一种蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性的检测方法与流程

1.本发明涉及一种耐药性及其稳定性的检测方法，尤其涉及一种蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性的检测方法。


背景技术：

2.近年来抗生素的大量生产、过量使用和处置排放缺乏有效监管导致河湖水体中抗生素检出率不断上升，河湖水体已成为巨大的抗生素和耐药基因库。低浓度抗生素的长期暴露不可避免地会通过基因突变诱导、水平传递和代际遗传的方式促使细菌耐药性扩散蔓延，抗生素抗性基因通过水生食物链遗传扩增并逐级传递给甲壳纲类、鱼类等可食用水产品，不仅降低水产养殖病害防治效果，还通过饮水、食用水产品和农产品回到人体内，促使细菌尤其是致病菌的耐药性进一步增加，导致抗生素治疗效能逐渐降低甚至消失，轻则医疗时间延长、费用增加，重则可能无药可治，甚至出现生命危险，严重威胁人类健康和社会稳定。
3.蓝藻又称蓝细菌，具有与革兰氏阴性细菌相似的细胞结构特点和遗传学特性，既是水生态系统平衡和水环境演变的重要指示物种，也是水生态系统中抗生素耐药基因的重要载体和传播中转站，其抗生素耐药性通常可作为评价河湖水体抗生素及耐药基因污染水平的重要依据。蓝藻的表型和基因型耐药性已被广泛检出，通过自身抗性、抗生素压力下基因突变和外源耐药基因转导等方式对一些抗生素表现低敏感性，其表型和基因型耐药性通常呈显著正相关性。但是，部分蓝藻样品呈现较高的基因型抗性水平的同时，在最小抑制浓度(mic)测试中往往表现出抗生素的表型敏感性。目前学界普遍认为最小抑制浓度(mic)是细菌敏感或者耐药的判断标准。mic数据通常是在有利于抗生素灭菌或抑菌作用的条件下获得的，其测试时培养基上细菌生长密度低、处于指数生长阶段且添加抗生素时间较短。然而，基于mic标准被分类为敏感型的致病菌在长期暴露于抗生素之后可能会表现出耐药性，其中一个很重要的原因就是细菌的抗生素异质耐药性。
4.抗生素异质耐药性(antibiotic heteroresistance)通常是指某个单一分离的菌株，在其培养的群体中存在着对抗生素敏感性不同的亚群，也即有些细胞对抗生素敏感，而另一些细胞则存在耐药性，此时便称该细菌为抗生素异质性耐药菌株。这些对抗生素敏感性不同亚群的蓝藻细胞数量较少，难以被mic数据所反映，然而在长期的抗生素选择下这些本是少数的亚群可能成为主要类群，而不稳定的异质耐药性更会加剧蓝藻抗生素耐药假阴性的隐蔽程度。蓝藻异质耐药性降低了实验室蓝藻菌株mic数据的可靠性，可能造成对河湖水环境抗生素耐药性水平的低估，为蓝藻环境样品的抗生素耐药性评估带来了严峻挑战。
5.尽管抗生素异质耐药性这一现象早已被国内外相关研究发现，针对临床中所使用抗生素的细菌异质耐药性出现频次及其对于抗生素治疗失败的相对贡献仍然所知甚少。目前关于蓝藻抗生素异质耐药性的研究相对缺乏，主要是由于两个原因，一个是蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性定义及鉴别方法论的模糊，另一个是蓝藻菌株的mic折点目前尚无准确的数据库，临床测试抗生素敏感度的方法用于检测蓝藻异质耐药性仍是十分困难的。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明的目的是提供一种高效经济、降低假阴性误判概率的蓝藻抗生素异质耐药性的检测方法；本发明的另一目的是提供一种蓝藻抗生素异质耐药性的稳定性的检测方法。
7.技术方案：本发明的蓝藻抗生素异质耐药性的检测方法，包括以下步骤：
8.(1)在不同采样点采集n份蓝藻群落样品，在蓝藻群落样品分离出蓝藻目标种属，获得m份目标种属样品；其中m≤n，n份蓝藻群落中包含若干蓝藻种属，但并非每份蓝藻群落中都包含目标种属，因此n份试样中仅能分离得到m份试样。
9.(2)采用梯度浓度的抗生素分别培养m份目标种属样品，通过微量稀释法分别测得每份目标种属样品的抗生素最低抑制浓度，取其中的最低值计为目标种属的群落mic。
10.(3)取浓度为群落mic的0、1、n倍的抗生素分别培养待测蓝藻，待测蓝藻为具有单一种属的蓝藻，且种属为目标种属，其中2≤n≤8，在与步骤(2)中相同培养条件下并培养同样天数后，统计各组蓝藻的细胞个数，并分别记作p0、p1、pn；若pn＜(10％～50％)p0，则通过以下公式计算待测蓝藻的抗生素异质耐药性水平f：
[0011][0012]
