一种载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备方法与流程

一种载三维胰岛
β
细胞聚集体的多孔微载体的制备方法
技术领域
1.本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备方法。


背景技术：

2.1型糖尿病是一种发病率很高的自身免疫性疾病，会导致人体多个器官的急慢性并发症。胰岛分泌的胰岛素是治疗1型糖尿病的特异性药物。因此，培养的胰岛类器官能够通过输送胰岛素治疗1型糖尿病。为了获得胰岛类器官，科研工作者开发了许多方法，包括传统的培养皿培养、添加细胞外基质的二维培养和三维组织工程技术。其中，三维组织工程技术在体外建立起模拟体内的微环境，使细胞以接近于体内的方式增殖分化。研究表明，三维组织工程技术能够在保留胰岛细胞功能的基础上，提高细胞的培养效率。尽管如此，大多数现有的胰岛类器官呈块状结构，这不仅限制了氧气、营养物质和代谢产物的交换效率，还增加了移植过程的复杂性。因此，需要为三维胰岛类器官培养设计新的组织工程材料。
3.为了实现三维胰岛类器官培养，胰岛β细胞微载体应运而生。胰岛β细胞微载体的体积在微米级水平，能够承载胰岛β细胞进行生长、增殖、分泌等生物活动。基于这些微载体，胰岛β细胞要么被培养在其外表面，要么被随机包裹在其中。尽管在微载体领域取得了一定进展，但被包裹在微载体内的胰岛β细胞仍然无法迅速获得来自周围环境的生物信息和物质，这阻碍了化学反应的发生、营养和氧气的运输、代谢废物的排放和胰岛素的分泌；而生长在微载体外表面的胰岛β细胞，受到流体剪切力的影响，难以形成三维结构。因此，载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体具有极大的前景。
4.基于此，在本发明中，我们基于微流控技术，设计发明了一种载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体，可应用于组织工程和糖尿病治疗。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是针对上述现有微载体技术的不足，提供一种载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备方法，在保证营养物质供应的基础上，还能形成三维胰岛β细胞聚集体，从而用于组织工程研究和糖尿病治疗。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一种载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备方法，先利用微流控技术制备双乳液液滴模板微球，其中内相和外相为油相溶液、中间相为水凝胶预聚溶液；形成双乳液液滴模板微球后，将中间相聚合成为多孔水凝胶微球，并去除内相和外相的油相溶液；多孔水凝胶微球的内孔呈有序排布，相邻内孔之间存在物质交换的通道，在多孔水凝胶微球的内孔中填充细胞外基质和胰岛β细胞，形成胰岛β细胞聚集体，经培养获得载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体。
8.具体包括以下步骤：
9.s1、搭建微流控双乳液液滴模板微球生成装置；
10.s2、微流控双乳液液滴模板微球的制备：
11.以油性溶液作为内相及外相，将油性溶液通入内相通道及外相通道；配制水性高分子水凝胶预聚溶液作为中间相，在其中添加水溶性表面活性剂，将水性溶液通入中间相通道；通过调节内相、中间相、外相溶液的流速，利用液体的剪切力形成油包水包油的液滴模板微球；
12.s3、载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备：
13.使用紫外光照射液滴模板微球，聚合中间相水凝胶预聚溶液，形成多孔水凝胶微球；将多孔水凝胶微球置于乙醇溶液中，在超声清洗机去除内相和外相的油相溶液，对多孔水凝胶微球进行冷冻、干燥、灭菌处理；将培养的胰岛β细胞用胰酶消化，使其形成细胞悬液，经离心后，留取离心得到的细胞沉淀物，在冰上与温度敏感性细胞外基质预聚溶液充分混合，灌注至多孔水凝胶微球的内孔之中；将含有细胞及温度敏感性细胞外基质预聚溶液的多孔水凝胶微球置于培养皿上，加入培养基，放入37℃培养箱中培养2小时后取出；液态的温度敏感性细胞外基质预聚溶液转为固态温度敏感性细胞外基质，填充于多孔水凝胶微球中；用移液枪吸取培养基，轻轻冲刷多孔水凝胶微球表面，去除多余的细胞及温度敏感性细胞外基质；将含有胰岛β细胞及温度敏感性细胞外基质的多孔水凝胶微球置于培养皿中，加入培养基，于37℃培养箱中培养，隔日换液，7日后形成载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体。
