一种地衣芽孢杆菌溶菌酶突变体及其在虹鳟鱼保鲜中的应用的制作方法

no:2所示）。优选地，所述野生型的地衣芽孢杆菌溶菌酶的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明提供比酶活提高的地衣芽孢杆菌来源的溶菌酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5所示，其特征在于，在地衣芽孢杆菌溶菌酶的c末端添加疏水短肽val-leu-ile-ala-pro、val-ala-leu-leu-phe或者val-leu-leu-ala-ile-ile-phe。
8.进一步地，本发明提供一种含有所述基因的表达载体。优选地，所述表达载体是ppic9k。
9.更进一步地，本发明提供一种表达所述地衣芽孢杆菌溶菌酶的基因工程菌。优选地，所述基因工程菌是毕赤酵母(pichia pastoris)。
10.本发明还提供一种制备比酶活提高的地衣芽孢杆菌来源的溶菌酶的方法，其特征在于，培养如所述的基因工程菌，使其表达所述溶菌酶。任选地，还包括分离纯化所述溶菌酶的步骤。
11.本发明尤其提供所述的地衣芽孢杆菌溶菌酶在水产品保鲜中的应用。其中，所述保鲜是冷藏保鲜。优选实施方式中，所述水产品是虹鳟鱼。
12.最后本发明提供一种食品保鲜剂，其含有所述的地衣芽孢杆菌溶菌酶。任选地，所述食品保鲜剂还含有抗坏血酸，水溶性壳聚糖，植酸和食盐，用水复配成水溶液。
13.本发明通过基因工程改造方法获得了比酶活明显提高的地衣芽孢杆菌溶菌酶突变体，比酶活提高0.43~1.1倍，有效提升了地衣芽孢杆菌溶菌酶的杀菌效果。不仅对致病菌具有较强的杀灭和抑制作用，同时还具有广谱抗菌的优点，并且发现该溶菌酶作为保鲜剂可明显抑制虹鳟鱼贮藏过程中微生物的生长繁殖，来保持虹鳟鱼的鲜活品质，在冷藏条件下可延长虹鳟鱼的腐败期3至6天。本发明的溶菌酶突变体具有保鲜效果显著、对人体安全无毒以及制备方法简单、操作方便等优点，在虹鳟鱼保鲜领域上具有良好的应用前景。
附图说明
14.图1为地衣芽孢杆菌溶菌酶突变体与野生型的比酶活比较图。
15.图2为经含有溶菌酶突变体的保鲜剂处理后虹鳟鱼与对照组贮藏期间的菌落总数。
具体实施方式
16.在野生型的地衣芽孢杆菌溶菌酶（seq id no:2）的c末端添加疏水短肽val-leu-ile-ala-pro、val-ala-leu-leu-phe或者val-leu-leu-ala-ile-ile-phe，可以提高地衣芽孢杆菌来源溶菌酶的比酶活达0.43~1.1倍。下面通过具体实施例对本发明进行阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。
17.实施例1 构建溶菌酶突变体质粒ppic9k-amyl-lysozyme-m1、ppic9k-amyl-lysozyme-m2和ppic9k-amyl-lysozyme-m3为了进一步提高地衣芽孢杆菌来源的溶菌酶的比酶活，有必要对溶菌酶进行分子改造以开发出更加适应现代生产需求的新型溶菌酶。通过重组技术将疏水短肽连接于蛋清溶菌酶c末端，发现改造的溶菌酶能够显著提高对大肠杆菌的杀菌活性。筛选选用疏水短肽val-leu-ile-ala-pro、val-ala-leu-leu-phe或者val-leu-leu-ala-ile-ile-phe，进行c
末端融合，对地衣芽孢杆菌来源的溶菌酶进行疏水性改造以提高其抗菌效果。
18.原始的地衣芽孢杆菌溶菌酶基因（核苷酸序列见seq id no:1）通过无缝连接克隆到ppic9k载体上，得到质粒ppic9k-amyl-lysozyme。
19.以构建突变体质粒ppic9k-amyl-lysozyme-m1为例。以重组质粒ppic9k-amyl-lysozyme为pcr扩增模板，通过pcr反应在地衣芽孢杆菌溶菌酶的c末端引入疏水多肽序列val-leu-ile-ala-pro。
