T细胞活化抗体的制作方法

t细胞活化抗体
1.相关专利申请的交叉引用
2.本技术要求根据《美国专利法》第119(e)条的规定于2019年6月26日递交的第62/866,699号美国专利申请和2019年12月24日递交的第62/953,302号美国专利申请的优先权，所述第62/866,699号美国专利申请和第62/953,302号美国专利申请通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
3.序列表的纳入
4.随附序列表中的材料通过本技术的引用，成为本技术的一部分。随附序列表文本文件名为ap1100_2wo_sequence_listing.txt，创建于2020年6月12日，大小为66kb。可在使用windows操作系统的计算机上使用microsoft word访问此文件。


背景技术：
技术领域
5.本发明一般涉及抗体及其抗原结合片段，具体涉及用于增强t细胞功能的抗体及其抗原结合片段。
6.背景资料
7.由于副作用较少并可长期抑制癌症复发，适应性免疫系统免疫调节已成为引人注目的癌症免疫治疗领域。t细胞的完全活化通常包括两种信号，一种是来自t细胞受体(tcr)抗原特异性信号，另一种为来自共刺激分子(如cd28)信号。在过去十年中，在t细胞上发现能积极或消极调节tcr信号传导的额外共刺激分子和共抑制分子。
8.1989年，从活化t细胞中克隆了cd137(4-1bb)(一种属于tnf受体超家族的共刺激分子)(kwon和weissman，1989)。虽然4-1bb参与强tcr信号传导能够以cd28非依赖性方式诱导产生il-2，但是4-1bb:4-1bbl通路似乎可以放大现有的共刺激信号。研究证明，cd137信号传导能够促进tcr信号传导，诱导细胞激素合成和t细胞增殖，并且能够抑制活化诱导凋亡。t细胞上的cd137刺激可诱导nf-κb和pi3k/erk信号传导通路(分别负责防止t细胞活化诱导凋亡以及诱导t细胞增殖)。cd4和cd8 t细胞均对cd137刺激作出应答，从而增强扩增和效应子功能，而cd8 t细胞则通过诱导产生更大的细胞激素优先对cd137信号传导作出应答。除了活化t细胞上的表达外，cd137还在多个造血细胞谱系(包括调节性t细胞、b细胞、自然杀伤细胞(nk)、单核细胞和树突细胞(dc))上表达。在dc中，cd137刺激增加了il-6和il-12的分泌，更重要的是，它增强了dc对同种抗原和表观抗原作出应答刺激t细胞增殖的能力。在nk中，cd137刺激促进了增殖和产生ifn-γ，但不会促进细胞溶解活性。然而，cd137刺激的nk细胞在促进活化t细胞的扩增方面具有辅助作用。
9.在临床上，抗cd137激动剂抗体乌瑞芦单抗(urelumab)(bms-663513)表现出疾病的部分缓解和部分稳定作用。但是，致命性肝毒性致使大多数试验终止。在实体瘤患者和梅克尔细胞癌患者中，对另一种抗cd137抗体乌托鲁单抗(utomilumab)(pf-05082566)进行的试验分别达到3.8％和13.3％的客观应答率(包括完全应答和部分应答)，而不会引起肝毒
性。乌瑞芦单抗和乌托鲁单抗表现出不同的特性。乌瑞芦单抗的激动剂活性很强且不依赖于交联，而乌托鲁单抗的激动剂活性很弱且依赖于交联。对于cd137，乌瑞芦单抗和乌托鲁单抗的晶体结构揭示影响cd137-cd137l相互作用的不同结合表位。不同的表位识别和cd137-cd137l结合阻断可能会使这两种抗cd137抗体产生不同效力和毒性。然而，由于抗-4-1bb单克隆抗体(mab)3h3和2a对cd137l结合具有相反的作用但同时又揭示出类似肝毒性特征，因此，配体结合不能确定cd137介导的毒性。最近，研究表明，弱激动性抗体的工程化改造fc区与fcγriib(低a/i fcγr结合比)优先结合，在不诱导肝毒性的情况下，产生了与乌瑞芦单抗相当的强效激动活性。研究表明，激动性抗cd137抗体通过以cd40依赖性方式增强t细胞的细胞毒性而具有抗癌活性。此外，抗cd137抗体需要抗原表达才能恢复已建立的低抗原性肿瘤。而且，与每种抗体的单独治疗相比，在小鼠肿瘤模型中，通过增强t细胞效应子功能和肿瘤浸润，抗pd-1和抗cd137抗体的联合应用显示了抗肿瘤活性增强。研究表明，除了抗癌治疗以外，根据治疗时机的不同，抗cd137激动剂抗体也可改善实验性自身免疫性脑脊髓炎并增强抗病毒免疫。
10.首先从发生凋亡的t细胞中分离pd-1。随后鉴定其配体pd-l1，研究证明，pd-1和pd-l1之间的相互作用可阻断t细胞活化。pd-1不在静止t细胞上表达，但活化时会受到诱导。pd-1在慢性感染和癌症中耗竭的t细胞上持续表达。在正常情况下，pd-1/pd-l1通路对于维持外周免疫耐受、预防自身免疫很重要。然而，癌症会抑制pd-l1的自我保护功能，通过各种类型癌细胞表达pd-l1，以避开免疫系统监视。靶向pd-1/pd-l1的抗体阻断抑制性信号传导，并恢复t细胞的抗癌活性。pd-1/pd-l1通路一直被视为抗肿瘤t细胞效应子功能的显性负调节因子。在临床上，在某些类型的癌症(如霍奇金淋巴瘤、梅克尔细胞癌和黑色素瘤)中，此通路的阻断已达到35％至87％的较高客观应答率。其他类型的癌症(如nsclc、头颈癌和肾细胞癌)达到了15％至25％的较低客观应答率。
11.与每种抗体的单独治疗相比，在小鼠肿瘤模型中，通过增强t细胞效应子功能和肿瘤浸润，抗pd-1和抗cd137抗体的联合应用显示了抗肿瘤活性增强。在临床上，在晚期实体瘤患者中联合应用乌托鲁单抗(0.45
–
5.0mg/kg)和派姆单抗(pembrolizumab)，显示出协同抗肿瘤作用，而无剂量限制毒性。
12.基于cd137的免疫调节作用，抗人4-1bb激动剂抗体可用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染病。然而，由于肝毒性，抗人4-1bb激动剂抗体的使用受到限制。此外，目前尚未对将4-1bb:4-1bbl通路(没有肝毒性)的活化与阻断免疫抑制或肿瘤信号传导通路结合在一起的有效治疗方法进行说明。因此，需要4-1bb:4-1bbl通路的有效参与，同时结合解除免疫活化抑制或抑制肿瘤细胞信号传导。


技术实现要素：

13.本发明基于可生成抗cd137抗体这一开创性发现，抗cd137抗体具有较强的交联依赖性激动剂活性，可能会规避临床试验中发生的肝毒性。本发明进一步基于此类发现，即靶向pd-l1和cd137的双特异性抗体具有非常活性，可增强t细胞效应子功能，并抑制体内肿瘤生长，其效果优于各种抗体单药治疗或联合治疗。例如，双特异性抗体可具有独特的抗cd137单链可变片段(scfv)，在通过与pd-l1结合的双特异性抗体另一臂进行交联后，此单链可变片段可活化t细胞。如本文所述，通过将抗pd-l1臂改为其他肿瘤特异性结合物(如抗
her2或抗肿瘤特异性聚糖)，双特异性抗体也可靶向非pd-l1表达肿瘤。在保持抗cd137单克隆抗体的抗肿瘤作用的同时，诱导靶向依赖性t细胞活化的双特异性抗体可避免肝毒性。
14.在一些实施例中，本发明提供了三种激动剂抗体或其抗原结合片段：抗cd137抗体克隆15(cd137#15)、抗cd137抗体克隆31(cd137#31)和抗cd137抗体克隆54(cd137#54)。一方面，本发明的抗cd137抗体包含一个重链可变(vh)区，其包含的氨基酸序列与选自seq id no:1、seq id no:9或seq id no:17的序列具有至少80％的序列一致性；以及一个轻链可变(v
l
)区，其包含的氨基酸序列与选自seq id no:2、seq id no:10或seq id no:18的序列具有至少80％的序列一致性。另一方面，具有vh区(包含的氨基酸序列与seq id no:1具有至少80％的一致性)和v
l
区(包含的氨基酸序列与seq id no:2具有至少80％的一致性)的抗体或抗原结合片段包含(a)v
h cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中，cdr-h1包含的氨基酸序列与seq id no:3具有至少80％的一致性，其中，cdr-h2包含的氨基酸序列与seq id no:4具有至少80％的一致性，其中，cdr-h3包含的氨基酸序列与seq id no:5具有至少80％的一致性；和(b)v
l cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中，cdr-l1包含的氨基酸序列与seq id no:6具有至少80％的一致性，其中，cdr-l2包含的氨基酸序列与seq id no:7具有至少80％的一致性，其中，cdr-l3包含的氨基酸序列与seq id no:8具有至少80％的一致性。
15.另一方面，具有vh区(包含的氨基酸序列与seq id no:9具有至少80％的一致性)和v
l
区(包含的氨基酸序列与seq id no:10具有至少80％的一致性)的抗体或其抗原结合片段包含(a)v
h cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中，cdr-h1包含的氨基酸序列与seq id no:11具有至少80％的一致性，其中，cdr-h2包含的氨基酸序列与seq id no:12具有至少80％的一致性，其中，cdr-h3包含的氨基酸序列与seq id no:13具有至少80％的一致性；和(b)v
l cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中，cdr-l1包含的氨基酸序列与seq id no:14具有至少80％的一致性，其中，cdr-l2包含的氨基酸序列与seq id no:15具有至少80％的一致性，其中，cdr-l3包含的氨基酸序列与seq id no:16具有至少80％的一致性。
16.另一方面，具有vh区(包含的氨基酸序列与seq id no:17具有至少80％的一致性)和v
l
