的合成和信号转导缺陷来获得的矮化植株，是培育抗倒伏农作物新品种的新思路。对粮食产量增长有巨大贡献的矮杆水稻品种就是因为植株中的ga20ox-2基因发生了缺失突变导致其营养器官缺少生长所必须的活性gas，从而使得植株矮化。用camv的35s启动子介导拟南芥的ga20-氧化酶基因atga20ox1在欧美杂种山杨中过表达后，和对照相比，转基因植株生长速率加快、生物量增加、木质纤维变长。利用crispr/cas9系统特异性地诱导了zmga20ox3基因的靶向突变，创制了玉米矮化材料。但矮秆增产的玉米新材料研究较少，属于玉米的矮秆增产“绿色革命”发展较为缓慢。
3.功能性分子标记是根据基因序列设计的分子标记，能够直接检测基因，区分和预测等位基因及相对性状。常规的杂交育种是通过对表现型进行长年多次重复的观察，以此得到纯合基因型的植株。但周期很长，一般要七八年甚至是十多年。在此基础上通过借助分子标记技术可以准确定位出质量性状，从而大大减少了回交次数，同时也缩短了常规育种所需要的年限。借助分子标记的方法，能够直接在基因水平上进行选择，效率很高。分子标记辅助育种在整个过程中都没有引入外源基因，这是和转基因育种存在本质区别的地方。这项技术也极大地发挥了种群内部遗传多样性的优势，是将种群内部优良性状进行整合的一个过程。利用功能性分子标记筛选半矮杆增产玉米，缩短育种时间，降低种植成本，具有重要意义。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记indel-k2及其应用。
6.本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
7.本发明的一种半矮秆增产的玉米基因型，该玉米基因型的核苷酸序列如seq id no.5所示。
8.本发明还提供一种用于对上述半矮秆增产的玉米基因型进行检测的功能性分子标记indel-k2。
9.作为优选的实施方式，该功能性分子标记indel-k2的序列如下所示：
10.正向引物：5
’‑
acgggttcttccaggtgtg-3’；
11.反向引物：5
’‑
gcgctttcgttcgttaccat-3’。
12.作为优选的实施方式，该功能性分子标记indel-k2位于玉米内源赤霉素代谢调控基因zmga20ox3上。
13.本发明还提供一种功能性分子标记indel-k2在半矮杆增产玉米的分子标记辅助选择育种中的应用。
14.本发明还提供一种功能性分子标记indel-k2在检测半矮秆增产的玉米基因型中的应用。
15.本发明还提供一种功能性分子标记indel-k2在区分正常高度玉米和半矮杆增产玉米中的应用。
16.作为优选的实施方式，所述正常高度玉米和半矮杆增产玉米存在特异性差异。
17.本发明的有益效果是：
18.本发明公开了一种半矮秆增产的玉米基因型(如seq id no.5所示)，且公开了筛选该玉米基因型的功能性分子标记indel-k2，其序列信息如下：
19.正向引物：5
’‑
acgggttcttccaggtgtg-3’；
20.反向引物：5
’‑
gcgctttcgttcgttaccat-3’。
21.本发明根据半矮秆增产的玉米基因型序列设计功能性分子标记indel-k2能够应用在半矮杆增产玉米的分子标记辅助选择育种中、检测半矮秆增产的玉米基因型中和区分正常高度玉米和半矮杆增产玉米中，有利于玉米品种的选育，筛选出株高降低且产量增加的玉米材料，可以免去杂交选育的工作，大大缩短优良品种选育的周期，提高育种效率并加快育种进程。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为实施例1中基因编辑载体p180310图谱。
24.图2为实施例5中利用功能性分子标记筛选矮秆玉米的pcr检测电泳图。
25.图3为实施例6中利用功能性分子标记indel-k2对代表性玉米自交系、杂交种的基因型检测结果。图中，m为marker 2000；1为k2矮秆玉米材料；2为ph6wc自交系；3为ph4cv自交系；4为郑58自交系；5为吉853自交系；6为kn5585自交系；7为类先玉335杂交种；8为郑单958杂交种。
具体实施方式
26.本发明的一种半矮秆增产的玉米基因型，该玉米基因型的核苷酸序列如seq id no.5所示。
27.本发明还提供一种用于对上述半矮秆增产的玉米基因型进行检测的功能性分子标记indel-k2。
28.优选的，该功能性分子标记indel-k2的序列如下所示：
29.正向引物：5
’‑
acgggttcttccaggtgtg-3’；
30.反向引物：5
’‑
gcgctttcgttcgttaccat-3’。
31.优选的，该功能性分子标记indel-k2位于玉米内源赤霉素代谢调控基因zmga20ox3上。
32.本发明还提供一种功能性分子标记indel-k2在半矮杆增产玉米的分子标记辅助选择育种中的应用。
33.本发明还提供一种功能性分子标记indel-k2在检测半矮秆增产的玉米基因型中的应用。
34.本发明还提供一种功能性分子标记indel-k2在区分正常高度玉米和半矮杆增产玉米中的应用。
