一种油莎豆粕抗氧化肽及其制备方法与流程

1.本发明属于抗氧化肽技术领域，具体涉及一种油莎豆粕抗氧化肽及其制备方法。


背景技术：

2.油莎豆中含有丰富的营养物质，其中粗脂肪20％～30％、粗蛋白质5％～15％、淀粉20％～25％、可溶性糖15％～25％。油莎豆油中油酸，亚油酸和亚麻酸含量较高，分别占脂肪酸成分的75％～77％，9.7％～9.9％和0.15％～0.45％，主要脂肪酸组成和橄榄油、茶籽油相似，是一种天然优质食用油，因此油莎豆主要用于榨油。油莎豆榨油后的油莎豆粕含有蛋白质、淀粉等营养成分，进一步开发油莎豆粕用于制备抗氧化肽、改性淀粉等，可以提高油莎豆的附加值，促进油莎豆产业快速发展。
3.抗氧化活性肽指能够消除体内活性氧自由基、抑制脂质过氧化的生物肽。目前，制备生物活性肽主要有微生物发酵、化学合成、酶促水解3种手段。微生物发酵指利用微生物对蛋白质进行降解形成多肽链，该法成本低，口感较好，但发酵过程产物不可控制，活性肽与杂质分离难度大。化学合成方法是根据已知的多肽氨基酸序列合成高纯度的活性肽段，由于成本高，常在进行肽段功能验证或细胞实验时使用化学固相合成方法，且上述化学合成方法一般常用于科研，不用于生产应用。酶促水解是目前国内外获取生物活性肽最常用的方法。蛋白酶酶切位点明确，且酶解过程可控，酶解条件相对温和，是学者们较青睐的一种方法。
4.油莎豆的蛋白质含量约5％～15％，通常对油莎豆的处理过程是先榨油，榨油后的豆粕用于提取蛋白质，然后采用碱性蛋白酶制备抗氧化肽，这样制备油莎豆粕抗氧化肽的方法，得到的油莎豆粕抗氧化肽含量少，抗氧化活性也不是很高，同时，由于油莎豆中所含有的蛋白质含量较低，且现有技术中油莎豆粕蛋白质的提取率较低，进而造成采用现有技术制备得到的油莎豆粕抗氧化肽的抗氧化性较低，成本较高。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种油莎豆粕抗氧化肽及其制备方法，采用本发明提供的方法制备得到的油莎豆粕抗氧化肽不仅抗氧化活性高且成本较低。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种油莎豆粕抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：以碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶对油莎豆粕蛋白溶液酶解，得到油莎豆粕抗氧化肽；
8.所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶的质量为油莎豆粕蛋白质量的5％～6％。
9.优选的，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为(0.8～1.2):1。
10.优选的，所述油莎豆粕蛋白溶液的质量浓度为4.5％～4.9％。
11.优选的，所述酶解温度为63℃～65℃；所述酶解时间为2.5h～3.0h；所述酶解ph为6.5～6.9。
12.本发明还提供了上述制备方法制备得到的油莎豆粕抗氧化肽，所述油莎豆粕抗氧
化肽的dpph自由基清除率在86.5％以上。
13.本发明还提供了制备上述油莎豆粕抗氧化肽所使用的油莎豆粕蛋白的制备方法，包括以下步骤：以油莎豆粕干粉质量为基准，以0.09％～0.11％的纤维素酶对油莎豆粕溶液酶解后，依次经过碱提和酸沉后，得到油莎豆粕蛋白；
14.所述油莎豆粕溶液中油莎豆粕干粉与蒸馏水的质量体积比为1g:(21～23)ml。
15.优选的，所述酶解温度为41℃～43℃；所述酶解时间为1.0～1.2h；所述酶解ph为4.2～4.6。
16.优选的，所述碱提的ph为8.9～9.0；所述碱提的时间为1.0～1.2h。
17.优选的，所述酸沉的ph为4.2～4.4；所述酸沉的时间为1.5～1.8h。
18.优选的，所述油莎豆粕蛋白质的提取率为69.2％～71.9％。
19.有益效果：
20.本发明提供了一种油莎豆粕抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：以碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶对油莎豆粕蛋白溶液酶解，得到油莎豆粕抗氧化肽；所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶的质量为油莎豆粕蛋白质量的5％～6％。