区(包含的氨基酸序列与seq id no:18具有至少80％的一致性)的抗体或其抗原结合片段包含(a)v
h cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中，cdr-h1包含的氨基酸序列与seq id no:19具有至少80％的一致性，其中，cdr-h2包含的氨基酸序列与seq id no:20具有至少80％的一致性，其中，cdr-h3包含的氨基酸序列与seq id no:21具有至少80％的一致性；和(b)v
l cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中，cdr-l1包含的氨基酸序列与seq id no:22具有至少80％的一致性，其中，cdr-l2包含的氨基酸序列与seq id no:23具有至少80％的一致性，其中，cdr-l3包含的氨基酸序列与seq id no:24具有至少80％的一致性。
17.一方面，本发明的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。另一方面，fc结构域为igg、ige、igm、igd、iga或igy结构域。另一方面，igg结构域为igg1、igg2、igg3或igg4结构域。另外一方面，igg1结构域包含seq id no:26的氨基酸序列。在某些方面，与野生型igg1相比，igg1包含修饰或降低抗体依赖型细胞毒性(adcc)和/或补体依赖型细胞毒性(cdc)的点突变。典型的点突变包括k297a和k322a突变。另一方面，igg4结构域包含seq id no:25的氨基酸序列。另一方面，本发明的抗原片段包括scfv、f(ab)2或fab。
18.在一个实施例中，本公开还提供了一种药物合成物，包含本发明的任何一种抗体或其抗原结合片段。一方面，本发明的药物合成物的抗体或抗原结合片段包含与抗体或其
抗原结合片段一个或多个多肽c端偶联的可药用载体。另一方面，本发明的药物合成物包含双特异性抗体。
19.在一个实施例中，本公开还提供了一种癌症治疗方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段，或有效量的本发明双特异性抗体。一方面，所述癌症包括前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌(rcc)、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、造血癌或白血病。
20.在一个实施例中，本发明提供了包含一个第一抗原结合区和一个第二抗原结合区的双特异性抗体，其中，第一抗原结合区与cd137结合。一方面，本发明的双特异性抗体包含(i)一个vh区，其包含的氨基酸序列与选自seq id no:1；seq id no:9；和seq id no:17的序列具有至少80％的一致性；以及(ii)一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与选自seq id no:2；seq id no:10；和seq id no:18的序列的约100至120个氨基酸的n端序列具有至少80％的序列一致性，其中，第二抗原结合区与免疫检查点分子、免疫刺激分子或肿瘤抗原结合。
21.一方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:31或seq id no:32的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:30的轻链序列。一方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:36的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:35的轻链序列。一方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:38的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:37的轻链序列。一方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:40的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:39的轻链序列。
22.一方面，本发明的双特异性抗体包含一个第一抗原结合区，其具有(a)一个vh区(包含seq id no:9的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(包含seq id no:10的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)；或(b)一个vh区(包含seq id no:17的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(包含seq id no:18的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)。另一方面，第二抗原结合区与选自pd-l1、pd-1、ctla-4、lag3、cd28、cd40、cd137、cd27、icos、her2或聚糖的抗原结合。另一方面，第二抗原结合区与pd-l1、her2或聚糖结合。
23.一方面，本发明公开了抗pd-l1#6-cd137#54双特异性抗体(bsab)可作为平台，通过抗cd137#54单链的交联依赖性激动剂活性，充分发挥靶向依赖性t细胞的活化作用。
24.另一方面，与cd137和pd-l1结合的双特异性抗体经过修饰后再与cd137和肿瘤上表达的其他靶点结合，包括免疫调节分子和肿瘤特异性标志物，如her2或肿瘤特异性聚糖。
25.一方面，本发明双特异性抗体的第一抗原结合区和第二抗原结合区包含fc结构域、fab片段、单链可变片段(scfv)或其任何组合。另一方面，scfv包含(i)一个vh区(包含seq id no:9的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(包含seq id no:10的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)；或(ii)一个vh区(包含seq id no:17的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(包含seq id no:18的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)。另一方面，本发明的双特异性抗体包含scfv vh区和v
l
区之间的连接子。另一方面，scfv包含seq id no:33或seq id no:34的氨基酸序列。
26.一方面，本发明的双特异性抗体包含fc结构域。另一方面，fc结构域为igg结构域、ige结构域、igm结构域、igd结构域、iga结构域或igy结构域。另一方面，fc结构域为igg结构
域。另一方面，igg结构域为igg1结构域、igg2结构域、igg3结构域或igg4结构域。
27.一方面，scfv与fc结构域的c端连接。另一方面，本发明的双特异性抗体包含fab结构域和scfv结构域之间的连接子。另一方面，fab片段与fc结构域的n端连接。另一方面，fab包含pd-l1结合位点、her2结合位点或聚糖结合位点，scfv包含cd137结合位点。
28.在一个实施例中，本发明提供了一种包含治疗剂和本发明的抗体(包括任何双特异性抗体)或其抗原结合片段的抗体-药物偶联物。一方面，所述治疗剂通过连接子与抗体或抗原结合片段共价连接。
29.在一个实施例中，本发明提供了药物合成物，包含本发明的任何双特异性抗体，以及至少一个可药用载体。
30.在一个实施例中，本发明提供了一种如seq id no:1-26所示的分离氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明提供了一种如seq id no:30-40所示的分离氨基酸序列。
31.在一个实施例中，本公开还提供了一种编码所述抗体、其抗原结合片段或本发明双特异性抗体的分离氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明提供了一种编码seq id no:1-26中任何一个的分离氨基酸。在另一个实施例中，本发明提供了一种编码seq id no:30-40中任何一个的分离氨基酸序列。
附图说明
32.图1显示了采用elisa直接法筛选靶向cd137的噬菌体克隆。
33.图2显示了利用流式细胞术在cd137过量表达hek-293f细胞上靶向cd137的噬菌体克隆的结合情况。
34.图3a-3b显示了通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(page)一步蛋白g纯化抗cd137抗体导联的完整性和纯度。显示了两个批次(上图和下图)的结果。
35.图4显示了利用流式细胞术在活化后的jurkat细胞上抗cd137抗体导联的结合情况。
36.图5显示了采用elisa法的抗cd137抗体导联对重组人cd137的结合活性(ec
50
)。
37.图6显示了采用sec-hplc法的高浓度抗cd137抗体克隆31和克隆54的蛋白质聚集情况。
38.图7显示了存在抗cd137抗体导联的激动活性时t细胞的细胞激素产生情况。
39.图8显示了原代人t细胞中抗cd137抗体导联克隆对人t细胞细胞激素产生的剂量依赖性诱导情况。
40.图9显示了采用抗cd137抗体进行联合治疗可促进t细胞在混合淋巴细胞反应中产生抗pd-l1抗体介导的ifn-γ。
41.图10显示了抗cd137抗体克隆对cd137-cd137l相互作用的显著影响。