14.作为优选的方案，s2中，所述内相和外相为50cs的甲基硅油，中间相为聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酰明胶、十二烷基硫酸钠和聚醚型表面活性剂f108的混合溶液。
15.进一步的，s2中，通过调节内相和外相的流速能够调整所述多孔微球的内孔数量；内孔的数量随着内相流速的增大而增加，随着外相流速的增大而减少，从而获得不同内孔数量的多孔微球。
16.s2中，所述的多孔微球的直径在600μm
‑
800μm范围内；所述多孔微球的内孔直径在200μm
‑
400μm范围内。
17.进一步的，s1中，所述微流控双乳液液滴模板微球生成装置的搭建方法为：
18.s1
‑
1、制备内相管、中间相管、外相管和观察管：
19.使用微电极控制仪将两根第一玻璃毛细管拉细，用砂纸手工将其中一根打磨成内径为100
‑
200μm的尖头毛细管，作为微流控双乳液液滴模板微球生成装置的内相管；将另一根打磨成直径为200
‑
300μm的尖头毛细管，作为微流控双乳液液滴模板微球生成装置的中间相管；再取一根第二玻璃毛细管，用砂纸将毛细管两端打磨平滑，作为微流控双乳液液滴模板微球生成装置的外相管；取一根内径为方形管的第三玻璃毛细管，砂纸打磨平滑后作为液滴生成的观察管；将内相管、中间相管、外相管和观察管浸泡在乙醇溶液中，超声清洗5
‑
10min，然后取出，用氮气吹干或常温晾干后即可使用；
20.s1
‑
2、微流控双乳液液滴模板微球生成装置的搭建：
21.根据内相管与外相管的长度，将载玻片切割至匹配尺寸；首先将方形管用速干胶固定在载玻片中央；然后将中间相管和外相管嵌套入观察管内，中间相管的尖头插入外相管中，并对齐两者的中轴线，用速干胶将中间相管和外相管固定在载玻片上；之后将内相管嵌套入中间相管内，内相管的尖头靠近中间相管的尖头，对齐内相管与中间相管中轴线，用速干胶将内相管固定在载玻片上；最后将平头针头底部刻出与玻璃毛细管大小匹配的凹
槽，垂直于载玻片，固定在内相管与中间相管连接处、中间相管与观察管连接处及外相管与观察管连接处上方，并用速干胶固定密封。
22.其中，采用的第一玻璃毛细管外径为1000μm，内径为580μm；第二玻璃毛细管外径为1200μm，内径为900μm；第三玻璃毛细管为内径1200μm的方形管。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24.(1)本发明基于微流控技术制备双乳液液滴模板，成本低廉、操作简易、尺寸可控，可稳定量产。
25.(2)本发明基于微流控技术制备载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体，可以通过调节微流控参数实现双乳液液滴模板微球的大小、内孔数量、孔径的调节，在保证双乳液液滴模板微球产量、均匀性的条件下实现微球内孔之间、内孔与微球外界之间相通。
26.(3)本发明制备的载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体，提高了氧气、营养物质和代谢产物的交换效率，内孔填充的细胞外基质模拟了体内细胞生长的微环境，所述的载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体具有良好的生物相容性，有望作为理想的胰岛类器官应用于组织工程和糖尿病治疗领域。
附图说明
27.图1为本发明实施例载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体制备的示意图；其中，图中a为微流控双乳液液滴模板微球的制备示意图，图中b为载三维胰岛β细胞聚集体制备示意图；1.内相进液装置；2.中间相进液装置；3.外相进液装置；4.内相毛细管；5.中间相毛细管；6.观察管；7.外相毛细管；8.紫外光源；
28.图2为本发明实施例微流控双乳液液滴模板微球制备图；其中，图中a为微流控双乳液液滴模板微球生成过程，图b为微流控双乳液液滴模板微球内孔核数与流速的关系；
29.图3为本发明实施例微流控双乳液液滴模板微球光镜图；图中a
‑
d为内孔在3
‑
6个的微流控双乳液液滴模板微球光镜图像；
30.图4为本发明实施例微流控双乳液液滴模板微球单分散性；图中a
‑
d为内孔在3
‑
6个的微流控双乳液液滴模板微球直径分布柱状图；
31.图5为本发明实施例微流控双乳液液滴模板微球电镜图；其中，图中a
‑
c为微流控双乳液液滴模板微球的整体图，图中d