20.pcr反应条件：prime star max ，98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min/2 kb，30循环；72℃ 4 min。引物为m1-f和m1-r(表1)。
21.表1 pcr引物引物名称引物序列（5
’‑3’
）m1-fgtcagaaaattcgtgttagagttctcattgccccataacatcatcatcatm1-rtggggcaatgagaactctaacacgaattttctgaccagcgtaaatcttgm2-fgtcagaaaattcgtgttagagttgctcttctcttctaacatcatcatcatm2-rgaagagaagagcaactctaacacgaattttctgaccagcgtaaatctm3-fgtcagaaaattcgtgttagagttcttctcgctattatcttttaacatcatcatcatm3-raaagataatagcgagaagaactctaacacgaattttctgaccagcgtaaatcttgpcr产物经回收后，用dpni 37℃ 酶切4小时，去除模板dna，随后回收溶解至30 μl无菌dd h2o中，转化dh5α。挑取单菌落送测序，测序正确的质粒命名为ppic9k-amyl-lysozyme-m1。提取测序正确的质粒备用。
22.以相同方法构建另外两个质粒，在地衣芽孢杆菌溶菌酶的c末端引入疏水多肽序列val-ala-leu-leu-phe或者val-leu-leu-ala-ile-ile-phe，pcr引物见表1，所选用引物为m2-f/r和m3-f/r,获得的质粒分别命名为ppic9k-amyl-lysozyme-m2和ppic9k-amyl-lysozyme-m3。
23.实施例2构建野生型和突变体溶菌酶毕赤酵母重组菌株用kpn2i内切酶分别对所构建的溶菌酶突变质粒和原始野生型质粒进行线性化处理，线性化后回收片段电转化毕赤酵母gs115，涂布md（1.34％ynb，2％葡萄糖，4
×
10-5
％biotin，1.5%琼脂）平板, 于30℃培养48h。从平板上挑取单菌落进行菌落pcr验证。选取验证正确的阳性克隆接种于含有 5 ml 0.25 mg/ml g418 的 ypd （1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）培养基中，30 ℃培养 48 h，将培养物保存在终浓度为 20%的甘油中，冻存于-80 ℃冰箱中，由此获得野生型溶菌酶毕赤酵母表达菌株 gs115(amyl-lysozyme)和溶菌酶突变体毕赤酵母表达菌株gs115(amyl-lysozyme-m1)、gs115(amyl-lysozyme-m2)和gs115(amyl-lysozyme-m3)。
24.实施例3 溶菌酶重组菌株的诱导发酵将实施例 2 中的-80℃冰箱冻存的溶菌酶野生型和突变体的表达菌, 划线于含有 0.25 mg/mlg418 的 ypd 平板，30℃培养 48h。选取单克隆菌落接种到装有 5ml 含有 0.25 mg/ml g418的 ypd 培养基的试管中，30℃ 200rpm 培养 24h，按照od=0.12的接种量接种到装有含有100 μg/ml 氨苄西林，50 μg/ml 卡那霉素的30 ml bmgy（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、4
×
10-5
％biotin、1％甘油（v/v）、1%磷酸钾盐缓冲液（ph6.0））培养基的250ml摇瓶中，30℃ 200 rpm 培养24 h后，按照od=0.17接种量接种到装有30 ml含1%
lysozyme-m2和amyl-lysozyme-m3）腐败期均可达到9至12天，与对照组相比，经保鲜剂处理后的鱼片的菌落总数增长更慢，腐败期延长了3至6天。说明含有溶菌酶突变体的复配保鲜剂处理可以有效延长虹鳟鱼鱼片的腐败期。