21.本发明提供的制备方法采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶的双酶法提取油莎豆粕抗氧化肽，较常规制备方法显著提高了油莎豆粕抗氧化肽的活性，油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率在86.5％以上。
22.同时，本发明提供的油莎豆粕蛋白质的制备方法提高了油莎豆粕蛋白质的提取率，降低了制备油莎豆粕抗氧化肽的成本，为油莎豆粕抗氧化肽的制备提供良好的蛋白质来源。
23.本发明中的制备方法工序简单，降低了油莎豆粕蛋白质的损失，节约了制备油莎豆粕抗氧化肽的时间。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
25.图1为实施例1～3及对比例1～2中油莎豆粕蛋白质的提取率；
26.图2为实施例4及对比例3～5中油莎豆粕蛋白质的提取率；
27.图3为实施例5～6及对比例6～7中油莎豆粕蛋白质的提取率；
28.图4为实施例7～8及对比例8～9中油莎豆粕蛋白质的提取率；
29.图5为实施例9～10及对比例10～11中油莎豆粕蛋白质的提取率；
30.图6为实施例11～12及对比例12～14中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率；
31.图7为实施例13～14及对比例15～16中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率；
32.图8为实施例15～16及对比例17～18中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率；
33.图9为实施例17及对比例19～21中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率；
34.图10为实施例18～19及对比例22～23中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率。
具体实施方式
35.本发明提供了一种油莎豆粕抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：以碱性蛋白酶
和木瓜蛋白酶混合酶对油莎豆粕蛋白溶液酶解，得到油莎豆粕抗氧化肽；所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶的质量为油莎豆粕蛋白质量的5％～6％。
36.本发明以碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶对油莎豆粕蛋白溶液酶解，得到油莎豆粕抗氧化肽。在本发明中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的含量为油莎豆粕蛋白质质量的5％～6％，优选为5％～5.5％，进一步优选为5％；所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比优选为0.8～1.2:1，更优选为1:1；所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力均优选为1
×
105u/g。在本发明的实施例中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶均来源于河南馨玉食品有限公司，所述碱性蛋白酶的生产批号为mep200809，木瓜蛋白酶的生产批号为mep200511。
37.在本发明中，所述油莎豆粕蛋白溶液的质量浓度优选为4.5％～4.9％，进一步优选为4.6％～4.8％，更优选为4.7％。在本发明中，所述油莎豆粕蛋白溶液优选以水为溶剂溶解油莎豆粕蛋白粉末制备而成；所述水优选包括蒸馏水。
38.本发明优选采用naoh溶液和hcl溶液调节所述油莎豆粕蛋白溶液ph后，再加入所述混合酶。在本发明中，所述hcl溶液的物质的量浓度优选为0.5mol
·
l-1
；所述naoh溶液的物质的量浓度优选为0.5mol
·
l-1
。在本发明中，所述酶解ph优选为6.5～6.9，更优选为6.7。本发明优选在恒温水浴中进行所述酶解；所述酶解温度优选为63℃～65℃，更优选为64℃；所述酶解时间优选为2.5～3.0h，更优选为2.5h。
