一种两亲性钆配合物及实现诊疗一体化的纳米胶束

1.本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种两亲性钆配合物及实现诊疗一体化的纳米胶束。


背景技术：

2.癌症正成为危害社会公共卫生安全的重要因素。因此，对于癌症及时、高效、精准的诊疗，关系到人民的生命健康和生活质量，以及经济和社会的可持续发展。多模态成像引导的光疗不仅可以对药物分子实时跟踪和对病灶部位进行准确定位，而且能够定点给予光照，避免对正常部位的损伤。荧光和磁共振成像的结合可以实现两者的优势互补，对诊断结果起到互相佐证的效果。目前，为了解决聚集导致荧光淬灭的问题，一般都是将聚集诱导发光基元与钆的配合物偶联，但是弛豫信号并没有提升。另外，光的组织穿透问题也进一步限制了荧光在活体上的进一步应用。如何将荧光和磁共振造影剂结合实现磁共振信号的增强，同时实现近红外光或者近红外二区荧光引导的光动力治疗一直是科学家探索的一个重要课题。
3.诊疗一体化是一种将疾病的诊断或监测与治疗有机结合的新型生物医学技术。近年来，研究人员开发了一系列能够实现癌症诊疗一体化的纳米药物，纳米胶束是一种表面活性剂或两亲性高分子的自组装聚集体，可作为药物的载体，其具有构建简单、功能多样化、装载量高等优点。胶束的内部、界面、外表面都可以进行相应的装载。
4.公开号为cn104174036a的中国专利文献公开了一种实现诊疗一体化的纳米胶束，包括aie染料、药物活性成分及双亲性载体，所述aie染料、药物活性成分及双亲性载体的质量比为1:1:5-10，该纳米胶束粒径在30-50nm之间，可以充分的利用肿瘤的epr效应，良好地聚集在肿瘤部位，实现其载带药物活性成分在肿瘤部位的富集，高效治疗肿瘤；而且，aie红光染料发光效率高，不容易淬灭，能够很好的反映药物活性成分在体内的输送和生物分布情况，能够用于肿瘤的诊断，同时与药物活性成分脂质体相比不降低药效，从而实现诊疗一体化。该发明中的aie染料是红光发射，并没有近红外发射特性，所以组织穿透深度仍然存在问题。另外，该aie染料没有光疗(比如光热或者光动力)的效果，单纯发光，与药物分子共同装载在胶束的内部，只是实现了化疗的治疗效果，没有实现多模态成像和多种治疗手段相结合。
5.公开号为cn105778021a的中国专利文献公开了一种β-环糊精基星形聚合物及其单分子胶束诊疗一体化系统，该发明利用β-环糊精连接疏水嵌段ε-己内酯(ε-cl)，再依次聚合ph响应/还原性嵌段甲基丙烯酸-2-氨基乙酯(aema)、亲水嵌段甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(pegma)，组合得到两亲性ph响应星形聚合物，进而制备两亲性ph响应星形聚合物单分子胶束系统，该系统可以同时高效负载金纳米粒子和疏水性药物，实现肿瘤成像诊断与肿瘤化疗的结合。该发明虽然实现了ph响应，但是合成方法复杂，同样没有实现双模态成像和多种治疗手段相结合。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种两亲性配合物，具有钆配合物亲水端和aie基元疏水端，可作为磁共振造影剂，能够与具有aie特性的疏水型诊疗分子(且具有近红外荧光特性以及光疗作用)相互作用形成具有优异的造影效果、肿瘤细胞杀伤能力强的纳米胶束，且该纳米胶束可以实现肿瘤部位的长效示踪，能够在保证生物体健康的同时抑制其体内肿瘤的生长。
7.具体采用的技术方案如下：
8.一种两亲性配合物，具有钆配合物亲水端和aie基元疏水端，钆配合物亲水端和aie基元疏水端通过共价键连接；
9.所述的两亲性配合物的结构式如式(
ⅰ‑
1)-(
ⅰ‑
8)所示：
10.11.式(
ⅰ‑
1)-(
ⅰ‑
8)中，r1的结构式如式(
ⅱ‑
1)-(
ⅱ‑
4)所示：
[0012][0013]
式(
ⅱ‑
1)-(
ⅱ‑
4)中，r2为c1-12的烷基或者甲氧基，*表示取代的位置。
[0014]
该两亲性配合物具有钆配合物亲水端和aie基元疏水端，钆配合物亲水端和aie基元疏水端可以通过酰胺键、亚胺键等共价键进行连接，其中aie基元疏水端具有转子结构。
[0015]