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f为微流控双乳液液滴模板微球的横截面图；
32.图6为本发明实施例载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体荧光染色图；其中，图中a为活细胞染色图，图中b为死细胞染色图，图中c为光镜图，图中d为叠加图；
33.图7为本发明实施例载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体钾刺激胰岛素释放试验。
具体实施方式
34.以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
35.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
36.本发明提供了一种载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备方法，先利用微流控技术制备双乳液液滴模板微球，其中，内相和外相为油相溶液，中间相为水凝胶预聚溶液，形成所述双乳液液滴模板微球后，将中间相聚合成为多孔水凝胶微球，并去除内相和外相的油相溶液；所述多孔水凝胶微球的内孔呈有序排布，相邻内孔之间存在物质交换的通道，在所述内孔填充细胞外基质与胰岛β细胞，形成胰岛β细胞聚集体，最终得到所述载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体。
37.实施例：载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备
38.(1)微流控双乳液液滴模板微球生成装置的搭建
39.使用微电极控制仪将两根外径为1000μm，内径为580μm的玻璃毛细管拉细，用砂纸手工将其中一根打磨成内径为100
‑
200μm的尖头毛细管，作为微流控双乳液液滴模板微球生成装置的内相管；将另一根打磨成直径为200
‑
300μm的尖头毛细管，作为微流控双乳液液滴模板微球生成装置的中间相管；再取一根外径为1200μm，内径为900μm的玻璃毛细管，用砂纸将毛细管两端打磨平滑，作为微流控双乳液液滴模板微球生成装置的外相管；第四根玻璃毛细管为内径1200μm的方形管，砂纸打磨平滑后作为液滴生成的观察管；将内相管、中间相管、外相管和观察管浸泡在乙醇溶液中，超声清洗5
‑
10min，然后取出，用氮气吹干或常温晾干后即可使用；
40.根据内相管与外相管的长度，将载玻片切割至匹配尺寸。首先将方形管用速干胶固定在载玻片中央；然后将中间相管和外相管嵌套入观察管内，中间相管的尖头插入外相管中，并对齐两者的中轴线，用速干胶将中间相管和外相管固定在载玻片上；之后将内相管嵌套入中间相管内，内相管的尖头靠近中间相管的尖头，对齐内相管与中间相管中轴线，用速干胶将内相管固定在载玻片上；最后将平头针头底部刻出与玻璃毛细管大小匹配的凹槽，垂直于载玻片，固定在内相管与中间相管连接处、中间相管与观察管连接处及外相管与观察管连接处上方，并用速干胶固定密封。
41.(2)微流控双乳液液滴模板微球的制备
42.配制20％聚乙二醇二丙烯酸酯、10％甲基丙烯酰明胶、2％十二烷基硫酸钠、2％聚醚型表面活性剂f108和1％光引发剂(2
‑
羟基
‑2‑
甲基苯乙酮)的混合物，用10ml注射器吸取该溶液作为中间相；用2ml注射器吸取50cs的甲基硅油作为内相；用50ml注射器吸取50cs的甲基硅油作为外相；将内相、中间相、外相所对应的注射器固定在蠕动泵上，通过pe管与微流控装置的相应通道入口端连接；设计蠕动泵参数，通过调整各相流速，获得内孔数量不同的微流控双乳液液滴模板微球。
43.(3)载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备
44.大鼠胰岛素瘤细胞ins
‑
1，培养在1640培养基，10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)的细胞培养基中，置于二氧化碳培养箱(37℃、5％co2、饱和湿度)中，隔天换液，以5天为一个周期(细胞生长达到80
‑
90％)，之后用0.25％的胰酶消化传代。
45.紫外光照射液滴模板，聚合中间相水凝胶预聚溶液，形成多孔水凝胶微球。将多孔水凝胶微球用乙醇溶液在超声清洗机清洗3次，去除内相和外相的油相溶液。将多孔水凝胶微球放入小号培养皿中，用去离子水清洗3次，冷冻、干燥多孔水凝胶微球，然后在超净台中紫外灭菌4h。将多孔水凝胶微球转移至6孔板内，加入1ml的大鼠胰岛素瘤细胞ins
‑