42.图11显示了体内抗cd137抗体克隆#31和#54的药代动力学曲线。
43.图12显示了与乌托鲁单抗(cd137编号)和乌瑞芦单抗(cd137编号2)相比，交联对抗cd137抗体克隆激动活性的不同要求。
44.图13显示了抗pd-l1-cd137双特异性抗体(bsab)的对称形式。
45.图14显示了采用sds-page法的蛋白g纯化抗pd-l1-cd137 bsabs的纯度和完整性。一步蛋白g色谱法可得到90％以上。
46.图15显示了采用μce-sds法的蛋白a纯化抗pd-l1-cd137 bsabs的纯度和完整性。
47.图16显示了抗pd-l1-cd137 bsabs同时识别cd137和pd-l1，如生物传感器分析所示。
48.图17显示了在混合淋巴细胞反应中，与单药治疗、联合治疗或抗pd-l1#6-cd137#31 bsab治疗相比，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab诱导协同t细胞活化。
49.图18a-18b显示了抗pd-l1#6-cd137#54 bsab可显著增强记忆性cd4(a)和记忆性cd8(b)t细胞的抗原特异性回忆应答。
50.图19显示了在与pd-l1过量表达hek-293细胞共培养t细胞的同时，抗pd-l1#6-cd137#31或抗pd-l1#6-cd137#54 bsab可诱导靶向依赖性t细胞活化。
51.图20a-20c显示了与pd-l1阳性癌细胞共培养后，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab诱导t细胞产生ifn-γ(图20a、图20c和图20b左图)和癌细胞毒性(图20b右图)。(a)nci-h1975，非小细胞肺癌细胞；(b)pc-3，前列腺癌细胞；(c)mda-mb-231，乳腺癌细胞。
52.图21a-21b显示了与her2阳性癌细胞共培养后，曲妥珠单抗(tra)cd137#54或抗her2#3-7-cd137#54 bsabs诱导cd8 t细胞产生ifn-γ。(a)skbr-3，乳腺癌细胞；(b)mda-md-361，乳腺癌细胞。
53.图22a-22b显示了与聚糖阳性癌细胞共培养后，抗聚糖cd137#54 bsab诱导cd8 t细胞产生ifn-γ(图22a左图和图22b)和癌细胞毒性(图22a右图)。(a)mcf-7，乳腺癌细胞；(b)nci-n87，胃癌细胞。
54.图23显示了抗pd-l1#6-cd137#54 bsab诱导在hek293细胞上表达的cd137的内化。
55.图24a-24b显示了存在treg细胞时，抗pd-l1#6-cd137 bsab拯救t细胞增殖(a)和细胞激素产生(b)。
56.图25a-25c显示了在通过pd-l1阳性(a)nci-h292，(b)nci-h1975和(c)bxpc-3肿瘤细胞移植的人源化小鼠中，与抗pd-l1#6和抗cd137#54抗体联合治疗相比，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab可产生更大的肿瘤生长抑制。
57.图26显示了pd-l1#6-cd137#54、her2#3-7-cd137#54和glycan-cd137#54 bsab未在人pbmc中诱导明显的细胞激素释放。
58.图27a-27b以(a)图表和(b)表格形式显示了猴子体内抗pd-l1#6-cd137#54 bsab的pk参数。
具体实施方式
59.在描述本合成物和方法之前，需要理解的是，由于所述的特定合成物、方法和实验条件可能会有所不同，因此本发明并不局限于这类特定合成物、方法和实验条件。还需要理解的是，由于本发明的范围仅限于所附权利要求书的范围，因此本发明中所采用的术语仅旨在描述而非限制特定实施例。
60.在一些实施例中，本发明提供了抗体及其与cd137结合的抗原结合片段。本发明还提供了与cd137结合的抗体氨基酸序列。本发明中所采用的术语“抗体”是指一种具有特异性结合抗原能力的免疫球蛋白分子。除非上下文另有明确说明，术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和抗独特型抗体。一方面，本发明的抗体包括单克隆抗体。本发明的抗体包括任何同型和类(如igg、ige、igm、
igd、iga和igy)或亚类(如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。本发明中所采用的“抗原结合片段”是指有能力与免疫球蛋白分子或抗体相同的抗原特异性结合的免疫球蛋白分子或抗体的一个片段或部分。示例性抗原结合片段包括scfv、fab或f(ab)2片段。本发明中所采用的“抗原结合区”是指例如通过接触抗原或蛋白质而与抗原或蛋白质结合的抗体或免疫球蛋白分子部分。抗原结合区通常包括重链可变(vh)区和轻链可变(v
l
)区。抗原结合区通常包含一个或多个抗原结合位点或补位。
61.本发明的抗体具有一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:1；seq id no:9；或seq id no:17的序列具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。本发明的抗体还包含一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:2；seq id no:10；或seq id no:18的序列具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。
62.一般情况下，“序列一致性”或“序列同源性”可互换使用，分别指两个多核苷酸或多肽序列的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确对应关系。通常，序列一致性测定技术包括测定多核苷酸的核苷酸序列和/或测定由此编码的氨基酸序列或多肽的氨基酸序列，以及将此类序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行对比。本发明中所采用的术语“百分比(％)序列一致性”或“百分比(％)一致性”(也包括“同源性”)是指在联配序列并引入间隙(如有必要)之后，为了实现最大百分比序列一致性，与参照序列中氨基酸残基或核苷酸相同的序列中氨基酸残基或核苷酸的百分比，而不考虑作为序列一致性一部分的任何保守置换。因此，通过测定两个或多个序列(多核苷酸或氨基酸)的“一致性百分比”(也称为“同源性百分比”)，即可对比两个或多个序列。与参照序列(例如核酸或氨基酸序列)(可能是较长分子内的序列(例如多核苷酸或多肽))的一致性百分比可计算为两个最佳联配序列之间的精确匹配数除以参照序列的长度再乘以100。例如，还可使用美国国立卫生研究院所提供的高级blast计算机程序(含2.2.9版)进行序列信息比较，确定一致性百分比。blast程序基于karlin和altschul的联配方法，《美国科学院院报》87:2264-2268(1990)，如altschul等人在《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-410(1990)中所述；karlin和altschul，《美国科学院院报(proc.natl.acad.sci.usa)》90:5873-5877(1993)；altschul等人，《核酸研究(nucleic acids res.)》25:3389-3402(1997)。简而言之，blast程序将一致性定义为相同联配符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列的符号总数。此程序可用于确定所对比序列整个长度上的一致性百分比。默认参数用于优化使用短查询序列进行的搜索，例如使用blastp程序。此程序还允许使用seg过滤器屏蔽wootton和federhen《计算机与化学》17:149-163(1993)seg程序确定的查询序列片段。所需序列一致性程度的范围约为80％至100％，且为介于两者之间的整数值。参照序列与需要保护的序列之间的一致性百分比可以是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至
少99.9％。一般情况下，精确匹配表示参照序列长度上的100％的一致性。用于比较序列和/或评估序列一致性的附加程序和方法包括尼德曼-翁施算法(例如参见www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/提供的emboss needle aligner，可以选择使用默认设置)、史密斯-沃特曼算法(例如参见www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/提供的emboss water aligner，可以选择使用默认设置)、pearson和lipman的相似性搜索法，1988，《美国科学院院报(proc.natl.acad.sci.usa)》85，2444，或使用这些算法的计算机程序(威斯康星州麦迪逊575 science drive遗传学计算机组，威斯康星遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta、blast p、blast n和tfasta)。在一些方面，对序列一致性的引用是指使用blast(基本局域联配搜索工具)测量的序列一致性。在其他方面，clustalw用于多序列联配。采用所选算法的任何合适参数(包括默认参数)，即可对最佳联配进行评估。