本发明还提供了所述的两亲性配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0016]
(1)将aie分子与带有保护基的配体以摩尔比1～2：1发生反应，反应粗产物经纯化后得到中间体1；
[0017]
(2)将中间体1脱去保护基，与钆盐反应后得到粗产物，经清洗后得到所述的两亲性配合物。
[0018]
所述的aie分子为溴甲基、羧基、氨基单取代的三苯胺或四苯基乙烯，或为溴甲基、羧基、氨基中的一种与r2双取代的三苯胺或四苯基乙烯。
[0019]
所述的带有保护基的配体为带有叔丁酯保护基的dota或dtpa，具有活性基团
–
nh2或
–
cooh。
[0020]
本发明还提供了一种实现诊疗一体化的纳米胶束，所述纳米胶束具有核壳结构，以两亲性表面活性剂作为载体搭载所述的两亲性配合物作为壳层，以具有aie特性的疏水型诊疗分子m作为核层；
[0021]
所述的具有aie特性的疏水型诊疗分子m还具有近红外荧光特性和光热特性，或具有近红外荧光特性和光动力特性，或具有近红外荧光特性、光热特性和光动力特性。
[0022]
该纳米胶束的形成机理以及能够实现诊疗一体化的机理为：所述的两亲性配合物在水中紧密地聚集形成小分子聚集体，阻碍了钆配合物亲水端与水分子的充分接触，表现为强荧光和低的弛豫率。但是，一方面，由于aie基元疏水端的转子结构，利于表面活性剂的疏水端插入其中，随着表面活性剂的增加，所述的两亲性配合物被分散开，搭载在两亲性表面活性剂形成的胶束的界面上，允许钆配合物与水分子的接触；另一方面，所述的两亲性配合物搭载在两亲性表面活性剂的界面上所形成的纳米胶束的尺寸相对于小分子聚集体变大，延长了磁共振造影剂的旋转相关时间，上述两种因素共同使得弛豫信号增强。
[0023]
另外，诊疗分子m具有疏水性和aie特性、并且具有近红外荧光特性以及光疗作用，光疗作用包括光热特性或光动力特性。因为诊疗分子m具有疏水性，因此在与两亲性表面活性剂作用时必然存在纳米胶束的内部，即核层。由于诊疗分子m还具有aie特性以及近红外荧光特性和光疗作用，可以与两亲性配合物的aie基元疏水端共同作用增加激光的穿透深度和治疗的效果，实现荧光和磁共振成像的结合，制备得到能实现诊疗一体化的纳米胶束。
[0024]
基于上述纳米胶束的形成机理以及能够实现诊疗一体化的机理，所述的诊疗分子m只要具有疏水性、aie特性以及近红外荧光特性和光疗作用即可形成纳米胶束并实现诊疗一体化，优选的，所述的具有aie特性的疏水型诊疗分子m的结构式如式(
ⅲ‑
1)所示：
[0025][0026]
式(
ⅲ‑
1)中的aie分子具有绝对疏水性，且具有近红外荧光发射特性和type i活性氧产生能力，即光动力特性。
[0027]
优选的，所述的两亲性表面活性剂为非离子表面活性剂，其中，亲水基团包括甘油、聚乙二醇或山梨醇中的一种，亲油基团包括长链脂肪酸、长链脂肪醇、烷基或芳基中的一种。
[0028]
进一步优选的，所述的两亲性表面活性剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)，其亲水基团为聚乙二醇，亲油基团为长链脂肪酸。
[0029]
本发明还提供了所述的实现诊疗一体化的纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
[0030]
将所述的两亲性配合物溶液、具有aie特性的疏水型诊疗分子m溶液和所述的两亲性表面活性剂溶液混合，搅拌均匀后得到混合液，将混合液滴加至去离子水中，去离子水与混合液的体积比为9：0.1～1.5；搅拌12～24小时后纯化得到所述纳米胶束；
[0031]
混合液中，两亲性配合物、具有aie特性的疏水型诊疗分子m和两亲性表面活性剂的质量比0.05～0.1：1：1。
[0032]
优选的，两亲性配合物溶液的浓度为0.1～10mg/ml；具有aie特性的疏水型诊疗分子m溶液的浓度为0.1～1mg/ml；两亲性表面活性剂溶液的浓度为0.5～2mg/ml。
[0033]
本发明还提供了所述的实现诊疗一体化的纳米胶束在肿瘤诊断和/或肿瘤治疗中的应用。
[0034]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0035]