35.优选的，所述正常高度玉米和半矮杆增产玉米存在特异性差异。
36.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
37.材料来源：
38.骨架载体pcxb053：由未米生物科技(江苏)有限公司构建。
39.载体psg-zmu6：由未米生物科技(江苏)有限公司构建。
40.实施例1基因编辑载体p180310构建
41.基因编辑载体为p180310，其载体图谱如图1所示。该载体的基础骨架载体为pcxb053。本发明通过bsai酶切，切去骨架载体pcxb053中的ccdb序列，将两个靶标序列分别通过t4连接酶连接到u6和两个sgrna分子骨架序列之间，获得酶切载体产物；对载体psg-zmu6进行pcr扩增后胶回收获得pcr酶切产物；连接酶切载体产物和pcr酶切产物，即得基因编辑载体p180310。
42.基因编辑载体p180310的具体构建流程如下：
43.(1)针对玉米内源基因zmga20ox3(zm00001d042611)(玉米自交系b73目的基因zmga20ox3核苷酸序列见seq id no.1或玉米自交系b73中的cdna序列见seq id no.3)进行基因编辑。crispr-p网站进行靶点设计(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)，选用靶标分数高、脱靶标率低、位置合适的靶标。
44.本发明中优选的两个靶标区域的dna序列分别如下所示：ccgctggctgagaagcagcgggc和ctgtccttcggcttccacgacgg，以此作为靶标序列。
45.本发明中的两个sgrna分子骨架序列通过人工合成得到，其序列信息分别如下所示：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc和gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc。
46.(2)通过bsai酶切，切去骨架载体pcxb053中的ccdb序列，将两个靶标序列(上海生工合成)分别通过t4连接酶连接到u6和两个sgrna分子骨架序列之间；用bsal酶37℃下酶切骨架载体pcxb0531小时左右；50μl酶切体系，其中，pcxb053为1ug(10ul)，bsal酶为1μl，bsal酶的buffer为5μl，h2o为34μl；使用dc301试剂盒(诺维赞pcr凝胶回收试剂盒)进行胶
回收得到酶切载体产物。
47.(3)用以上酶切载体产物作为模板进行pcr扩增。
48.上游引物：caatggtctcaattgcccgctgcttctcagccaggttttagagctagaaatag；
49.下游引物：ttggggtctctaaactcgtggaagccgaaggacacaattcggtgcttgcggct。
50.pcr扩增体系50ul，其中，上下游引物各1ul，psg模板为1μl，pfu酶(高保真酶)为20μl，h2o为27μl。各物质用超纯水溶解后混合均匀后，pcr仪运行以下系列反应：(a)95℃，3min；(b)95℃，30sec；(c)58℃，30sec；(d)72℃，1min；(e)是从(b)-(d)步循环30次；(f)72℃，5min；(g)4℃保存。使用dc301试剂盒(诺维赞pcr凝胶回收试剂盒)进行胶回收得到pcr产物。
51.pcr产物酶切处理：用bsal酶37℃下酶切pcr产物1小时左右；50μl酶切体系，其中，pcr产物为30ul，bsal酶为1μl，bsal酶的buffer为5μl，h2o为14μl；使用dc301试剂盒(诺维赞pcr凝胶回收试剂盒)进行胶回收得到pcr酶切产物。
52.(4)连接酶切载体产物和pcr酶切产物。
53.连接体系(冰上混合)：步骤(2)得到的酶切载体产物为1μl，步骤(3)得到的pcr酶切产物为6μl，t4连接酶为1μl，t4连接酶buffer为1μl，h2o为1μl。pcr仪运行ligase程序16℃1h后冰箱放置3h或者过夜。
54.(5)连接产物转化至大肠杆菌，即得基因编辑载体p180310。将大肠杆菌感受态dh5α从冰箱取出后，迅速放入冰上，5分钟后待菌块溶解加入(4)获得的连接产物，10μl连接产物 100μl大肠杆菌感受态dh5α，冰上静置25min，42℃热击45s，冰上放置2min，加入无抗生素的lb 100μl，37℃，200rpm，摇菌1h，涂板，lb kana置于37℃培养一天。
55.实施例2玉米遗传转化
56.含有p180310的农杆菌eha105在yep固体培养基上涂布，28℃暗培养1-3d；将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，od
550