63.一方面，所述抗体或其抗原结合片段具有一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:1具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围；以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:2具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。seq id no:1提供了包含抗cd137抗体克隆#15重链可变区的氨基酸序列。seq id no:2提供了包含抗cd137克隆#15轻链可变区的氨基酸序列。
64.所述抗体或其抗原结合片段的抗原结合区通常包含互补决定区(cdr)。“互补决定区(cdr)”是指vh和v
l
的高变区。cdr包括赋予蛋白质或抗原结合特异性的抗体的靶蛋白或抗原结合位点。vh和v
l
通常包括三个按序编号的cdr。本发明中所采用的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3是指重链可变区(vh)的三个连续排列的cdr(从重链多肽的n端开始编号)。本发明中所采用的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3是指轻链可变区(v
l
)的三个连续排列的cdr(从轻链多肽的n端开始编号)。
65.一方面，所述抗体或其抗原结合片段(具有一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:1具有至少约80％的一致性，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:2具有至少约80％的一致性)的抗原结合区具有cdr-h1，其包含的氨基酸序列与seq id no:3具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，并包含cdr-h2，其包含的氨基酸序列与seq id no:4具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约
99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及包含cdr-h3，其包含的氨基酸序列与seq id no:5具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。另一方面，抗体或其抗原结合片段(具有一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:1具有至少约80％的一致性，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:2具有至少约80％的一致性)的抗原结合区具有cdr-l1，其包含的氨基酸序列与seq id no:6具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，并包含cdr-l2，其包含的氨基酸序列与seq id no:7具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及包含cdr-l3，其包含的氨基酸序列与seq id no:8具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。
66.在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:9具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:10具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。seq id no:9提供了包含抗cd137抗体克隆#31重链可变区的氨基酸序列。seq id no:10提供了包含抗cd137克隆#31轻链可变区的氨基酸序列。
67.一方面，所述抗体或其抗原结合片段(包含一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:9具有至少约80％的一致性，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:10具有至少约80％的一致性)的抗原结合区具有cdr-h1，其包含的氨基酸序列与seq id no:11具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致
性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，并包含cdr-h2，其包含的氨基酸序列与seq id no:12具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及包含cdr-h3，其包含的氨基酸序列与seq id no:13具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。另一方面，所述抗体或其抗原结合片段(包含一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:9具有至少约80％的一致性，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:10具有至少约80％的一致性)的抗原结合区具有cdr-l1，其包含的氨基酸序列与seq id no:14具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，并包含cdr-l2，其包含的氨基酸序列与seq id no:15具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及包含cdr-l3，其包含的氨基酸序列与seq id no:16具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。
68.在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段具有一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:17具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:18具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。seq id no:17提供了包含抗cd137抗体克隆#54重链可变区的氨基酸序列。seq id no:18提供了包含抗cd137
克隆#54轻链可变区的氨基酸序列。
69.一方面，所述抗体或其抗原结合片段(包含一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:17具有至少约80％的一致性，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:18具有至少约80％的一致性)的抗原结合区具有cdr-h1，其包含的氨基酸序列与seq id no:19具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，并包含cdr-h2，其包含的氨基酸序列与seq id no:20具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及包含cdr-h3，其包含的氨基酸序列与seq id no:21具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。另一方面，所述抗体或其抗原结合片段(包含一个vh区，其包含的氨基酸序列与seq id no:17具有至少约80％的一致性，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与seq id no:18具有至少约80％的一致性)的抗原结合区具有cdr-l1，其包含的氨基酸序列与seq id no:22具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，并包含cdr-l2，其包含的氨基酸序列与seq id no:23具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及包含cdr-l3，其包含的氨基酸序列与seq id no:24具有至少约80％的一致性、至少约85％的一致性、至少约90％的一致性、至少约91％的一致性、至少约92％的一致性、至少约93％的一致性、至少约94％的一致性、至少约95％的一致性、至少约96％的一致性、至少约97％的一致性、至少约98％的一致性、至少约99％的一致性、至少约99.5％的一致性、至少约99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。
70.本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含fc结构域。除非上下文另有明确说明，本发明中所采用的术语fc结构域是指抗体区，其至少包含铰链区、ch2结构域和ch3结构域。除非上下文另有明确说明，否则术语fc结构域和fc区可互换使用。在某些方面，fc结构域为igg结构域、ige结构域、igm结构域、igd结构域、iga结构域或igy结构域。可以使用任何序列和任何物种的fc结构域，包括人类、猿、猴、鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、马等。在某些方面，
fc结构域采用工程化fc结构域，即，例如利用分子生物学技术生成的非天然存在或重组fc结构域。在一些方面，igg结构域为igg1结构域、igg2结构域、igg3结构域或igg4结构域。一方面，igg4结构域包含seq id no:25的氨基酸序列。另一方面，igg1结构域包含seq id no:26的氨基酸序列。一方面，fc结构域为人fc结构域。
