用于耐药基因检测的蓝藻环境样品胞内外DNA分离提取方法与流程

用于耐药基因检测的蓝藻环境样品胞内外dna分离提取方法
技术领域
1.本发明涉及一种dna分离提取方法，尤其涉及一种用于耐药基因检测的蓝藻环境样品胞外和胞内dna分离提取方法。


背景技术：

2.随着医疗和养殖业中抗生素的长期滥用，大量未被生物体充分吸收和代谢的抗生素随城市尾水、养殖废水等途径直接或间接进入河湖水生态系统。抗生素的持续环境残留对环境微生物群落施加进化选择压力，催生了具有多重耐药基因的抗性细菌。河湖水环境已成为抗生素耐药基因(args)及其分子传播元件的重要基因库，并促进了args的传播扩散。全球每年约70万人死于耐药性病原菌感染，抗生素耐药性已成为全球性的环境健康热点问题。
3.蓝藻是水生食物链的主要初级生产者，是河湖水生态系统物质循环和能量流通的基础，其群落结构分布和初级生产量直接影响水生态系统的结构稳定性和功能完整性，是水生态系统平衡和水环境演变的重要指示物种。蓝藻又名蓝细菌，其细胞结构特点和遗传学特性与革兰氏阴性细菌相似，具有自然转化和有效重组系统，是水生态系统中抗生素耐药基因的重要载体，其抗生素耐药性通常可作为评价河湖水体抗生素及耐药基因污染水平的重要依据。蓝藻细胞内args的含量是细胞外相应args含量的2～3倍，但是胞外args在环境中存在时间更长，对args的传播扩散起到更显著的促进作用。
4.国内外已有相关研究大多采用实验室培养条件下获取的未被污染的纯化蓝藻单一菌种样品进行dna提取和抗生素耐药基因检测，或从环境样品中分离蓝藻单一菌种后进行纯化和转代培养再进行dna提取和抗生素耐药基因检测，通常存在分离转代过程中耐药基因表达量发生变化导致检测结果误差过高、无法真实反映目标水环境抗生素耐药性的问题。因此，为了更准确地测定蓝藻耐药性水平，最好的方法是采用从水环境中采集的蓝藻样品直接进行胞外和胞内dna提取和耐药基因检测。但是，该方法存在蓝藻细胞不易分离纯化、杂菌dna干扰提取效果导致耐药基因表达量被高估的技术瓶颈，而按照传统方法采用抗生素进行样品杂菌去除会诱导蓝藻样品的耐药性发生响应变化，进一步影响胞外和胞内dna提取和耐药基因检测的准确性。
5.在全球气候变暖的背景下，湖泊富营养化程度日益加剧导致全球范围内蓝藻水华暴发的频次、规模和范围逐步增加，而抗生素的广泛使用促进了抗生素耐药基因在河湖水环境介质尤其是在蓝藻中的增殖扩散。目前可用于直接检测蓝藻环境样品抗生素耐药基因表达量的胞外和胞内dna提取方法缺失，影响了蓝藻耐药性水平监测结果的准确性，现有技术对管理部门开展河湖水体抗生素耐药性评价的指导作用有限。因此，建立蓝藻环境样品抗生素耐药基因的胞外和胞内dna精准提取方法，将有助于掌握蓝藻宿主中抗生素耐药基因的归趋特征、产生过程和传播机制，为全面准确评价河湖水生态系统抗生素耐药性提供技术支持，对于深化抗生素耐药基因水环境行为机理与生态风险控制对策研究具有重要的科学价值。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明旨在提供一种提取的dna纯度高、完整性好的用于抗生素耐药基因检测的蓝藻环境样品中胞外和胞内dna分离提取方法。
7.技术方案：本发明用于耐药基因检测的蓝藻环境样品中胞外和胞内dna分离提取方法，包括以下步骤：
8.(1)待测蓝藻环境样品浓缩和清洗，得到藻液；
9.(2)确认藻液中杂菌对溶菌酶具有敏感性；
10.(3)藻液中加入溶菌酶溶液去除其中的杂菌，然后去除剩余溶菌酶溶液，得到预处理后的藻液；
11.(4)预处理后藻液转代培养，检测转代培养后的藻液中是否仍存在杂菌；若是，则重复步骤(3)，直至转代培养后的藻液中无杂菌；若否，则继续下一步；
12.(5)分离提取预处理后藻液的胞外和胞内dna。
13.进一步地，步骤(2)中，杂菌对溶菌酶敏感性的检测方法为将藻液中的杂菌菌株分离纯化后置于lb无菌液态培养基，抽取菌液均匀涂抹在含无菌溶菌酶的lb平板培养基上，风干后形成菌膜，培养至抗菌圈稳定清晰，抗菌圈直径不少于5mm即可确认蓝藻环境样品中杂菌的溶菌酶敏感性。
14.进一步地，步骤(3)中，溶菌酶溶液包括0.005％～0.01％的非离子型表面活性剂、0.1m的乙二胺四乙酸、0.3～0.5mg/ml的溶菌酶、0.25％～0.3％的十二烷基硫酸纳溶液、50mm的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液和200mm的氯化钠。
15.进一步地，步骤(3)中，去除残余溶菌酶溶液的方法为：藻液离心分离后加入去离子水离心并去除上清液，反复清洗若干次。