调至0.3，制成侵染液备用。以新鲜剥离的1mm左右的玉米的幼胚为材料，将剥取的新鲜玉米自交系kn5585幼胚放入含有1.8ml无菌侵染培养基的塑料离心管中清洗2次；吸去上清液，余下玉米幼胚在塑料离心管中然后加入1.0ml农杆菌eha105侵染液，放置5min；将塑料离心管中的玉米幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌eha105侵染液，于23℃黑暗共培养3天；共培养后，将玉米幼胚转移到恢复培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/lbialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后再转到含8mg/l bialaphos筛选培养基上筛选培养2周；将抗性愈伤组织转移至分化培养基一中，25℃，5000lx，光照培养1周；再将抗性愈伤组织转移至分化培养基二中，光照培养2周；将分化生出的玉米小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将玉米小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代玉米种子。
57.实施例3不同基因型的创制
58.对获得的t0代玉米苗，进行基因编辑元件cas9和目的基因zmga20ox3(zm00001d042611)的pcr检测。
59.用于基因编辑元件cas9的pcr检测的上下游引物序列分别如下：
60.上游引物cas9-f：5'-agatgatcgccaagagcgag-3'；
61.下游引物cas9-r：5'-cgatccgtgtctcgtacagg-3'。
62.用于目的基因zmga20ox3的pcr检测的上下游引物序列分别如下：
63.上游引物zmga20ox3-f：5'-cgcacatctcatggtgtcctaa-3'；
64.下游引物zmga20ox3-r：5'-acagctccttcatctcctcgca-3'。
65.用cas9-f：5'-agatgatcgccaagagcgag-3'和cas9-r：5'-cgatccgtgtctcgtacagg-3'扩增基因编辑元件cas9；用zmga20ox3-f：5'-cgcacatctcatggtgtcctaa-3'和zmga20ox3-r：5'-acagctccttcatctcctcgca-3'扩增玉米内源基因zmga20ox3(zm00001d042611)。
66.pcr扩增体系如下：dna为3μl，上下游引物各1μl，2
×
taqmix为7.5μl，ddh2o为2.5μl，总体积10μl。pcr反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步-(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。pcr产物交由库美生物科技有限公司进行测序，得到玉米自交系kn5585目的基因zmga20ox3核苷酸序列见seq id no.2。筛选出含有基因编辑元件cas9且目的基因zmga20ox3被编辑的植株，将该植株与玉米自交系kn5585测交获得t1代玉米种子。
67.t1代玉米种子突变体材料种植后进行pcr检测及测序，筛选出不含有基因编辑元件cas9且目的基因zmga20ox3突变的植株，这些植株材料为不含转基因元件的突变体，这些突变体植株材料经过自交获得t2代纯合玉米材料，测序后，依次命名为k1、k2、k3、k4。材料k1的突变型基因序列即目的基因zmga20ox3-k1核苷酸序列见seq id no.4，材料k2的突变型基因序列即目的基因zmga20ox3-k2核苷酸序列见seq id no.5，材料k3的突变型基因序列即目的基因zmga20ox3-k3核苷酸序列见seq id no.6，材料k4的突变型基因序列即目的基因zmga20ox3-k4核苷酸序列见seq id no.7。
68.实施例4矮秆增产的基因型筛选
69.将t2代纯合玉米材料k1、k2、k3、k4和野生型wt分别种植在吉林省公主岭市吉林省农业科学院基地，进行两年的田间表型鉴定。在成熟期，对所有材料的株高、穗位高进行测量，收获时对穗长、穗粗等产量性状进行调查，并进行t-test检验，统计学分析。如表1所示，结果表明，k1、k2、k3、k4的株高、穗位高均极显著低于对照wt。与对照相比，降低20-27％。两年结果表现一致，t2代纯合玉米材料k1、k2、k3、k4均表现半矮杆表型。
70.表1田间玉米材料的株高、穗位高调查
[0071][0072][0073]
表中数据以平均值
±
标准差表示。“**”表示与对照相比有极显著差异(p《0.01)，
为极显著差异，“*”表示与对照相比有显著差异(0.01≤p《0.05)。
[0074]
收获后对材料的穗部数据进行调查，并进行t-test检验，统计学分析。结果发现，与wt相比，k1、k2、k3、k4的穗长减少，穗粗、穗轴增加。如表2所示，2020年田间试验结果表明，与对照产量相比，k1、k2亩产提高6.55％、7.48％，k3、k4亩产分别降低18.37％、0.52％；如表3所示，2021年田间试验结果表明，与对照产量相比，k1、k2亩产分别提高14.57％、12.89％，k3、k4亩产分别降低20.79％、6.26％。综合两年田间试验结果，t2代纯合玉米材料k2的亩产稳定，且其他农艺性状稳定。