(1)本发明提供的两亲性配合物，具有钆配合物亲水端和aie基元疏水端，以两亲性表面活性剂作为载体，能够与具有aie特性的疏水型诊疗分子m(且具有近红外荧光特性以及光疗作用)相互作用形成高弛豫率的纳米胶束，实现磁共振信号的增强。
[0036]
(2)本发明提供的纳米胶束，具有双模态成像(近红外荧光和磁共振成像)和type i光动力治疗的效果。
[0037]
(3)本发明提供的纳米胶束能够实现细胞层面的荧光和磁共振成像，且细胞相容性好，成像和造影效果优异，较临床造影剂gd-dtpa具有很大提升，且能够增加激光的穿透深度和对肿瘤的治疗效果，实现诊疗一体化。
[0038]
(4)本发明提供的纳米胶束能够实现肿瘤部位的长效示踪，能够在保证生物体健康的同时抑制其体内肿瘤的生长。
[0039]
(5)本发明提供的纳米胶束的制备方法适用范围广，所有的具有aie特性、并且具有近红外荧光特性、光热或光动力性能中至少一种的疏水型诊疗分子m都可以形成纳米胶束的核层，并基于上述特性与两亲性配合物相互作用共同实现磁共振信号的增强，增加激光的穿透深度和对肿瘤的治疗效果。
附图说明
[0040]
图1为实施例3中的tq-tpa的吸收和发射光谱。
[0041]
图2为实施例3中的tq-tpa的aie曲线。
[0042]
图3为实施例3中的tq-tpa的活性氧产生能力与浓度的关系图。
[0043]
图4为实施例3中的tq-tpa的羟基自由基产生能力验证图。
[0044]
图5为实施例3中的tq-tpa的单线态氧产生能力验证图。
[0045]
图6为实施例1中的2tpe-gd的吸收和发射光谱，其中，a为吸收光谱，b为发射光谱。
[0046]
图7为实施例1中的2tpe-gd的aie曲线。
[0047]
图8为表面活性剂dspe-peg与2tpe-gd的质量比对体系荧光强度、弛豫率以及包封率的影响图，其中，a为对体系荧光强度的影响图，b为对体系弛豫率的影响图，c为对包封率的影响图。
[0048]
图9为实施例3中tgdtt nps的形貌和尺寸表征图，其中，a为tem图片，b为动态光散射数据图。
[0049]
图10为纳米胶束tgdtt nps、2tpe-gd nps、2tpe-gd小分子聚集体以及临床造影剂gd-dtpa的弛豫率测试结果，其中，*表示显著性差异。
[0050]
图11为纳米胶束tgdtt nps的细胞荧光成像效果图。
[0051]
图12为纳米胶束tgdtt nps与临床造影剂gd-dtpa的细胞磁共振梯度幻影信噪比结果。
[0052]
图13为纳米胶束tgdtt nps在施加激光与否的情况下对细胞的杀伤效果图。
[0053]
图14为纳米胶束tgdtt nps与临床造影剂gd-dtpa在活体上的磁共振成像结果对比图及信噪比对比图，其中，a为磁共振成像结果对比图，b为信噪比对比图。
[0054]
图15为不同处理条件下活体的相对肿瘤体积随时间的变化曲线图。
[0055]
图16为不同处理条件下活体体重随时间的变化曲线图。
具体实施方式
[0056]
下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0057]
实施例1两亲性配合物2tpe-gd的合成
[0058][0059]
将三叔丁基2,2',2
”‑
(10-(2-((2-氨基乙基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三)三乙酸酯(化合物1-2，100mg，0.16mmol)(按照文献nanoscale,2017,9,4516
–
4523的方法合成)溶解在乙腈中，然后加入k2co3(27.6mg，0.2mmol)；再将溶解在乙
腈中的四苯基乙烯基苄溴(化合物1-1，135.6mg,0.32mmol)滴加到上述溶液中，回流搅拌1小时得到粗产物，然后，以二氯甲烷/甲醇(v/v 10:1)为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到中间体1-3，产率为96％。
[0060]
中间体1-3的鉴定数据如下：
[0061]1h nmr(400mhz,cdcl3)，δ7.37(s,1h),7.15-6.82(m,38h),5.27(s,1h),3.56(d,j＝87.5hz,32h),1.43(d,j＝21.7hz,27h)。