进一步地，步骤(3)中，f≥0.0001％～0.00001％，则待测蓝藻具有异质耐药性；f≤0.0001％～0.00001％，则待测蓝藻具有敏感性。
[0013]
进一步地，步骤(3)中，若p1≥p0且pn≥p0，则待测蓝藻具有耐药性。
[0014]
进一步地，步骤(1)中，在无菌条件下从蓝藻群落样品中分离纯化出蓝藻目标种属，并在bg11液态培养基中培养若干天，然后浓缩至蓝藻细胞密度约10
8-109个/l作为试样。
[0015]
进一步地，步骤(2)中，微量稀释法中阳性对照组加入用于测试抗生素标液活性的大肠杆菌k12。
[0016]
进一步地，步骤(2)中，抗生素最低抑制浓度判断方法为：与阴性对照组进行对比，完全抑制蓝藻细胞生长且藻细胞均被破坏的抗生素浓度。
[0017]
进一步地，通过光密度分析和荧光显微镜镜检分析蓝藻细胞数量和细胞完整性。
[0018]
进一步地，步骤(2)中和步骤(3)中，培养的条件为25.0
±
0.5℃，50
±
5μe/m/s，14/10小时光暗比。
[0019]
另一方面，本发明的蓝藻抗生素异质耐药性的稳定性的检测方法，包括根据权利要求1-8任一所述的检测方法，还包括以下步骤：
[0020]
(1)将筛选得到的具有抗生素异质耐药性的蓝藻进行分离，得到若干个蓝藻菌落，取浓度为n倍群落mic值的抗生素培养蓝藻菌落若干小时；
[0021]
(2)培养后的蓝藻菌落一部分测原始蓝藻菌落mic值；另一部分蓝藻菌落在无抗生素压力的环境中转代大于等于50次，然后测转代蓝藻菌落mic值；若相比于原始蓝藻菌落mic值，转代蓝藻菌落mic值未显著下降，则具有抗生素异质耐药性的稳定性。
[0022]
进一步地，步骤(2)中转代的方法为每次将蓝藻菌落的母液添加到50倍体积的未添加抗生素的无菌bg11液态培养基中。
[0023]
本发明建立高效经济的蓝藻抗生素异质耐药性及其稳定性的检测和判定方法，用于替代传统的mic测试方法，可规避mic测试方法对抗生素耐药性水平的低估，有效降低对含有少量耐药亚菌群的蓝藻群落的假阴性误判概率，有助于全面准确评价河湖水生态系统
抗生素耐药性，对于深化抗生素耐药基因水环境行为机理与生态风险控制对策研究具有重要的科学价值。
[0024]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)有效降低了对含有少量耐药亚菌群的蓝藻群落的假阴性误判概率，规避了传统最小抑制浓度(mic)测试方法对抗生素耐药性水平的低估，采用蓝藻整体群落最低抑制浓度代替抗生素mic折点，解决蓝藻抗生素mic折点缺乏数据的技术瓶颈，首次提出了蓝藻抗生素异质耐药性定义及鉴别方法，明确了异质耐药性水平和稳定性的分析方法和判定标准；(2)本方法操作简单、节省时间，有效提升了蓝藻样品抗生素表型抗性检测的准确性，有助于全面准确评价河湖水生态系统抗生素耐药性，对于深化抗生素耐药基因水环境行为机理与生态风险控制对策研究具有重要的科学价值，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0025]
图1为蓝藻抗生素异质耐药性水平判定流程图；
[0026]
图2为蓝藻抗生素异质耐药性水平判定结果；
[0027]
图3为蓝藻抗生素异质耐药性稳定性判定流程图；
[0028]
图4为蓝藻抗生素异质耐药性稳定性判定结果。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0030]
实施例1
[0031]
一种检测蓝藻抗生素异质耐药性的方法，包括如下步骤：
[0032]
(1)待测藻株和抗生素标液准备
[0033]
蓝藻样品采集：在太湖、洪泽湖、巢湖和滇池水域中，按照全面性、代表性、客观性、可行性、连续性原则，布设共计50个采样点，采集50份蓝藻群落样品。
[0034]
蓝藻目标种属分离和培养：将采集获得的50份蓝藻群落样品分离纯化，共分离出300个蓝藻单一群落包括：鱼腥藻属、束丝藻属、蓝菌属、微囊藻属、颤藻属、浮丝藻属、尖头藻属、聚球藻属和集胞藻属，其中共有14个鱼腥藻属、25个束丝藻属、9个蓝菌属、182个微囊藻属、16个颤藻属、7个浮丝藻属、13个尖头藻属、19个聚球藻属、15个集胞藻属，按照种属分别培养；
[0035]
培养的方法：单个蓝藻种属在bg11液态培养基中培养5～7天(25.0
±
0.5℃，50
±
5μe/m/s，14/10小时光暗比)，浓缩至蓝藻细胞密度约10
8-109个/l，批量加注到96孔板中，每孔加注100μl。
[0036]