39.本发明还提供了上述制备方法制备得到的抗氧化肽，所述抗氧化肽的dpph自由基清除率在86.5％以上，优选为86.5％～89.2％。
40.本发明还提供了制备上述油莎豆粕抗氧化肽所使用的油莎豆粕蛋白的制备方法，包括以下步骤：以油莎豆粕干粉质量计，以0.09％～0.11％的纤维素酶对油莎豆粕溶液酶解后，依次经过碱提和酸沉后，得到油莎豆粕蛋白质。
41.本发明以纤维素酶对油莎豆粕溶液酶解，得到酶解后的油莎豆粕溶液。在本发明中，所述油莎豆粕溶液优选以水为溶剂溶解油莎豆粕粉末配制而成；所述油莎豆粕粉末与水的质量体积比优选为1g:(21～23)ml，更优选为1g:22ml；所述水优选为蒸馏水。在本发明中，所述纤维素酶为所述油莎豆粕粉末质量的0.09％～0.11％，更优选为0.1％。在本发明中，所述纤维素酶的酶活力优选为2
×
105u/g。在本发明中，所述油莎豆粕优选以油莎豆为原料，采用冷榨法获得。本发明对所述冷榨法的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规冷榨法即可。本发明优选将烘干后的油莎豆粕粉碎得到所述油莎豆粕粉末；所述油莎豆粕粉末的粒径优选为20～40目，更有选为40目。本发明对所述油莎豆粕的烘干和粉碎方式没有特殊限定，采用本领域常规烘干和粉碎方式即可。
42.在本发明中，所述纤维素酶酶解的ph优选为4.2～4.6，更优选为4.3～4.5，进一步优选为4.4。本发明优选通过在所述油莎豆粕溶液中加入hcl溶液调节ph后，再加入纤维素酶。在本发明中，所述hcl溶液的物质的量浓度优选为1mol
·
l-1
。本发明优选在恒温水浴中进行酶解，所述酶解温度优选为41℃～43℃，更优选为42℃；所述酶解时间优选为1.0h～1.2h，进一步优选为1.0h～1.1h，更优选为1.0h。
43.得到所述酶解后的油莎豆粕溶液后，本发明优选还包括对所述酶解后的油莎豆粕溶液进行灭酶处理，得到灭酶处理后的油莎豆粕溶液。在本发明中，所述灭酶处理的温度优选为95～105℃，更优选为100℃；所述灭酶处理时间优选为9～11min，更优选为10min。
44.得到所述灭酶处理后的油莎豆粕溶液后，本发明对所述灭酶处理后的油莎豆粕溶
液进行碱提，得到碱提后的油莎豆粕溶液。本发明优选将灭酶处理后的油莎豆粕溶液冷却至常温后，采用naoh溶液调节所述灭酶处理后的油莎豆粕溶液的ph值，得到碱性油莎豆粕溶液。在本发明中，所述naoh溶液的物质的量浓度优选为1mol
·
l-1
；所述ph优选为8.9～9.0，更优选为9.0。
45.本发明优选将所述碱性油莎豆粕溶液在恒温水浴中提取1.0h～1.2h后，离心，得到上清液，即为碱提后的油莎豆粕溶液。在本发明中，所述提取时间优选为1.0h；所述提取温度优选为48～53℃，更优选为50℃。在本发明中，所述离心的转速优选为4200r
·
min-1
；所述离心的时间优选为15min。
46.得到所述碱提后的油莎豆粕溶液后，本发明对所述碱提后的油莎豆粕溶液进行酸沉，得到油莎豆粕蛋白。本发明优选对所述所述碱提后的油莎豆粕溶液调节ph至4.2～4.4后，得到酸性油莎豆粕溶液。在本发明中，所述ph优选为4.2，即为油莎豆粕蛋白质的等电点。本发明优选采用hcl溶液调节所述碱提后的油莎豆粕溶液的ph；所述hcl溶液的物质的量浓度优选为1mol
·
l-1
。
47.得到所述酸性油莎豆粕溶液后，本发明优选在常温下沉淀所述酸性油莎豆粕溶液后，离心，得到油莎豆粕蛋白质。在本发明中，所述沉淀时间优选为1.5～1.8h，更优选为1.5h。在本发明中，所述离心的转速优选为4200r
·
min-1
；所述离心的时间优选为15min。
48.本发明还优选对得到的所述油莎豆粕蛋白质冷冻干燥，得到油莎豆粕蛋白质粉末。本发明对所述冷冻干燥的温度和时间均无特殊限定，采用本领域熟知的温度和时间冻干即可。本发明对所述冷冻干燥设备没有特殊限定，采用本领域常规冷冻干燥设备即可。
49.在本发明中，所述油莎豆粕蛋白质的提取率优选为69.2％～71.9％。
50.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
51.实施例1
52.取一定量粉碎烘干的油莎豆粕，按料液比1g:22ml加入一定量的蒸馏水配成溶液，用1mol
·
l-1
hcl调节溶液ph为4.4；然后加入油莎豆粕干粉质量0.1％的纤维素酶，纤维素酶的酶活力为20000u/g，充分混匀后在42℃的恒温水浴中酶解1.0h，酶解结束后在100℃水浴中迅速灭酶处理10min。常温冷却后，用1mol