[0062]
13
c nmr(101mhz,cdcl3)，δ172.55(s),171.03(s),143.26(s),141.85(s),140.72(s),137.44(s),131.59(s),128.34(s),127.16(s),126.09(s),81.82(s),57.24(s),56.36(s),55.71(s),53.56(s),52.90(s),28.04(s)。hrms(maldi-tof)calculated for c
84h98
n6o7na[m na]

m/z:1325.7385,found:1325.7395。
[0063][0064]
在室温下将中间体1-3(100mg，0.08mmol)溶解在5ml三氟乙酸中以进行脱保护，搅拌6小时后，旋转蒸发除去过量的三氟乙酸，得到白色固体，将得到的白色固体溶于甲醇中，利用稀氢氧化钠溶液调节ph值至5～6；将溶解在3ml甲醇中的无水氯化钆(24mg，0.09mmol)逐滴加入上述溶液中，60℃反应过夜后，蒸发除去甲醇，得到粗产物；将粗产物重新溶解在二氯甲烷中，用水洗去过量的钆离子，得到终产物2tpe-gd，产率为90％。
[0065]
2tpe-gd的鉴定数据如下：hrms(maldi-tof)calculated for c
72h72
n6o7gd[m h]

m/z:1290.4703；found:1290.4673.
[0066]
实施例2两亲性配合物tpe-gd的合成
[0067]
两亲性配合物tpe-gd的合成步骤与实施例1中2tpe-gd的合成步骤基本相同，区别仅在于化合物1-1与化合物1-2的摩尔比为1:1，且反应过程中将化合物1-2的乙腈溶液缓慢滴加于化合物1-1的乙腈溶液中；得到如下式所示的tpe-gd。
[0068][0069]
tpe-gd的鉴定数据如下：hrms(maldi-tof)calculated for c
45h52
n6o7gd[m h]

m/
二基)双(n,n-二苯基苯胺)(化合物2-4)(1.43g,2mmol)、乙酸(150ml)，铁粉(3.36g,60mmol)；加热至80℃，并搅拌6小时，冷却至室温，再加水、氯甲烷洗涤3次后合并有机相，用硫酸镁干燥，减压除去溶剂后，无需进一步纯化即可得到化合物2-5。
[0082][0083]
将4,7-双(4-(二苯基氨基)苯基)苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺(化合物2-5)(196mg,0.3mmo)和苯偶酰(化合物2-6)(126mg,0.6mmol)溶于氯仿(20ml)和乙酸(20ml)的混合物中；加热至60℃，搅拌12小时；再加水、二氯甲烷萃取3次后合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，得到粗产物，然后，以二氯甲烷/己烷(v/v 1:2)作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到深蓝色固体4,4'-(6,7-二苯基-[1,2,5]噻二唑并[3,4-g]喹喔啉-4,9-二基)双(n,n-二苯基苯胺)(tq-tpa)，产率为72％。
[0084]
tq-tpa的鉴定数据如下：
[0085]1h nmr(400mhz,cdcl3,25℃)，δ(ppm):7.98(d,4h),7.66(d,4h),7.38(d,2h),7.37-7.25(m,24h),7.10(t,4h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3,25℃)δ(ppm):153.13,152.73,148.04,147.55,138.58,136.06,134.02,130.08,129.56,129.35,128.57,128.22,128.19,125.18,123.39,121.61,99.99。hrms(maldi-tof-ms)calculated for c
56h39
n6s[m h]

m/z:827.2957,found:827.2954.