16.进一步地，步骤(4)中，将预处理后藻液分别置于bg11、lb、martins、martins和gause 1的无菌液态培养基和平板培养基中进行转代培养若干次。
17.进一步地，步骤(4)中，杂菌的检测方法为采用荧光显微镜镜检法和pcr-dgge扩增检测法。
18.进一步地，荧光显微镜镜检法包括将dapi细胞染料加入藻液中，然后荧光显微镜对藻液进行镜检，镜检图像中未出现绿色或蓝色荧光小型颗粒或斑点，确认无残留杂菌。
19.进一步地，pcr-dgge扩增检测法包括提取澡液中dna，选用适合细菌的v3区特异性引物，采用16s rdna-pcr-dgge法检测目标菌落是否存在。
20.进一步地，步骤(5)中，分离胞外dna使用的试剂包括磷酸二氢钠缓冲液和聚乙烯聚吡咯烷酮。
21.进一步地，利用柱式细菌总dna抽提试剂盒提取胞外和胞内dna。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：规避了传统dna提取方法中环境样品杂菌污染对后续抗生素耐药基因表达量检测结果的影响，突破了传统方法采用抗生素去除杂菌可能导致的抗生素胁迫压力诱导蓝藻环境样品耐药性发生响应变化的技术瓶颈，在确认杂菌的溶菌酶敏感性的基础上，采用溶菌酶-十二烷基硫酸纳优化组合溶液代替抗生素，对蓝藻环境样品进行预处理实现杂菌去除，同时避免造成蓝藻环境样品中的抗生素耐药基因表达量发生变化；在确认杂菌去除效果的基础上，通过化学溶解和物理抽滤相结合的方法分离提取蓝藻胞外和胞内dna，用于提升蓝藻环境样品抗生素耐药基因分
子生物学检测的准确性；本方法操作简单、节省时间，提取的蓝藻环境样品dna纯度高、完整性好，有效提升了后续蓝藻环境样品抗生素耐药基因分子生物学检测的准确性，具有广泛的应用前景。
附图说明
23.图1为浓缩清洗后待处理的蓝藻环境样品悬浊液的镜检示意图；
24.图2为用于抗生素耐药基因检测的蓝藻环境样品胞外和胞内dna分离提取方法流程图；
25.图3为预处理后抽检的蓝藻环境样品荧光显微镜镜检图；
26.图4为预处理后抽检的蓝藻环境样品16s rdna的pcr-dgge凝胶电泳图。
具体实施方式
27.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
28.实施例1
29.如图1所示，一种用于抗生素耐药基因检测的蓝藻环境样品胞外和胞内dna分离提取方法，包括如下步骤：
30.(1)藻液浓缩清洗
31.将蓝藻环境样品通过静置离心(4000rpm，4℃，5分钟)，浓缩为细胞密度约3.5
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108个/升的蓝藻细胞悬浮液，取30ml藻液置于50ml离心管中混匀，通过加入去离子水离心(4000rpm，4℃，5分钟)并去除上清液，反复清洗3次，形成蓝藻样品的悬浊液(如图2所示)。
32.(2)杂菌的溶菌酶敏感性检测
33.将藻液中的杂菌菌株分离纯化后置于lb无菌液态培养基(1％胰化蛋白胨、0.5％氯化钠、0.5％酵母提取物)单独培养，在恒温摇床中培养24小时(150rpm，30℃)，取0.1ml菌液均匀涂抹在含无菌溶菌酶(0.5mg/ml)的lb平板培养基上，风干后形成菌膜，lb平板培养基在30℃环境下培养至抗菌圈稳定清晰，抗菌圈直径范围为6.7～9.8mm，可确认该蓝藻环境样品中杂菌的溶菌酶敏感性，本方法适用，继续进入步骤(3)样品预处理。
34.(3)样品预处理
35.藻液中加入溶菌酶溶液，溶菌酶溶液包括0.005％的非离子型表面活性剂(tween-80)、0.1m的乙二胺四乙酸(edta)、溶菌酶(0.5mg/ml，20℃，10分钟)、十二烷基硫酸纳溶液(0.25％，20℃，10分钟)、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水溶液(50mm三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，200mm氯化钠，ph 7.4，4℃，10分钟)，并按照上述顺序依次加入到澡液中，用于去除环境样品中的杂菌。该组合溶液的浓度配比经过了优化，确保环境样品中杂菌的去除率超过99.99％，同时蓝藻细胞保持完整。蓝藻细胞离心分离后加入去离子水离心(4000rpm，4℃，5分钟)并去除上清液，反复清洗3次，用于去除溶菌酶和十二烷基硫酸纳。