1(1*105cells/ml)、50％matrigel与1640培养基混合溶液，加入培养基，放入37℃培养箱中培养
2h后取出。用移液枪吸取培养基，轻轻冲刷多孔水凝胶微球表面，去除多余的细胞及matrigel。将含有ins
‑
1细胞及matrigel的多孔水凝胶微球置于培养皿中，加入2ml培养基，于37℃培养箱中培养，隔日换液，7日后形成载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体。
46.通过对微流控系统的参数进行调节，能够精准地控制微流控双乳液液滴模板微球的直径及内孔的数量，如图2所示。当中间相溶液的流量固定不变时，内孔数量与内相溶液的流量成正比，与外相溶液的流量成反比。紫外线直接照射外相毛细管内的微流控双乳液液滴模板微球，使中间相水凝胶预聚溶液即时固化，可以在外相毛细管出口便捷地大量收集多孔水凝胶微球。
47.为了观察多孔水凝胶微球的微观结构，使用光学显微镜对其进行表征，如图3所示。可以清晰地观察到内孔数量在3
‑
6个的多孔水凝胶微球。内孔数相同的多孔水凝胶微球在形态上具有均一性；多孔水凝胶微球的整体直径和内孔直径呈现出良好的单分散性，如图4所示。这说明了微流控系统能够稳定地制作多孔水凝胶微球。通过sem观察多孔水凝胶微球，可以看到多孔水凝胶微球具有内外相互贯通的独特结构，如图5所示。一方面，内孔与多孔水凝胶微球的外表面相连接，在多孔水凝胶微球表面形成开口。在后续的多孔微载体培养过程中，该结构有利于营养物质通过表面开口进入内孔，也有利于内孔的细胞分泌的胰岛素通过表面开口递送到多孔微载体外。另一方面，内孔与内孔之间的接触面存在开放的小窗口，使内孔之间相互连接，进一步提高了物质交换的效率。
48.为了进一步构建载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体，将多孔水凝胶微球清洗、冷冻、干燥、灭菌后，植入ins
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1细胞。生物体内的干细胞巢结构十分特别，其内的细胞外基质具有生物活性，同时形成了细胞膜外的细胞保护层。通过模拟干细胞巢结构，在多孔水凝胶微球内孔填充ins
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1细胞和细胞外基质的混合物。ins
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1细胞分泌的胰岛素能够加速糖原合成、抑制蛋白质和脂质分解，从而降低血糖水平。matrigel是一种由生物活性蛋白和细胞增殖生长因子组成的温度敏感性细胞外基质，当温度高于10℃时，它能转化成水凝胶。在37℃的细胞培养箱内，培养填充了ins
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1细胞和matrigel的多孔水凝胶微球，最终得到了载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体。载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体内，细胞自行聚集成多个三维胰岛β细胞聚集体，如图6所示。其形成过程不借助于人工干预，而得益于细胞的自发聚集，这更好地模拟了体内复杂微环境下细胞
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细胞和细胞
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细胞外基质的相互作用。
49.为了进一步评估载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的功能，进行了钾刺激胰岛素释放(ksis)试验。在高k

溶液的刺激下，与二维平面培养的胰岛β细胞相比，载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体分泌了更多的胰岛素，如图7所示。这归因于载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的创新性三维结构：其内孔间的小窗口使细胞通讯高效进行，表面的开口为物质交换提供了畅通的渠道；matrigel提供了促进细胞生长增殖的细胞外微环境；细胞自发聚集而成的三维胰岛β细胞聚集体，与体内真实的三维胰岛结构相似，在功能上优于以传统方式在体外培养的胰岛β细胞。
50.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。