·
l-1
naoh调节ph为9.0，在50℃恒温水浴中碱提1h后在4200r
·
min-1
条件下离心15min，取上清液用1mol
·
l-1
hcl调节溶液ph到油莎豆粕蛋白质等电点4.2，常温下酸沉1.5h后在4200r
·
min-1
条件下离心15min，得到油莎豆粕蛋白沉淀，冷冻干燥后备用。
53.实施例2
54.除了纤维素酶的酶解ph为4.2外，其他与实施例1相同。
55.实施例3
56.除了纤维素酶的酶解ph为4.6外，其他与实施例1相同。
57.实施例4
58.除了纤维素酶的酶解时间为1.2h外，其他与实施例1相同。
59.实施例5
60.除了纤维素酶的酶解温度为41℃外，其他与实施例1相同。
61.实施例6
62.除了纤维素酶的酶解温度为43℃外，其他与实施例1相同。
63.实施例7
64.除了纤维素酶的加酶量为0.09％外，其他与实施例1相同。
65.实施例8
66.除了纤维素酶的加酶量为0.11％外，其他与实施例1相同。
67.实施例9
68.除了料液比为1g:21ml外，其他与实施例1相同。
69.实施例10
70.除了料液比为1g:23ml外，其他与实施例1相同。
71.对比例1
72.除了纤维素酶的酶解ph为4.0外，其他与实施例1相同。
73.对比例2
74.除了纤维素酶的酶解ph为4.8外，其他与实施例1相同。
75.对比例3
76.除了纤维素酶的酶解时间为0.6h外，其他与实施例1相同。
77.对比例4
78.除了纤维素酶的酶解时间为0.8h外，其他与实施例1相同。
79.对比例5
80.除了纤维素酶的酶解时间为1.4h外，其他与实施例1相同。
81.对比例6
82.除了纤维素酶的酶解温度为40℃外，其他与实施例1相同。
83.对比例7
84.除了纤维素酶的酶解温度为44℃外，其他与实施例1相同。
85.对比例8
86.除了纤维素酶的加酶量为0.08％外，其他与实施例1相同。
87.对比例9
88.除了纤维素酶的加酶量为0.12％外，其他与实施例1相同。
89.对比例10
90.除了料液比为1g:20ml外，其他与实施例1相同。
91.对比例11
92.除了料液比为1g:24ml外，其他与实施例1相同。
93.测试例1
94.油莎豆粕蛋白提取率的计算：
[0095][0096]
式中：r为油莎豆粕中蛋白的提取率，％；m1为油莎豆粕中提取的蛋白质的质量，g；m2为原油莎豆粕中蛋白质的质量，g。在本发明中，所述油莎豆粕中蛋白质的质量为4.90g/100g，依据gb5009.5-2016得出。
[0097]
采用上述方法测定实施例1～10和对比例1～11中油莎豆粕蛋白的提取率，结果如
表1和图1～5所示
[0098]
表1实施例1～10和对比例1～11中油莎豆粕蛋白的提取率结果
[0099][0100][0101]
由表1可以得出，采用本发明提供的制备方法得到油莎豆粕蛋白质的提取率在69.2％～71.9％，显著高于对比例中的提取率。
[0102]
实施例11
[0103]
取实施例1制备的油莎豆粕蛋白粉末，加入蒸馏水配制成底物浓度为4.7％的油莎豆粕蛋白溶液，用0.5mol
·
l-1
naoh和0.5mol
·
l-1
的hcl调节溶液的ph为6.7，以油莎豆粕蛋白质量计，加入5％的混合蛋白酶，其中碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶质量比为1:1，碱性蛋白酶与中性蛋白酶的酶活力均为10万u/g，在64℃的恒温水浴中酶解2.5h，得到油莎豆粕抗氧化
肽。
[0104]
实施例12
[0105]
除了混合酶的加酶量为6％外，其他与实施例11相同。
[0106]
实施例13
[0107]
除了混合酶的底物浓度为4.5％外，其他与实施例11相同。
[0108]
实施例14
[0109]
除了混合酶的底物浓度为4.9％外，其他与实施例11相同。
[0110]
实施例15
[0111]
除了混合酶的酶解ph为6.5外，其他与实施例11相同。
[0112]
实施例16
[0113]
除了混合酶的酶解ph为6.9外，其他与实施例11相同。
[0114]
实施例17
[0115]
除了混合酶的酶解时间为3.0h外，其他与实施例11相同。
[0116]
实施例18
[0117]
除了混合酶的酶解温度为63℃外，其他与实施例11相同。
[0118]
实施例19