[0086]
(2)实现诊疗一体化的纳米胶束tgdtt nps的合成
[0087]
首先将两亲性配合物2tpe-gd溶液(0.25mg/ml,100μl)、具有疏水性、aie特性、近红外荧光发射特性以及type i ros产生能力(即光动力特性)的tq-tpa溶液(1mg/ml,450μl)，以及二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶液(1mg/ml，450μl)混合，搅拌均匀得到1ml的混合液，然后慢慢滴加至9ml搅拌状态下的去离子水中，敞口搅拌过夜12小时。然后用分子截流量为10k的milipore超滤管来纯化纳米颗粒，将没有包进去的小分子和有机溶剂超滤掉，得到所述的实现诊疗一体化的纳米胶束tgdtt nps。
[0088]
实施例4
[0089]
本实施例中，实现诊疗一体化的纳米胶束的合成方法与实施例3中的步骤(2)基本相同，区别仅在于具有aie特性的疏水型诊疗分子m选用文献(adv.mater.2021,33,2101158)报道的如下式所示的化合物(该化合物具有近红外荧光发射、光热以及光动力特性)：
[0090][0091]
且两亲性配合物、具有aie特性的疏水型诊疗分子m和两亲性表面活性剂的质量比为0.0625：1：1；去离子水与混合液的体积比为9：0.8。
[0092]
实施例5
[0093]
本实施例中，实现诊疗一体化的纳米胶束的合成方法与实施例3中的步骤(2)基本相同，区别仅在于具有aie特性的疏水型诊疗分子m选用文献(acs nano 2020,14,7,8046
–
8058)报道的如下式所示的化合物(该化合物具有近红外荧光发射以及光动力特性)：
[0094][0095]
且两亲性配合物、具有aie特性的疏水型诊疗分子m和两亲性表面活性剂的质量比为0.05：1：1；去离子水与混合液的体积比为9：1.2。
[0096]
性能分析
[0097]
(1)tq-tpa光物理性质和活性氧产生能力测试
[0098]
由于tq-tpa分子是疏水性的，在生物体内应用时会受限。因此，将tq-tpa分子用表面活性剂包裹形成纳米粒子(tq-tpa nps)后进行光物理性质和活性氧产生能力测试。
[0099]
tq-tpa分子的吸收峰位于610nm，发射峰位于830nm(图1)，并且具有aie特性，量子产率为2.98％(图2)。
[0100]
如图3所示，tq-tpa nps具有浓度依赖的活性氧产生能力，在浓度为20μm时，产生的活性氧能使2',7'-二氯二氢荧光素(dcfh)的荧光强度提升570倍。进一步采用羟苯基荧光素(hpf)和9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(abda)两种指示剂来鉴定活性氧的种类，hpf可以用来鉴定羟基自由基(type i)，abda可以用来鉴定单线态氧(type ii)。单纯的hpf在激光照射下基本上没有荧光增强，但是加入tq-tpa nps时，hpf的荧光增强了13倍(图4)。然而，tq-tpa nps无法使得abda的吸收降低(图5)，说明其不能产生单线态氧。以上结果证实，tq-tpa纳米颗粒能够产生type i活性氧，并且具有近红外荧光发射等特性。
[0101]
(2)2tpe-gd分子的性能测试
[0102]