71.在一些实施例中，本发明还提供了包含本发明的任何抗体或其抗原结合片段以及可药用载体的药物合成物。在一些方面，可药用载体与抗体或抗原结合片段的一个或多个多肽的c端偶联。例如，可采用任何适当方式偶联可药用载体，例如包括共价偶联和使用连接子。
72.在一些实施例中，本发明提供了如seq id no:1-26所示的分离氨基酸序列。在一些实施例中，本发明还提供了编码seq id no:1-26任一氨基酸序列的分离核酸序列。
73.在一些实施例中，本发明提供了受试者癌症治疗方法。在一些方面，癌症治疗方法包括向受试者施用一定量(可有效治疗癌症)的本发明与cd137结合的任何抗体或其抗原结合片段。在一些方面，所述癌症为前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌(rcc)、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、造血癌或白血病。
74.本发明中所采用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“疗法(therapy)”、“治疗(therapeutic)”等指达到期望的药理和/或生理效果，包括但不限于缓解、延迟或减缓进展、减轻影响或症状、预防发病、抑制和改善发病、获得关于疾病、紊乱或医疗状况的有益或期望结果，例如治疗益处和/或预防益处。本发明中所采用的“治疗(treatment)”包括治疗哺乳动物特别是人类的疾病，并且包括：(a)预防受试者患上该疾病，包括易患该疾病或有患该疾病风险但尚未被诊断为患有该疾病的受试者；(b)抑制疾病，即阻止其发展；以及(c)缓解疾病，即病退。治疗益处包括根除或改善正在接受治疗的潜在性紊乱。而且，尽管受试者仍可能患有潜在性紊乱，但是，通过根除或改善与潜在性紊乱相关的一个或多个生理症状可以实现治疗益处，从而观察到受试者情况有所改善。在一些方面，尽管可能尚未就此类疾病做出诊断，但是，为获得预防益处，为有可能发展为特定疾病的受试者或者报告一种或多种疾病生理症状的受试者提供治疗或施用治疗用合成物。本公开的方法可用于任何哺乳动物或其它动物。在一些方面，治疗会使症状减轻或停止。预防效果包括延迟或消除疾病或状况的出现，延迟或消除疾病或状况症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或状况的进展，或其任何组合。
75.本发明中所采用的术语“受试者”指采用本发明公开方法的任何个体或病人。术语“受试者”可与术语“个体”或“病人”互换使用。本领域技术人员将会理解，尽管受试者可能是动物，但是受试者可以是人。因此，其它动物(包括哺乳动物，如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔，农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)，以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、红毛猩猩和大猩猩))均包含在受试者的定义中。
76.本发明中所采用的术语“有效量”或“治疗有效量”指足以达到预期用途的抗体、其抗原结合片段或本发明所述的其他合成物的量，包括但不限于本发明中定义的疾病治疗。治疗有效量可以根据预期治疗用途(例如体内)或正在接受治疗的病人和病情(例如，病人的体重和年龄、病情的严重程度、给药方式等)而变化，而且本领域普通技术人员能够容易
地确定治疗有效量。此术语也适用于将在靶细胞中诱导特定应答的剂量。具体剂量将根据特定抗体、其抗原结合片段或所选择其它合成物、需要遵循的给药方案、是否与其他化合物联合用药、给药时间、给药组织以及运载药物的物理递送系统而有所不同。
77.在一些方面，作为联合治疗，本发明的抗体或其抗原结合片段作为单药治疗或与其他治疗剂(例如放射疗法、细胞毒性化疗)及其他免疫调节剂(例如疫苗、白细胞介素、细胞激素、趋化因子和生物制品)联合。用于免疫治疗的示例性白细胞介素类包括il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-18、il-21和il-23。用于免疫治疗的示例性细胞激素包括干扰素、tnf-α、tgf-β、g-csf和gm-csf。用于免疫治疗的示例性趋化因子包括ccl3、ccl26和cxcl7。示例性生物制品包括car t细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(til)疗法和单克隆抗体，例如阿伦单抗(campath)、曲妥珠单抗(herceptin)、替伊莫单抗(zevalin)、本妥昔单抗(adcetris)、ado-trastuzumab emtansine(kadcyla)、博纳吐单抗(blincyto)、贝伐单抗(avastin)和西妥昔单抗(erbitux)。例如，抗体还包含检查点抑制剂，其包括pd-1抑制剂，如派姆单抗(keytruda)、纳武单抗(opdivo)和西米普利单抗(libtayo)，例如pd-l1抑制剂，如阿特珠单抗(tecentriq)、阿维单抗(bavencio)和度伐利尤单抗(imfinzi)，例如ctla-4抑制剂，如伊匹木单抗(yervoy)，以及其他检查点抑制剂，如抗b7-h3抗体(mga271)、抗kir抗体(利瑞鲁单抗)和抗lag3抗体(bms-986016)。
78.如以下示例所述，在一些实施例中，本发明进一步提供抗cd137激动剂抗体的表达、纯化和表征。在本发明抗体的表达构建体中可包含信号序列。可以使用任何合适的信号序列，如seq id no:27的序列。在一些方面，采用抗pd-l1抗体和本发明抗cd137抗体处理过的t细胞表明t细胞效应子功能获得进一步增强。在不存在理论限制的情况下，这种情况表明采用靶向cd137和pd-l1的双特异性抗体进行的联合治疗或治疗可克服临床试验中，单独使用每种抗体时单药治疗的较低应答率。例如，除抗pd-l1抗体以外，可使用靶向其他免疫增强抗原(如cd40或ctla-4)的联合治疗用第二抗体，或使用靶向cd137的双特异性抗体和第二抗原(如pd-l1、cd40或ctla-4)进行治疗。
79.双特异性分子(如双特异性抗体(bsab))提供了一种使用单一治疗剂同时靶向相同或不同分子靶标上多个表位的手段。例如，在不存在理论限制的情况下，与两种单克隆抗体(mab)的混合物相比，作为癌症治疗的双特异性分子有可能赋予新颖或更强有力的活性，降低商品成本，促进新治疗方案的开发。
80.因此，本发明还提供了包括双特异性抗体在内的双功能性蛋白质的表达、纯化和表征。本发明中所采用的术语“双功能性蛋白质”指具有至少两种功能的蛋白质。双功能性蛋白质的非限制性示例包括能够与两种抗原结合的双特异性抗体。例如，本发明的双特异性抗体可包含分离的功能性scfv片段，其与cd137结合并与抗pd-l1抗体的fc结构域c端融合。在一些方面，在本发明的融合构建体中与cd137结合的c端定位scfv同与其他免疫调节分子(如cd40或ctla-4)结合的抗体的fc结构域融合。例如，在其他方面，c端定位的scfv可与免疫调节分子(如cd40或ctla-4)结合。
81.在一些实施例中，本发明提供了包含第一抗原结合区和第二抗原结合区的双特异性抗体。一般情况下，第一抗原结合区和第二抗原结合区与不同的抗原或靶标特异性结合。在一些方面，第一抗原结合区和第二抗原结合区与同一抗原或靶标中的不同表位结合。
82.在一个实施例中，本发明的双特异性抗体包含与cd137结合的第一抗原结合区。第
一抗原结合区包含一个vh区，其包含的氨基酸序列与选自seq id no:1；seq id no:9和seq id no:17的序列具有至少80％的一致性、至少85％的一致性、至少90％的一致性、至少91％的一致性、至少92％的一致性、至少93％的一致性、至少94％的一致性、至少95％的一致性、至少96％的一致性、至少97％的一致性、至少98％的一致性、至少99％的一致性、至少99.5％的一致性、至少99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围，以及一个v
l
区，其包含的氨基酸序列与选自seq id no:2；seq id no:10；和seq id no:18的序列的n端序列的约100至120个氨基酸具有至少80％的一致性、至少85％的一致性、至少90％的一致性、至少91％的一致性、至少92％的一致性、至少93％的一致性、至少94％的一致性、至少95％的一致性、至少96％的一致性、至少97％的一致性、至少98％的一致性、至少99％的一致性、至少99.5％的一致性、至少99.9％的一致性以及介于两者之间的任何数字或范围。在一些方面，本发明的双特异性抗体的第二抗原结合区与免疫检查点分子、免疫刺激分子或肿瘤抗原结合。
83.seq id no:1、seq id no:9和seq id no:17(包含vh区)或seq id no:2、seq id no:10或seq id no:18(包含v
l
区)中所述序列的任何数量的氨基酸可包含在双特异性抗体中。在双特异性抗体中可包含本发明的具有vh区或v
l
区的序列的n端或c端序列。一方面，在本发明的双特异性抗体中包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:17或seq id no:18的n端或c端序列的约100至105个氨基酸、约100至110个氨基酸、约100至115个氨基酸、约100至120个氨基酸、约100至125个氨基酸以及介于两者之间的任何数字或范围。另一方面，双特异性抗体包含seq id no:1、seq id no:9或seq id no:17的序列。另一方面，双特异性抗体包含seq id no:2、seq id no:10或seq id no:18的n端序列的约100至120个氨基酸。另一方面，双特异性抗体包含seq id no:10的n端序列的约112个氨基酸或seq id no:18的n端序列的约108个氨基酸。