[0075]
表2 2020年田间试验结果
[0076]
n 穗长(cm)穗粗(cm)百粒重(g)粒重(g)轴粗(cm)亩产(kg)13wt13.69
±
0.7840.93
±
2.7426.25
±
1.6959.08
±
4.5925.75
±
2.2532.5010k112.80
±
0.92*45.30
±
2.25**29.47
±
3.21**62.97
±
8.4129.69
±
1.55**34.6310k212.45
±
0.96**45.44
±
1.56**30.00
±
1.14**63.51
±
10.1328.69
±
1.12**34.9310k311.70
±
0.75**44.52
±
2.01**24.19
±
1.45**48.24
±
10.81**29.48
±
1.14**26.5310k412.44
±
0.71**45.27
±
1.59**27.94
±
2.5358.79
±
7.5929.49
±
1.24**32.33
[0077]
表3 2021年田间试验结果
[0078]
n 穗长(cm)穗粗(cm)百粒重(g)粒重(g)轴粗(cm)亩产(kg)20wt13.30
±
0.9540.64
±
1.4624.15
±
1.5257.54
±
5.6727.22
±
1.1731.6520k113.18
±
0.5545.59
±
1.15**26.41
±
1.63**65.92
±
6.16**31.55
±
1.33**36.2620k211.81
±
0.94**44.03
±
1.32**27.44
±
1.55**64.96
±
4.19**29.46
±
1.53**35.7320k311.26
±
0.54**39.92
±
1.4030.42
±
1.65**45.58
±
7.88**28.60
±
1.27**25.0720k412.35
±
0.90**42.84
±
2.29**26.04
±
1.47**53.94
±
9.0130.36
±
1.13**29.67
[0079]
实施例5利用功能性分子标记indel-k2对纯合玉米材料不同基因进行分析
[0080]
本实施例中，所说的功能性分子标记indel-k2位于玉米内源赤霉素代谢调控基因zmga20ox3上。
[0081]
该功能性分子标记indel-k2的序列如下所示：
[0082]
正向引物：5
’‑
acgggttcttccaggtgtg-3’；
[0083]
反向引物：5
’‑
gcgctttcgttcgttaccat-3’。
[0084]
利用功能性分子标记indel-k2对t2代纯合玉米材料k1、k2、k3、k4和野生型wt进行目的基因zmga20ox3的pcr检测，pcr扩增体系如下：dna为3μl，正向引物和反向引物各1μl，2
×
taqmix为7.5μl，ddh2o为2.5μl，总体积为10μl。pcr扩增反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步-(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并测序。结果如图2所示，经过pcr扩增，对照材料条带大小为729bp，k1、k2、k3、k4条带大小分别为728bp，574bp，613bp，614bp，与预期相符。该功能性分子标记indel-k2能有效区分获得的不同基因型。
[0085]
实施例6利用功能性分子标记indel-k2对纯合玉米材料、代表性玉米自交系、杂交种进行基因型检测
[0086]
本实施例中，所说的功能性分子标记indel-k2位于玉米内源赤霉素代谢调控基因zmga20ox3上。
[0087]
该功能性分子标记indel-k2的序列如下所示：
[0088]
正向引物：acgggttcttccaggtgtg；
[0089]
反向引物：gcgctttcgttcgttaccat。
[0090]
利用功能性分子标记indel-k2对东北春玉米代表性骨干自交系ph6wc、ph4cv、郑58、吉853、kn5585、类先玉335、郑单958等玉米材料进行pcr检测，方法同实施例5。结果如图3所示，经过pcr扩增，能有效区分k2、ph6wc自交系、ph4cv自交系、郑58自交系、吉853自交系、kn5585自交系、类先玉335杂交种、郑单958杂交种的条带大小，区别出不同的玉米材料。
[0091]
由上述试验结果可知，该功能性分子标记indel-k2能有效区分半矮杆增产玉米材料k2及其他的玉米自交系和杂交种。该功能性分子标记indel-k2的应用有利于快速筛选半矮杆增产玉米，降低田间选育成本。
[0092]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。