如图6所示，实施例1制得的2tpe-gd分子的吸收峰在370nm左右(图6中的a)，发射峰在470nm左右(图6中的b)，并且具有aie特性(图7)。
[0103]
2tpe-gd在水溶液中很容易聚集形成2tpe-gd小分子聚集体，在其中加入两亲性表
面活性剂dspe-peg，溶液的荧光强度逐渐变弱(图8中的a)，说明紧密堆积的2tpe-gd分子被表面活性剂分散开来，直至2tpe-gd分子能搭载在两亲性表面活性剂形成的壳上，形成2tpe-gd nps。磁共振造影剂必须与水接触才能提高造影效果，2tpe-gd分子搭载在两亲性表面活性剂上可以与水分子的接触更加充分，并且扩散在两亲性表面活性剂亲水端的水分子的运动也会受到一定的几何限域效应的影响，两种因素共同促使弛豫率的提升(图8中的b)。从图8中c可以看出，当2tpe-gd与dspe-peg的投料比为1:10时，包封率达到85％。
[0104]
(3)纳米胶束tgdtt nps的性能测试
[0105]
由图9中的a可知，tgdtt nps形貌为球形并且粒径为80nm左右，与动态光散射测试结果基本一致(图9中的b)，由图10可知，纳米胶束tgdtt nps的弛豫率为32.67mm-1
s-1
，均高于2tpe-gd nps、2tpe-gd小分子聚集体、临床造影剂gd-dota的弛豫率。
[0106]
对tgdtt nps在细胞荧光和磁共振双模态成像、活体肿瘤成像中的应用进行探究，如图11所示，选用405nm的激光激发，发现细胞被点亮，并且与溶酶体具有良好的共定位效果，细胞荧光成像效果优异。
[0107]
纳米胶束tgdtt nps与临床造影剂gd-dtpa的细胞磁共振梯度幻影信噪比结果(图12)表明，纳米胶束tgdtt nps相对于空白对照和临床造影剂gd-dtpa均具有良好的造影效果。
[0108]
如图13所示，纳米胶束tgdtt nps在0～40μm的浓度内具有良好的生物相容性，选用660nm激光照射细胞后，随着tgdtt nps浓度的增加，细胞存活率明显降低，对细胞的杀伤效果好。
[0109]
选择皮下种有4t1肿瘤的实验小鼠进行纳米胶束tgdtt nps的活体成像研究，对照组为临床造影剂gd-dtpa。0、1、4、7、24h的磁共振血管造影活体成像结果如图14中的a所示，纳米胶束tgdtt nps的磁共振血管造影活体成像效果更好，对其中圈出部位进行信噪比分析的结果如图14中的b所示，tgdtt nps的信噪比较临床造影剂gd-dtpa造影效果显著增强。综上所述，纳米胶束tgdtt nps能够显著增强肿瘤造影，使肿瘤部位明显变亮，并且效果持久，长达24小时，能够实现肿瘤部位的长效示踪。
[0110]
对皮下种有4t1肿瘤的实验小鼠分别进行激光 纳米胶束tgdtt nps、单独的纳米胶束tgdtt nps、单独的激光和空白对照四种处理，对小鼠的肿瘤体积和活体体重进行14天的跟踪观察，由图15可知，较于单独的纳米胶束tgdtt nps、单独的激光处理和空白对照组，激光 纳米胶束tgdtt nps处理方式对肿瘤体积有明显的抑制作用，此外，由图16可知，四种处理方式下，小鼠的体重均有上涨的趋势，说明上述4种处理方式可以在保证小鼠健康的同时抑制其体内肿瘤的生长。
[0111]
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。