84.一方面，本发明的双特异性抗体的第一抗原结合区包含一个vh区(具有seq id no:9的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(具有seq id no:10的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)。另一方面，本发明的双特异性抗体的第一抗原结合区包含一个vh区(包含seq id no:17的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(包含seq id no:18的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)。
85.在一些方面，本发明的双特异性抗体的第二抗原结合区与免疫检查点分子、免疫刺激分子或肿瘤抗原结合。本发明中所采用的术语“免疫检查点分子”指对免疫应答进行抑制或负调节的任何分子。一方面，第二抗原结合区与免疫检查点分子的结合抑制了免疫检查点分子。示例性免疫检查点分子包括pd-l1、pd-1、ctla-4和lag3。本发明中所采用的术语“免疫刺激分子”指对免疫应答进行诱导、加强或负调节的任何分子。示例性免疫刺激分子包括cd28、cd40、cd137、cd27和icos。例如，在一些方面，第二抗原结合区与免疫刺激分子的结合活化了免疫刺激分子，增加了信号传导和免疫活化。本发明中所采用的术语“肿瘤抗原”指存在于肿瘤细胞表面或肿瘤细胞所表达的任何抗原。示例性肿瘤抗原包括突变癌基因的产物、产物或突变肿瘤抑制基因、除癌基因或肿瘤抑制基因以外的突变基因的产物、致癌病毒产生的肿瘤抗原、改变的细胞表面糖脂和糖蛋白、瘤胎抗原等。肿瘤抗原还包括免疫调节分子，如免疫检查点抑制剂和免疫刺激分子。相应地，在一些方面，本发明的双特异性抗体第二抗原结合区的肿瘤抗原结合作为免疫调节分子的功能。例如，一方面，第二抗原结
合区与肿瘤抗原的结合使免疫细胞(如t细胞)靶向肿瘤细胞。
86.在本发明的双特异性抗体中可包含第一和第二抗原结合区的任何组合，包括例如与任何免疫检查点分子、任何免疫刺激分子或任何肿瘤抗原结合的第一和第二抗原结合区。相应地，在一些方面，本发明的双特异性抗体的第二抗原结合区与任何免疫检查点分子、任何免疫刺激分子或任何肿瘤抗原结合。在一些方面，第一和第二抗原结合区与同一分子结合。例如，第一和第二抗原结合区可与相同分子的相同或不同表位结合。在其他方面，第一和第二抗原结合区与不同分子结合。
87.在一些方面，第二抗原结合区与选自pd-l1、pd-1、ctla-4、lag3、cd28、cd40、cd137、cd27、icos、人表皮生长因子受体2(her2)或聚糖的抗原结合。示例性聚糖包括n-聚糖、o-聚糖和鞘糖脂。聚糖可以仅在癌细胞中表达，例如globoh。一方面，第二抗原结合区与pd-l1结合。另一方面，第二抗原结合区与her2结合。另一方面，第二抗原结合区与聚糖结合。另一方面，聚糖为globoh。例如，扩大与cd137结合的双特异性抗体库和除pd-l1以外的肿瘤上表达的抗原可以使双特异性抗体靶向不表达pd-l1的癌症类型。
88.一方面，具有与cd137结合的第一抗原结合区和与pd-l1结合的第二抗原结合区的双特异性抗体同时与cd137和pd-l1结合(图16)。在没有理论限制的情况下，通过设计既能与cd137结合又能与pd-l1结合的双特异性抗体，将抗cd137结合活性限制在表达pd-l1的肿瘤部位，可以降低抗cd137抗体(如乌瑞芦单抗)临床试验中出现的肝毒性风险及其相关病死率。此外，研究认为，由于交联，同时与cd137和pd-l1结合可增强t细胞活化(另见下文示例10)。另一方面，与乌托鲁单抗和乌瑞芦单抗等参照抗体相比，具有与cd137结合的第一抗原结合区和与pd-l1结合的第二抗原结合区的双特异性抗体可诱导更强的cd137内化(图23)。
89.在一些方面，第一抗原结合区和第二抗原结合区包含scfv、f(ab)2、fab或其任何组合。一方面，第一抗原结合区包含scfv，第二抗原结合区包含fab。另一方面，本发明的双特异性抗体中包含的scfv与免疫检查点分子、免疫刺激分子或肿瘤抗原结合。另一方面，本发明的双特异性抗体中包含的scfv与cd137结合。在一些方面，本发明的双特异性抗体中包含的fab与免疫检查点分子、免疫刺激分子或肿瘤抗原结合。一方面，本发明的双特异性抗体中包含的fab与pd-l1结合。另一方面，本发明的双特异性抗体的scfv包含一个vh区(包含seq id no:9的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(包含seq id no:10的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)。另一方面，本发明的双特异性抗体的scfv包含一个vh区(包含seq id no:17的氨基酸序列)，以及一个v
l
区(包含seq id no:18的n端序列的约100至120个氨基酸的氨基酸序列)。
90.一方面，本发明的双特异性抗体包含与cd137结合的第一抗原结合区和与her2结合的第二抗原结合区。与cd137和her2结合的双特异性抗体包含与cd137结合的scfv，scfv同与her2结合的抗体的fc结构域的c端融合，例如曲妥珠单抗(重链seq id no:36)或抗her2#3-7(重链seq id no:38)。在某些方面，与cd137和her2结合的双特异性抗体进一步包含seq id no:35(曲妥珠单抗)或seq id no:37(抗her2#3-7)的轻链。另一方面，本发明的双特异性抗体包含与cd137结合的第一抗原结合区和与肿瘤特异性聚糖结合的第二抗原结合区。与cd137和肿瘤特异性聚糖结合的双特异性抗体包含与cd137结合的scfv，scfv同与肿瘤特异性聚糖结合的抗体的fc结构域的c端融合，例如本发明的抗聚糖(重链seq id no:
40)。在某些方面，与cd137和肿瘤特异性聚糖结合的双特异性抗体进一步包含seq id no:39(抗聚糖)的轻链。在一些方面，与cd137和her2或cd137以及肿瘤特异性聚糖结合的双特异性抗体进一步包含将抗cd137 scfv与fc结构域连接的连接子。可以使用任何连接子，如gs连接子(seq id no:28)、g4s连接子(seq id no:29)或其倍数。一方面，连接子为g4s连接子。
91.相应地，本发明提供了一种靶向依赖性t细胞活化平台。一方面，如图19和20所示，抗cd137 scfv的激动剂活性在与肿瘤特异性抗原(如pd-l1)结合时受到诱导。抗cd137激动剂活性也可通过与其他肿瘤特异性抗原(如her2和肿瘤特异性聚糖)结合而活化，如图21和22所示。
92.在一些方面，本发明的双特异性抗体进一步包含scfv vh区和v
l
区之间的连接子。可使用任何连接子。例如，连接子可包含任何氨基酸序列。连接子可具有任何长度，例如1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、20个氨基酸或更多氨基酸。连接子还可包含任何倍数的氨基酸序列。一个连接子中可包含任何数量倍数的氨基酸序列。seq id no:28和seq id no:29中提供了示例性连接子序列。在一些方面，scfv包含seq id no:33或seq id no:34的氨基酸序列。
93.在一些方面，本发明的双特异性抗体进一步包含fc结构域。在某些方面，fc结构域为igg结构域、ige结构域、igm结构域、igd结构域、iga结构域或igy结构域。可以使用任何序列和任何物种的fc结构域，包括人类、猿、猴、鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、马等。在一些方面，igg结构域为igg1结构域、igg2结构域、igg3结构域或igg4结构域。一方面，igg4结构域包含seq id no:25的氨基酸序列。另一方面，igg1结构域包含seq id no:26的氨基酸序列。一方面，fc结构域为人。一般情况下，人fc结构域在人类中不具有免疫原性，因此适合用于人类治疗。
94.在一些方面，本发明的双特异性抗体的scfv与fc结构域的c端偶联。一方面，连接子包含在fc结构域和scfv之间。另一方面，连接子将scfv与fc结构域连接。可以使用任何连接子，例如本发明的g4s连接子。
95.在一些方面，本发明的双特异性抗体的fab与fc结构域的n端连接。一方面，fab通过肽键与fc结构域的n端直接连接。另一方面，fab结构域通过连接子与fc结构域的n端连接。
96.在一些方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:31或seq id no:32的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:30的轻链序列。一方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:36的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:35的轻链序列。一方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:38的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:37的轻链序列。一方面，本发明的双特异性抗体包含seq id no:40的重链序列。另一方面，本发明的双特异性抗体进一步包含seq id no:39的轻链序列。尽管可采用其他任何合适的连接子，但是重链序列(如seq id no:31、seq id no:32、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40和其他序列)可包含一个或多个g连接子(seq id no:28)、一个或多个g4s连接子(seq id no:29)或