抗生素：选取了七大类19种常见抗生素，包括氨基糖甙类、氯霉素类、β-内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类，具体的抗生素种类见表1；
[0037]
表1
[0038][0039][0040]
标液配置：采用bg11液态培养基配制不同浓度的抗生素标液，抗生素标液浓度的梯度区间为2倍。
[0041]
(2)蓝藻整体群落最低抑制浓度测定
[0042]
蓝藻目标种属选择鱼腥藻属，抗生素选择氨基甙类的庆大霉素。
[0043]
采用改进后的微量稀释法分别测定14个鱼腥藻属对于庆大霉素的mic；96孔板中每孔加注100μl的单个鱼腥藻属藻液，然后将步骤(1)中配置的庆大霉素标液分别加注100μl至96孔板的待测藻液中，空白对照组不加藻液仅添加抗生素标液，阴性对照组仅加藻液不加抗生素标液，阳性对照组加入大肠杆菌k12(atcc 47076)用于测试抗生素标液活性。96孔板在相同条件下培养14天(25.0
±
0.5℃，50
±
5μe/m/s，14/10小时光暗比)，通过光密度分析(450nm)和荧光显微镜镜检(400～1000倍)分析蓝藻数量和细胞完整性，与阴性对照组进行对比，完全抑制蓝藻细胞生长且藻细胞均被破坏的最低抗生素浓度计为mic。
[0044]
重复上述步骤，直至得到14个鱼腥藻属对于庆大霉素的mic，取其中的最低值作为群落mic。
[0045]
(3)蓝藻抗生素菌谱分析
[0046]
选择步骤(1)的太湖、洪泽湖、巢湖和滇池水域内的任意采样点进行蓝藻采样，并从中分离出单一的鱼腥藻属作为待测藻液，在bg11液态培养基中培养5～7天(25.0
±
0.5℃，50
±
5μe/m/s，14/10小时光暗比)，浓缩至蓝藻细胞密度约10
8-109个/l。
[0047]
采用bg11液态培养基配制不同抗生素浓度的标液，抗生素标液浓度分别为群落mic的0(阴性对照)、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0倍，每种标液分别加注100μl至96孔板的待测藻液中，对照组设置、培养条件和指标检测方法同步骤2)；其中抗生素标液浓度为群落mic的1.0、2.0、4.0、8.0倍称为抗生素浓度组。
[0048]
(4)蓝藻抗生素异质耐药性水平判定
[0049]
如图1所示，分析不同抗生素浓度组中的蓝藻种群细胞数量，判定蓝藻抗生素异质耐药性水平。在抗生素浓度组中，如果蓝藻种群细胞数量等于或高于阴性对照组的10-50％，即可判定具有耐药性；如果蓝藻种群不符合耐药性条件，且在8倍于群落mic的抗生素浓度组中，蓝藻种群内的子集细胞数量等于或高于阴性对照组的0.0001％～0.00001％，即可判定具有异质耐药性；如果蓝藻种群不符合耐药性和异质耐药性条件，即可判定具有敏感性。
[0050]
蓝藻抗生素异质耐药性水平(f)计算方法：
[0051][0052]
其中，pn为8倍于群落mic的抗生素浓度组中蓝藻种群细胞数量，即异质耐药蓝藻种群内的子集细胞数量，p0为阴性对照组蓝藻种群细胞数量。
[0053]
14个蓝藻目标种属和19种抗生素自由组合进行测定，重复步骤(2)-(4)，获得5700种不同抗生素和待测蓝藻菌株组合的蓝藻抗生素异质耐药性水平。
[0054]
如图2所示在5700种不同抗生素和待测蓝藻菌株组合中，共有3568种组合具有耐药性，1137种具有异质耐药性，995种具有敏感性。1137种具有异质耐药性的组合中，896种在传统mic测试中表现为耐药性，241种在传统mic测试中表现为敏感性。
[0055]
实施例2
[0056]
蓝藻抗生素异质耐药性稳定性判定步骤如下：
[0057]
(1)将异质耐药组筛选得到的抗性子集细胞进行再分离，选取3～5个蓝藻菌落重新接种到相同抗生素浓度的无菌bg11液态培养基中，连续培养72小时。培养条件为25.0
±
0.5℃，50
±
5μe/m/s，14/10小时光暗比。
[0058]
(2)蓝藻菌落进行mic测试，其对照组设置、培养条件和指标检测方法同实施例1中的步骤(2)；连续转代培养50次，每次将1ml母液添加到50ml未添加抗生素的无菌bg11液态培养基中，并测定蓝藻整体种群的mic值(如图3所示)。如果在无抗生素压力的环境中转代50次后，蓝藻整体种群的mic值显著下降，即可判定蓝藻的抗生素异质耐药性不具有稳定性。
[0059]
如图4所示，在1137种具有异质耐药性的抗生素和蓝藻菌株组合中，97.7％组合的异质耐药性不具有稳定性，2.3％组合的异质耐药性具有稳定性。