一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法

技术特征：
1.一种提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，所述提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法包括以下步骤：步骤一，以α-丁酮酸为底物，通过分子对接预测可突变位点，进行td转化液的配置；步骤二，构建突变体；将构建的突变体质粒进行测序验证，我们得到了需要构建的突变体，对构建好的突变体质粒进行bl21(de3)的表达，该菌株为表达常用菌株，已公开应用，通过tlc检测筛选出活性高于野生型的突变体；步骤三，对活性高于野生型的突变体进行表达纯化，以纯酶测酶活，进行突变体酶活初筛；步骤四，进行oata野生型及突变体酶活比较、oata组合突变酶活比较。2.如权利要求1所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤一中，所述通过分子对接技术进行td转化液的配置，包括：(1)以α-丁酮酸为底物，通过分子对接技术，在参与oata与底物相互作用的氨基酸残基中，选择6个相关位点进行饱和突变；(2)用50mm的磷酸钾缓冲液配置含300mm苏氨酸和450mm异丙胺的底物，用6m hcl调ph到7.5；(3)用50mm的磷酸钾定容到500ml，向其中加入5g/l的苏氨酸脱氨酶td的发酵菌体，于37℃，220rpm摇床反应4h，菌体来源于大肠杆菌表达菌株bl21(de3)，该菌株为表达常用菌株；(4)反应完后，用tlc进行快速检测，底物苏氨酸反应完全，再用10000rpm离心25min，收集反应上清，即得到td转化液，4℃保存待用。3.如权利要求2所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，所述6个相关位点为：y20，l57，w58，g229，a230，m419。4.如权利要求1所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤二中，所述突变体的构建方法，包括：(1)以pet28a-oata质粒为模板，通过设计引物对载体进行反扩，对反扩的载体进行dpn i处理；(2)进行t5外切酶介导的同源重组，重组片段转化dh5α感受态，涂布含50μg/ml kana的lb平板，于37℃培养箱培养12-14h；(3)每个平板挑取两个单菌落接种到700μl的含50μg/ml kana的lb液体培养基，37℃，220rpm培养5-6h后送生工进行测序。5.如权利要求1所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤二中，所述通过tlc检测筛选出活性高于野生型的突变体，包括：(1)将构建好的突变体及野生型质粒转入bl21，待长出单菌落后，接入到5ml含50μg/ml kana的lb液体培养基中，37℃，220rpm培养；(2)待od600到0.6-0.8时，加入终浓度1mm的iptg，于18℃诱导12h；(3)诱导后，调整野生型及突变体的od600到3，用配置好的td转化液为底物，200μl的体系，于37℃，220rpm反应2h；(4)通过tlc进行快速检测，筛选出活性高于野生型的突变体。6.如权利要求5所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，所述层析液的
配置方法，包括：1)甲液配置：4g茚三酮溶于400ml正丁醇中，在常温用磁力搅拌器溶解；2)乙液配置：100ml冰醋酸和200ml蒸馏水混合，甲乙液分开，于4℃保存；使用时，甲液：乙液＝4：3。7.如权利要求1所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤三中，所述对活性高于野生型的突变体进行表达纯化，包括：(1)将单菌落接到5ml的含50μg/ml kana的lb液体培养基中，于37℃，220rpm摇床培养，待od600长到0.6-0.8后，取3ml转接到200ml的含50μg/ml kana的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养4-5小时，od600达到0.6-0.8；(2)加终浓度1mm的iptg，18℃诱导12h，随后在8000rpm，10min离心收集菌体，用lysis buffer洗涤菌体两次，再用25ml lysis buffer重悬菌体，设置超声波破碎仪功率为400w，开2.5s，停3.8s，破菌15min，待破菌液澄清透明后，10000rpm离心20min；(3)配置100mm，ph7.4磷酸钠缓冲液，其中取27.72g na2hpo4·
12h2o和3.526g nah2po4·
2h2o，加去离子水定容到1l，配置elution buffer，用elution buffer分别配置10mm，20mm，50mm，200mm的咪唑，向蛋白纯化柱中加入700μl镍珠，用10mm的咪唑预处理，将破菌上清加入到纯化柱中，于4℃静音混合器中混合1h，分别用10mm，20mm咪唑洗三次，再用50mm的咪唑洗一遍，最后用200mm的咪唑洗脱收集；(4)用storage buffer于超滤管中进行除盐；配置1m的底物浓度，5g 95％的α-丁酮酸，6ml异丙胺，溶于50mm的磷酸钾缓冲液中，ph 7.0，用hcl调ph到7.5，再用50mm的磷酸钾定容到46.53ml；以300mm的底物浓度0.25mg/ml的酶量，于37℃反应30min，通过hplc检测。8.如权利要求7所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，所述lysis buffer包括：50mm tris-hcl，50mm nacl，1mmβ-巯基乙醇，0.1mm pmsf，0.5mm plp；所述elution buffer包括：0.5m nacl，0.5mm plp，溶于20mm的磷酸钠缓冲液；所述storage buffer包括：0.15m nacl，0.5mm plp溶于50mm的磷酸钠缓冲液。9.如权利要求1所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤三中，所述突变体酶活初筛，包括：(1)oata的催化反应：将oata野生型及突变体的酶浓度调整为2.5mg/ml，将底物用50mm的磷酸钾缓冲液稀释到333.33mm，反应体系：100μl中，加90μl的333.33mm丁酮酸底物，10μl 2.5mg/ml的oata，使得oata的终浓度为0.25mg/ml，α-丁酮酸终浓度为300mm，反应条件：37℃，水浴反应30min；(2)反应的终止：反应30min后，向反应体系中加入100μl的乙腈，涡旋仪振荡30min，使酶变性，12000rpm离心1min；(3)制样：取50μl反应终止液，加450μl的超纯水，混匀，用0.22μm的滤膜过滤，进行液相检测。10.如权利要求1所述的提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤四中，所述进行oata野生型及突变体酶活比较、oata组合突变酶活比较，包括：(1)oata野生型及突变体的酶活比较：高效液相色谱检测可以检测出μg级的化合物，野生型及突变体在相同反应条件下，通过检测l-2-氨基丁酸的浓度，来间接比较不同oata的酶活；
(2)oata组合突变及酶活比较：将每个位点酶活最高的突变体进行双位点组合突变，载体通过单点突变进行反扩，接着进行表达纯化，酶活测定。

技术总结
本发明属于L-2-氨基丁酸合成技术领域，公开了一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，以α-丁酮酸为底物，通过分子对接技术进行ω-转氨酶的分子改造，用配置的TD转化液进行活性筛选；构建突变体；通过TLC检测筛选出活性高于野生型的突变体；对活性高于野生型的突变体进行表达纯化，以纯酶测酶活，进行突变体酶活初筛；进行OATA野生型及突变体的酶活比较、OATA组合突变及酶活比较。本发明基于半理性设计，通过对ω-转氨酶的改造，利用分子对接选取OATA活性位点周围的六个位点，通过单点饱和突变及组合突变，筛选出活性提高3.2倍的突变体L57C/M419I，为OATA的应用提供强有力支持。为OATA的应用提供强有力支持。为OATA的应用提供强有力支持。


技术研发人员：马立新 王亚平 翟超 张志威 刘洋 李霞
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：2022.01.17
技术公布日：2022/5/30