任何倍数的g连接子或g4s连接子。
97.在一些实施例中，本发明提供了如seq id no:30-40所示的分离氨基酸序列。在一些实施例中，本发明还提供了编码seq id no:30-40任一氨基酸序列的分离核酸序列。
98.在一些实施例中，本发明提供了抗体-药物偶联物。本发明的抗体-药物偶联物可包含本发明的任何抗体或其抗原结合片段。例如，在抗体-药物偶联物中可包含与cd137特异性结合的任何抗体或其抗原结合片段。在抗体-药物偶联物中也可包含本发明的任何双特异性抗体或其抗原结合片段。在一些方面，本发明的抗体-药物偶联物包含治疗剂。在本发明的抗体-药物偶联物中可包含任何治疗剂，包括小分子。在一些方面，所述治疗剂存在细胞毒活性。在抗体-药物偶联物中可包含任何具有细胞毒活性的化疗剂。示范性化疗剂包括但不限于放线菌素、全反式维甲酸、抗雌激素、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、氯苯脲、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、多西紫杉醇、多西氟哌啶、阿霉素、表阿霉素、埃托霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达柔比星、伊马替尼、伊立替康、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素c、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、紫杉醇、泰索帝、他莫昔芬、替尼泊甙、硫鸟嘌呤、拓扑替康、伐比星、维穆拉非尼、长春花碱、长春新碱和长春地辛。
99.在一些方面，本发明的抗体-药物偶联物用于治疗癌症。例如，抗体-药物偶联物中包含的抗体与肿瘤细胞上的抗原结合，从而使具有细胞毒活性的小分子或包含在抗体-药物偶联物中的其他治疗剂靶向肿瘤细胞。当抗体-药物偶联物与肿瘤细胞结合时，在肿瘤细胞中内化并释放小分子或其他治疗剂。
100.在一些方面，本发明的抗体-药物分子中包含的治疗剂与本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段共价连接。连接子可用于将治疗剂与抗体或其抗原结合片段共价连接，或与双特异性抗体或其抗原结合片段共价连接。任何合适的连接子可用于将治疗剂与本发明的抗体或其抗原结合片段共价连接，或与本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段共价连接。在一些方面，本发明的抗体-药物偶联物中包含的连接子在靶细胞外(包括在循环中)较稳定，并在靶细胞内裂解，以释放治疗剂。例如，具有细胞毒活性的治疗剂在释放时可诱发靶细胞死亡。相应地，在一些方面，治疗剂选择性地靶向肿瘤细胞。例如，治疗剂对肿瘤细胞的选择性靶向通常导致对非肿瘤细胞的细胞毒性降低，同时耐受性增加。
101.在一些实施例中，本发明提供了包含本发明的双特异性抗体的药物合成物。在药物合成物中可包含本发明的任何双特异性抗体。一方面，本发明的药物合成物中包含的双特异性抗体与cd137或pd-l1结合或与cd137和pd-l1同时结合。在药物合成物中也可包含本发明的抗体-药物偶联物。在一些方面，药物合成物用于癌症治疗。可使用本发明的药物合成物治疗任何癌症。示例性癌症包括前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌(rcc)、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、造血癌和白血病。
102.在一些实施例中，本发明提供了受试者癌症治疗方法。癌症治疗方法包括向受试者施用一定量(可有效治疗癌症)的本发明的任何双特异性抗体或其抗原结合片段。在一些方面，所述癌症为前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、头颈
癌、肾细胞癌(rcc)、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、造血癌或白血病。
103.示例
104.示例1
105.本示例说明了从omnimab库中生成抗体的情况。
106.为了生成抗cd137治疗性抗体，通过omnimab噬菌体库进行选择。噬菌体库由ap biosciences inc.(apbio inc.)建立，选用来自100多名健康捐赠者的外周血单个核细胞。将预涂膜cd137-fc重组蛋白与含有获救噬菌体的上清液一起培养1小时，并用含有0.1％吐温20的pbs洗涤三次。通过hrp偶联抗m13抗体(roche)检测到结合噬菌体，并使用tmb底物进行信号发展。记录od450读数。
107.使用hyperphage(德国海德堡progen公司的m13k07δρiii)进行第一轮洗脱。固相洗脱和抗cd137细胞洗脱用于从omnimab库中选择和分离cd137特异性结合物。使用第一轮选择中使用的重组人cd137-ecd-fc(apbio inc.)进行固相洗脱。使用cd137表达hek293细胞进行第二轮和第三轮富集。经过三轮洗脱，采用elisa直接法和facs法筛选并分离特异性cd137结合物(图1和图2)。对于facs分析，使用抗cd137噬菌体上清液(50ul/孔)对稳定表达cd137的293f细胞进行染色，以检测cd137结合活性。作为对照，稳定表达cd137的293f细胞也与2.5ug/ml抗cd137抗体(abs)在冰上培养1小时。细胞用1x pbs洗涤三次，然后用抗m13抗体(progen)在冰上培养1小时。细胞再次用1x pbs洗涤三次，然后用抗小鼠igg-alexa 488(invitrogen inc.)在冰上再培养1小时。染色后，细胞用1x pbs洗涤三次，在由facs calibur(bd biosciences，inc.)和flowjo(treestar，llc)做出分析之前，将细胞重新悬浮在1x pbs中。稳定表达cd137的293f细胞克隆13的facs分析如图2所示。分离并发送阳性结合物进行测序，以确认重链的序列和多样性。如图1和图2所示，与阴性对照相比，分离出几个特异性识别cd137抗原的克隆。
108.这些结果表明，经过三轮cd137特异性富集后获得的噬菌体克隆可以特异性识别cd137。
109.示例2
110.本示例说明了以igg形式存在的cd137特异性结合蛋白的亚克隆、表达和纯化情况。
111.为快速筛选具有t细胞活化功能的候选物，通过elisa法鉴定的阳性cd137或pd-l1结合物的重链和轻链经过扩增、消化并亚克隆到由apbio生成的携带有igg4恒定区的igg表达载体中(seq id no.25)。经过序列验证，制备质粒，并使用293fectin转染试剂(英杰(invitrogen))将质粒转染到hek293细胞中进行抗体表达。培养4天后，利用蛋白g色谱法，从培养上清液中亲合纯化分泌到无血清培养基中的抗体。浓缩纯化抗体，然后在pbs缓冲液中透析。使用nanodrop2000分光光度计测定透析蛋白的最终浓度，并使用sds-page(含或不含还原试剂)测定纯度和完整性。
112.图3显示了第一批(图3，上图)和第二批(图3，下图)纯化抗cd137抗体导联的代表性page凝胶分析。采用蛋白g色谱法(赛默飞世尔)，对转染后4天收集的哺乳动物细胞培养上清液进行纯化处理。在凝胶(3μg/泳道)上装载之前，在还原或非还原条件下，分析纯化蛋白质。结果表明，在非还原条件下，两种蛋白质的分子量约为145kda，而在还原条件下，重链
和轻链的分子量分别为～55kda和～25kda。一步蛋白g色谱法可得到90％以上的纯度。
113.这些结果表明，在hek293细胞中，各种纯化抗体导联的完整性正常。
114.示例3
115.本示例说明了抗cd137抗体与jurkat细胞的结合情况。
116.纯化抗cd137抗体导联也应用于cd137诱导的jurkat细胞，以通过facs测定结合活性。用pma(10ng/ml)和离子霉素(1μg/ml)处理jurkat细胞，以诱导cd137表达并持续2天。抗cd137(0.5μg/ml)和参照(ref)ab(0.5μg/ml)作为阳性对照，在冰上培养受刺激细胞1小时，不染色，或使用ox40参照(ref)ab作为阴性对照进行培养。细胞用1x pbs洗涤三次，然后用alexa-488-偶联山羊抗人igg(h l)(invitrogen inc.)在冰上再培养1小时。染色后，细胞用1x pbs洗涤三次，在由facs calibur(bd biosciences，inc.)和flowjo(treestar，llc)进行分析之前，将细胞重新悬浮在1x pbs中。在cd137抗体导联中，存在多个导联具有与参照抗体相当的结合活性，如图4所示。
117.这些结果表明，如流式细胞术所示，抗cd137抗体的结合可导致jurkat细胞的活化。
118.示例4
119.本示例说明了采用elisa测定抗cd137抗体结合活性的情况。
120.为了进行抗cd137抗体与cd137结合的直接配体结合分析，使用重组cd137/fc(100ng/ml)制备预涂膜孔。简而言之，在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中透析纯化人cd137-igg4 fc(apbio)，调节至1mg/ml，然后用pbs稀释到最终浓度1μg/ml。nunc-immuno maxisorp 96孔板每孔预涂0.1ml重组cd137蛋白，留出空孔进行非特异性结合对照，并在4℃下培养过夜。去除cd137重组蛋白溶液，用0.4ml洗涤缓冲液(pbs中0.1％吐温20)洗涤培养板三次。向所有孔中添加0.4ml封闭缓冲液(pbs中为5％低脂奶粉)，并在室温下培养1小时。去除封闭缓冲液，并用0.4ml洗涤缓冲液洗涤三次。