[0119]
除了混合酶的酶解温度为65℃外，其他与实施例11相同。
[0120]
对比例12
[0121]
除了混合酶的加酶量为3％外，其他与实施例11相同。
[0122]
对比例13
[0123]
除了混合酶的加酶量为4％外，其他与实施例11相同。
[0124]
对比例14
[0125]
除了混合酶的加酶量为7％外，其他与实施例11相同。
[0126]
对比例15
[0127]
除了混合酶的底物浓度为4.3％外，其他与实施例11相同。
[0128]
对比例16
[0129]
除了混合酶的底物浓度为5.1％外，其他与实施例11相同。
[0130]
对比例17
[0131]
除了混合酶的酶解ph为6.3外，其他与实施例11相同。
[0132]
对比例18
[0133]
除了混合酶的酶解ph为7.1外，其他与实施例11相同。
[0134]
对比例19
[0135]
除了混合酶的酶解时间为1.0h外，其他与实施例11相同。
[0136]
对比例20
[0137]
除了混合酶的酶解时间为1.5h外，其他与实施例11相同。
[0138]
对比例21
[0139]
除了混合酶的酶解时间为2.0h外，其他与实施例11相同。
[0140]
对比例22
[0141]
除了混合酶的酶解温度为62℃外，其他与实施例11相同。
[0142]
对比例23
[0143]
除了混合酶的酶解温度为66℃外，其他与实施例11相同。
[0144]
测试例1
[0145]
dpph自由基清除率的测定方法：
[0146]
1)用无水乙醇配制0.2mm dpph溶液，避光保存；
[0147]
2)移取2ml dpph与2ml样液进行混合，摇匀，室温下避光处静置反应30min后，以等体积无水乙醇调零，测定517nm波长处吸光度值(ai)；
[0148]
3)测定2ml样品与2ml无水乙醇混合后的吸光度值(aj)；
[0149]
4)测定2ml dpph溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度值(a0)。
[0150]
计算公式如下：dpph自由基清除率(％)＝[a0–
(ai–aj
)]
×
100/a0[0151]
dpph自由基清除率测定参考文献：[1]li bo,duwenkai,jin jianchang,et al.preservation of(-)-epigallocatechin-3-gallate antioxidant properties loaded in heat treatedβ-lactoglobulin nanoparticles.[j].journal ofagricultural and food chemistry,2012,60(13):3477-84.
[0152]
[2]ah-na kim et al.degradation kinetics of phenolic content and antioxidant activity of hardy kiwifruit(actinidia arguta)puree at different storage temperatures[j].lwt-food science andtechnology,2018,89:535-541.
[0153]
采用上述方法测定实施例11～19和对比例12～23中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率，结果如表2和图6～10所示。
[0154]
表2实施例11～19和对比例12～23中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率
[0155][0156][0157]
由表2可以得出，采用本发明制备方法得到的油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率为86.5％～89.2％，显著高于对比例中油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率。
[0158]
由以上实施例可知采用本发明提供的制备方法制备得到的油莎豆粕抗氧化肽的dpph自由基清除率为86.5％～89.2％；油莎豆粕蛋白的提取率为69.2％～71.9％。
[0159]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。