拟穴青蟹生物标记物CYP2基因及其在制备病理检测试剂中的应用的制作方法

拟穴青蟹生物标记物cyp2基因及其在制备病理检测试剂中的应用
技术领域：
1.本发明属于病害防治领域，具体涉及拟穴青蟹生物标记物cyp2基因及其在制备病理检测试剂中的应用。


背景技术：

2.拟穴青蟹俗称青蟹，具有肉质鲜美营、养价值高等特点，深受消费者喜爱。拟穴青蟹主要分布在我国东南沿海以及东南亚一些国家。拟穴青蟹是我国重要的养殖海水蟹类之一，养殖产量超过16.8万吨。我国拟穴青蟹养殖模式主要以池塘养殖为主，养殖模式相对粗放。近年来，由于青蟹细菌性疾病和水环境中重金属胁迫等因素，导致青蟹病害爆发严重，青蟹亩产量不高，严重阻碍了青蟹产业健康发展。因此，急需发展青蟹病害监测技术，及时防控病害爆发与传播，为提高青蟹产量提高有效手段。


技术实现要素：

3.本发明的第一个目的是提供一种独特的生物标志物，在评价水产动物健康状态具有重要的应用价值的拟穴青蟹生物标记物cyp2基因及其编码蛋白-cyp2蛋白。
4.所述的cyp2蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
5.编码上述cyp2蛋白的拟穴青蟹生物标记物cyp2基因。
6.优选，所述的拟穴青蟹生物标记物cyp2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明的第二个目的是提供上述拟穴青蟹生物标记物cyp2基因作为生物标志物在制备评价水产动物健康状态的病理检测试剂中的应用。
8.优选，是检测拟穴青蟹生物标记物cyp2基因表达量的试剂在制备评价水产动物健康状态的病理检测试剂中的应用。
9.优选，所述的检测拟穴青蟹生物标记物cyp2基因表达量的试剂是定量pcr试剂。
10.进一步优选，所述的定量pcr试剂，其定量引物是：
11.spcyp2-f:5
’‑
tggtggcaagcagacagttcg-3’,
12.spcyp2-r:5
’‑
gccttgtgcttctcggtctcat-3’。
13.本发明的第三个目的是提供一种评价水产动物健康状态的病理检测试剂，含有检测拟穴青蟹生物标记物cyp2基因表达量的试剂。
14.本发明从拟穴青蟹中克隆到拟穴青蟹生物标记物cyp2基因，该基因在肝胰腺、鳃、肠、血细胞、心脏、肌肉和胃组织中都有表达，其中在心脏中表达量最高，其次是在肝胰腺中，而在肠道中表达量最低，病原菌副溶血弧菌刺激拟穴青蟹后，spcyp2基因表达量显著上调，在重金属镉胁迫下，spcyp2基因表达量显著上调。cyp2基因在毒理学应用上可作为独特的生物标志物，在评价水产动物健康状态具有重要的应用价值。
附图说明：
15.图1是spcyp2基因的cdna序列和氨基酸序列；
16.图2是spcyp2基因在不同组织中表达情况，不同字母表示不同组织间差异显著；
17.图3是在副溶血弧菌刺激下spcyp2基因表达变化情况，星号(*)表示对照组和副溶血弧菌显著性差异；
18.图4是在重金属镉刺激下spcyp2基因表达变化情况，不同字母表示不同组之间差异显著。
具体实施方式：
19.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
20.实施例1：
21.1.材料方法
22.1.1 rna提取和cdna合成
23.采样trizol从拟穴青蟹肝胰腺中提取总rna。
24.(1)取0.1mg肝胰腺组织进行研磨，加1ml trizol，冰上静置10min；
25.(2)12,000rpm离心5min，取上清液，加200ul氯仿，剧烈震荡，冰上静置5min；
26.(3)12,000rpm离心5min，吸取上层水相，加入等体积的异丙醇，冰上静置5-10min；
27.(4)12,000rpm离心5min，弃上清，加入1ml 75％酒精，冰上静置5-10min；
28.(5)8,000g离心5min，弃上清，室温晾干；
29.(6)加入50ul depc水进行溶解。
30.利用分光光度计测量提取rna，采样琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。将检测合格的rna利用takara公司的逆转录试剂盒反转录成cdna。
31.1.2cyp2基因全长合成
32.利用本实验室先前构建的拟穴青蟹转录组文库，通过序列比对、分析并确定拟穴青蟹cyp2(spcyp2)部分基因序列，通过该序列，使用primer5.0软件，分别设计spcyp2的5’和3’端引物，使用smart
tm
race cdnaamplification kit(takara，中国大连)试剂盒，进行该基因5’和3’端pcr扩增，具体操作方法参考说明书。pcr扩增产物进行测序，分别得到5’和3’端，然后进行拼接、比对得到spcyp2基因全长cdna，其核苷酸序列如下所示：atgctggtggagctgcttctgttcgttgtgctggtgttcctgttgtggaagaccttcaggaaaccccccggactgcctccaggcaagtgggggcttcctctagtgggctacataccctggaccagtaagagctttgaggagcaggtgatggacctccacgagcagtatggagacatcttcctgtggaggatggggactcagttaatggtttttataaaggactacaaactgatgaaagaagctttctccagatccgagtttactcacagaccaaactgggaggtcctgaagtttatagaggaagttccacatggaatcgtttcaagtagtggcattatatggcacaacaaccggagatttacgctgaggcagctgcgtgaccttggcatgggcaagtcctccctggtgggggcggtgcaggaccaaggcctcaagctgcgggagactctcgcagagagggctggaacacccggaatgattccccatcagcttcacctgtctttgatcaacgtgatctggcacatggtggcaagcagacagttcgatgcagaagacgaaagattacatgagtttgtaaaacttttgtcagaatttgttttactttcaaatcgactggccatcaaggacttcatgccatggatgcaaaatgtcatgccggatttcctctttaaacgcctcataaagtatcatgaactgatagacttgaaggaaaaatttatgcgatactttaaggatgagaccgagaagcacaaggccactttggatccagacaacccgcgggacctcattgataactacctgctggagatggaggccaagaaagatgatccggagacaacctgcagcga
ggaggatttgttgtttataatgtttgagttgttcagtgcggggagtgagacctctgcctacactttcatgtggctgtgttgctacctggccgcacacccggaggttcagcacaagttgcatgctgaagttgacgaagtgcttcccaatggagctctgcccactttggcggagaagcccaggatgccgtacacagaggcagtgatcaacgaggcgatgagggcttgtgcactggtaaacttcggagtacagcacatggccgccagtgacacgcagctcgggggctacaccattcccaagggagcggtcgtgagctccaccgtcacgtccatgcactatgacagtctatactgggatcgacccaaggagttcaggccggagcgctggctggatgagaacggcaaattcttcatggccaaggaggggttcctgcccttcggtgtgggaaaaagagtgtgtgtcggggaaagtcttgcccggatggagctgttcatcttcaccaccatggtcttccaaagcttctccatcgctcctgcgcctggcaagtccgtcaacttgacacctgatttgaggggtttctttttccggaagccagtgcccaatgagttcgtcttcaccgtcaggaaacagtaa，具体如seq id no.1所示。
33.1.3荧光定量pcr
34.跟据拟穴青蟹spcyp2基因全长cdna序列，使用primer5.0软件，设计荧光定量引物，其引物序列为：spcyp2-f:5
’‑
tggtggcaagcagacagttcg-3’,spcyp2-r:5
’‑
gccttgtgcttctcggtctcat-3’。
35.把拟穴青蟹18s rrna当做内参基因，根据其核苷酸序列，同样使用primer5.0软件，设计荧光定量引物，其引物序列为：sp18s-f:5
’‑
ttttctgaacccgaggtaatgac-3’和sp18s-r:5
’‑
atgctttcgcagtagttcgtctt-3’。利用上述反转录的cdna模板，使用takara tbpremix ex taq
tm
荧光定量试剂盒，反应体系为：
[0036][0037]
在德国耶拿荧光定量pcr仪器中进行荧光定量pcr，循环条件如下：95℃30s，1个循环；接下来运行40个循环：95℃5s，59℃20s；进行溶解曲线分析。相对荧光定量使用2
－δδct
方法对结果进行分析和统计，实验组和对照组均设置6个平行反应。
[0038]
1.4实时荧光定量pcr检测spcyp2基因在不同组织中的分布及病原菌和重金属镉胁迫刺激spcyp2基因的表达
[0039]
分别选取6只拟穴青蟹，分离肝胰腺、鳃、肠、血细胞、心脏、肌肉和胃组织，并提取各个组织总rna和进行反转录为cdna(见步骤1.1)，荧光定量分析spcyp2基因表达情况。
[0040]
选取拟穴青蟹，每个分别注射1
×
106个病原菌副溶血弧菌，以注射pbs为对照组，在感染12、24、48和72h后取肝胰腺组织。对各个肝胰腺组织进行总rna提取并反转录为cdna(见步骤1.1)，依此为模版，进行荧光定量pcr，分析spcyp2基因变化情况。
[0041]
选取拟穴青蟹分为四组，对照组加0mg/l重金属镉，实验组分别加0.01mg/l重金属镉，0.05mg/l重金属和0.125mg/l重金属。在胁迫21天后，取肝胰腺组织。对各个肝胰腺组织
进行总rna提取并反转录为cdna(见步骤1.1)，依此为模版，进行荧光定量pcr，分析spcyp2基因在重金属镉胁迫下变化情况。
[0042]
2实验结果
[0043]
2.1拟穴青蟹spcyp2基因生物信息学分析
[0044]
spcyp2基因全长为2259bp，其中5’非编码区长度为104bp，3’非编码区长度为676bp。开放阅读框长度为1479bp，其核苷酸序列如seq id no.1所示，编码492个氨基酸(图1)，其氨基酸序列如seq id no.2所示。spcyp2基因全长序列中含有一个多聚腺苷酸尾巴。spcyp2蛋白分子量为56.98kda，等电点为6.23。氨基酸比对发现spcyp2具有细胞色素p450酶亚铁血红素蛋白结合位点。
[0045]
2.2拟穴青蟹spcyp2组织表达分析
[0046]
拟穴青蟹spcyp2在肝胰腺、鳃、肠、血细胞、心脏、肌肉和胃组织中都有表达，其中在心脏中表达量最高，其次是在肝胰腺中，而在肠道中表达量最低(图2)。
[0047]
2.3 spcyp2在病原菌副溶血弧菌刺激下基因变化情况
[0048]
病原菌副溶血弧菌刺激拟穴青蟹后，spcyp2基因表达量显著上调(图3)。
[0049]
2.4 spcyp2在重金属镉胁迫基因变化情况
[0050]
与对照组相比，在重金属镉胁迫下，spcyp2基因表达量显著上调(图4)。