36.上述步骤中的藻液中加入的溶菌酶溶液采用如下的配方：.01％的非离子型表面活性剂、0.1m的乙二胺四乙酸、0.3mg/ml的溶菌酶、0.3％的十二烷基硫酸纳溶液、50mm的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液和200mm的氯化钠。上述配方的溶菌酶溶液也可以达到去除环境样品中杂菌的效果。
37.(4)预处理样品抽样转代培养并确认是否存在杂菌
38.(401)转代培养
39.抽取10ml预处理后的蓝藻环境样品进行转代培养，用于确认预处理后的环境样品已不含杂菌。将抽取的预处理样品分别置于bg11(硝酸钠1.5g/l、磷酸氢二钾0.04g/l、七水硫酸镁0.075g/l、七水氯化钙0.036g/l、碳酸钠0.02g/l、柠檬酸0.006g/l、柠檬酸铁0.006g/l、微量元素溶液a5 1ml/l)、lb(1％胰化蛋白胨、0.5％氯化钠、0.5％酵母提取物)、martins(葡萄糖10g/l、氯化钠0.2g/l、硫酸钾0.2g/l、三水硫酸氢钾0.2g/l、碳酸钙5g/l、链霉素30mg/l，ph 7.2～7.4)、gause 1(淀粉20g/l、氯化钠0.5g/l、硝酸钾1g/l、三水磷酸氢钾0.5g/l、七水硫酸镁0.5g/l、七水硫酸亚铁0.01g/l，ph 7.4～7.6)的无菌液态培养基和平板培养基中进行转代培养3次，每次30℃条件下连续培养7天。其中，martins和gause 1培养基分别用于排除预处理后的蓝藻环境样品中的真菌和放线菌，bg11和lb培养基用于培养其它菌种。另取一份10ml预处理后的藻液过滤，将蓝藻细胞冻干研磨后置于上述培养基在同等条件下培养，用于排除附着在蓝藻细胞表面的杂菌。未经预处理的蓝藻环境样品作为空白对照。将转代培养后的样品继续进入步骤(402)荧光显微镜镜检和步骤(403)pcr-dgge分析。
40.(402)荧光显微镜镜检确认无杂菌污染
41.取1ml预处理后的蓝藻环境样品，加入dapi细胞染料(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)调至最终浓度5μg/l，黑暗中静置15分钟(4℃)后用黑色聚碳酸酯膜(0.2μm孔径)过滤，在荧光显微镜1000倍放大下进行镜检。未经预处理的蓝藻环境样品作为空白对照。与空白对照样品进行对比，图像中未出现绿色或蓝色荧光小型颗粒或斑点，确认预处理后的蓝藻环境样品无残留杂菌，如图3所示。
42.(403)pcr-dgge确认无杂菌污染
43.利用柱式细菌总dna抽提试剂盒对预处理后的蓝藻环境样品进行dna提取，选用适合细菌的v3区特异性引物，采用16s rdna-pcr-dgge法分析目标菌落是否存在。pcr采用50μl反应体系：模板50ng/2μl，引物各0.8μm，dntps各0.2μm，10
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pcr buffer 5μl(含1.5mm氯化镁)，ex taq聚合酶(5u/μl)0.4μl，补足无菌超纯水至50μl。pcr扩增条件：94℃8分钟，60℃1分钟，94℃1分钟35个循环，55℃45秒，72℃2分钟，72℃30分钟。两对引物gc-341f/907r与gc-21f/915r的反应体系及pcr扩增条件均相同。pcr产物采用变性梯度凝胶电泳系统进行分析，凝胶成像结果进行dgge图谱分析，所得测序结果与ncbi数据库的blast程序进行分析及相似性比较，并下载同源性最高的核酸序列进行比对，并构建系统发育树进行分析。预处理样品pcr产物的dgge条带测序结果中未出现杂菌，且胞外和胞内模板dna在空白对照组dna模板10倍和100倍浓度条件下扩增仍未出现杂菌条带，可确认预处理后的蓝藻环境样品无残留杂菌，如图4所示。
44.(5)胞外和胞内dna分离提取
45.步骤(3)经预处理后冻干的蓝藻环境样品取100mg，置于磷酸二氢钠缓冲液(0.12m，ph 8.0)和聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)，震荡(250rpm，25℃，10min)和离心(10000rpm，4℃，10min)清洗用于分离溶解胞外dna，收集上清液后将藻细胞重复上述胞外dna提取步骤共3次，将收集得到的上清液合并后，通过醋酸纤维膜(0.2μm孔径)过滤，滤液用于胞外dna提取，滤膜和滤膜上得到的藻细胞用于胞内dna提取，利用柱式细菌总dna抽提试剂盒分别进行dna提取。提取得到的dna纯度高、完整性好，经紫外分光光度计测定，dna提
取浓度为262.7ng/μl，a260/a280比例为1.97。