121.将预涂膜孔与纯化抗cd137抗体的系列稀释液一起培养。在pbs中制备cd137抗体的系列稀释液，每个孔中添加0.1ml系列稀释液。培养板在室温下培养1小时。去除抗体溶液，并用0.4ml洗涤缓冲液洗涤培养板三次。按1:2000用pbs稀释rp偶联山羊抗人igg、f(ab’)2特异性f(ab’)2抗体(jackson immunoresearch#109-036-097)，并按0.1ml/孔的量进行添加。将培养板在室温下培养1小时，并按0.4ml洗涤缓冲液/孔的量洗涤三次。用0.1ml tmb试剂(invitrogen)显影培养板，并在室温下培养1至5分钟。添加0.05ml 1n hcl以停止反应，并在bio-tek spectra上以450nm读取吸光度。根据抗cd137浓度绘制od450读数，并计算与cd137/fc结合的抗cd137抗体的50％有效浓度(ec
50
)值。使用graphpad prism(位于加利福尼亚州圣地亚哥的graphpad software公司)计算ec
50
值。抗cd137抗体克隆31和克隆54的ec
50
计算值显示出具有与参照抗体相当的结合活性。与参照抗体相比，抗cd137特异性抗体导联的ec
50
计算值显示出良好的结合活性(图5)。
122.显色前，用hrp结合的抗人igg1 fab抗体检测抗pd-l1抗体，并根据抗pd-l1浓度绘制od450读数图。
123.示例5
124.本示例说明了通过sec-hplc评价高浓度抗cd137抗体导联蛋白质聚集的情况。
125.使用waters alliance分离模块2695和waters 2996光电二极管阵列检测器进行
sec-hplc。将样本装载到xbridge蛋白质beh sec色谱柱(waters，目录号#176007640)上，将等度25mm磷酸钠、200mm nacl、ph 6.8作为流动相缓冲液进行sec分离。流速为0.4ml/min，进样量为10μl。以280nm用吸光度法检测峰值。在sec色谱柱上进样之前，使用0.22μm过滤器(美国密理博公司(millipore)，目录号#slgp003rb)过滤所有样本，以去除任何沉淀的蛋白质物质。使用empower 2软件进行数据分析。如图6所示，高浓度抗cd137抗体克隆31和克隆54的主峰值百分比大于90％，无明显蛋白质聚集体。
126.这些结果表明，高浓度抗cd137抗体不会产生聚集体。
127.示例6
128.本示例说明了抗cd137抗体的激动活性。
129.从功能上筛选纯化抗体导联，以确定其增强人cd3 细胞活化的能力，如增强细胞激素产生、增殖和诱导人cd3 t细胞增殖。将抗cd3抗体(1μg/ml，okt3，biolegend目录号317304)、抗cd137抗体导联或同种型抗体(1、3和10μg/ml)涂在maxisorp 96孔板上。使用rosettesep
tm
人t细胞富集液(stemcell目录号15061)从健康成人志愿者的外周血中分离出人cd3 t细胞。用cfse(celltrace
tm cfse细胞增殖试剂盒，life technologies，目录号c34554)标记分离的cd3 t细胞，并用rpmi1640培养基(含10％胎牛血清、2.5mm l-谷氨酰胺、1x青霉素/链霉素)接种在预涂膜孔(每孔1x105个细胞)中。3天后，通过流式细胞术分析细胞增殖，并通过elisa分析il-2和inf-γ的细胞激素产生。如图7和图8所示，抗cd137抗体导联#15、#31和#54显示出激动活性，通过剂量和供体依赖性方式增强受试四个供体中至少两个的cd3 t细胞活化。与参照抗体相比，抗cd137克隆#31和#54显示出与增强t细胞活化相当或更高的激动活性(乌托鲁单抗；chin等人，2018；抗体序列见www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget？dr:d10997；另见第8 337 850号美国专利)。因此，如下所述，选用克隆#31和#54进行双特异性抗体的构建。
130.示例7
131.本示例说明了在混合淋巴细胞反应中使用抗pd-l1和抗cd137抗体进行联合治疗的情况。
132.使用rosettesep
tm
人单核细胞富集液(目录号15068)从健康献血者的外周血中分离单核细胞，在含有人gm-csf和il-4(各1000u/ml，研发)的rpmi1640分化培养基中培养6天。利用流式细胞术，通过dc-sign、cd14、cd80或cd83的表达，验证树状细胞(dc)分化。将分化后的dc作为混合淋巴细胞反应(mlr)中的抗原呈递细胞(apc)。使用rosettesep
tm
人cd4 t细胞富集液(目录号15062)从人外周血中分离同种异体cd4 t细胞。根据cd3和cd4表达，cd4 t细胞的纯度约为95％。在有抗体导联(0.4、2和10μg/ml)的情况下，将cfse标记cd4 t细胞与dc共培养3天和5天。通过流式细胞术分析cd4 t细胞增殖，并通过elisa法分析培养基中il-2和inf-γ的细胞激素产生。相较于同型对照抗体，mlr中有抗pd-l1抗体时，il-2和inf-γ产生明显增多。有趣的是，例如，抗cd137抗体(如克隆#31)进一步促进了具有两个不同供体对的mlr中抗pd-l1抗体介导的ifn-γ产生，如图9所示。
133.示例8
134.本示例说明了抗cd137抗体对cd137-cd137l相互作用的影响。
135.hek-293f/cd137细胞与同型对照和抗cd137抗体(50μg/ml)在冰上培养30分钟，用pbs/2％fbs(pbs2)洗涤两次，并与his标记的4-1bbl(0.5μg/ml，acro biosystems)在冰上
培养20分钟。用pbs2洗涤两次后，分别使用抗人fc-a488(jackson immunoresearch)和抗his抗体apc(biolegend)检测hek-293f/cd137细胞上是否存在抗cd137抗体和4-1bbl，然后使用calibur流式细胞计(bd)进行分析。除同型对照培养外，几乎所有细胞均呈现a488阳性。使用flowjo(treestar，llc)计算apc通道的平均荧光强度(mfi)，数值以直方图显示(图10)。如图10所示，参照抗体1(ref1)和克隆#54有效阻断了cd137-cd137l相互作用，而参照抗体2(ref2)、克隆#15和克隆#31在阻断cd137-cd137l相互作用方面效率不太高或效率较低。
136.示例9
137.本示例说明了抗cd137抗体导联的体内药代动力学。
138.通过向scid-beige小鼠静脉团注，以每千克体重5mg的剂量向抗体给药。在完成注射后，在指定时间点采集外周血。如下所述，通过elisa法检测抗体血浆浓度。将cd137人fc(1μg/ml)预涂膜孔与滴定浓度的纯化抗cd137 igg4抗体共同培养，准备标准曲线，计算血浆中的抗体浓度(使用封闭液中的新鲜制剂)。检测时，在不同时间点所采集的样本同样适用于预涂膜cd137人fc孔。在pbs中用0.1％吐温20洗涤后，使用hrp偶联抗人fab抗体(0.4μg/ml)检测结合抗体，然后显色。用插值法计算抗体血浆浓度。使用pksolver软件计算pk参数(zhang、huo、zhou和xie，2010)。抗体显示出良好的t
1/2
(约为176小时)，auc约为7800ug/ml*h(图11)。
139.示例10
140.本示例说明了抗cd137抗体导联的交联依赖性激动活性。
141.通过用nf-κb驱动的荧光素酶和全长cd137转染hek293细胞，然后分别用潮霉素和g418进行选择，生成稳定的cd137报告细胞克隆。对于激动活性测定，将抗cd137抗体(10、2和0.4μg/ml)单独或与山羊抗人igg(5μg/ml，jackson immunoresearch，目录号109-006-008)交联添加到报告细胞中并培养5小时。使用one-glo
tm
荧光素酶检测系统(promega，目录号e6120)检测荧光素酶活性。与以往报告一致，乌托鲁单抗(cd137 ref，图12)显示出交联依赖性激动剂活性，而乌瑞芦单抗(cd137 ref2，图12)显示出交联非依赖性激动剂活性，导致在临床试验中观察到严重肝毒性。与乌托鲁单抗相比，cd137#54在交联时显示出较大的激动活性，而在没有交联的情况下，激动活性适中，与乌托鲁单抗的激动活性类似(图12)。在没有理论限制的情况下，当包含在含有肿瘤特异性结合物的双特异性抗体中时，cd137#54的此类特征可诱导靶向依赖性t细胞活化。
142.综上所述，这些结果显示了抗cd137#15、抗cd137#31、抗cd137#54激动剂活性的不同交联依赖性。
143.示例11
144.本示例说明了抗pd-l1-cd137双特异性抗体的构建、表达和纯化。
145.抗pd-l1抗体克隆6以不含adcc的igg形式使用，抗cd137抗体以scfv形式使用并融合抗pd-l1克隆6抗体fc区的c端。包含与cd137 scfv融合的抗pd-l1抗体fc区的双特异性抗体构建如下表1所示(序列)，示意图如图10所示。将短柔性肽连接子(ggggs)2(seq id no:29)放置在fc区(seq id no:25或seq id no:26)的抗pd-l1抗体重链c端与抗cd137 scfv的n端模块之间，以确保正确折叠，并尽量降低空间位阻。抗pd-l1-cd137 scfv重链的氨基酸序列如seq id no:31和seq id no:32所示。使用gibco expicho表达系统，表达抗体fc融合
蛋白构建，并通过一步蛋白g色谱法对转染细胞的细胞培养上清液进行纯化。
146.除了与上述抗cd137 scfv融合的双特异性抗pd-l1抗体fc外，融合抗cd137 scfv的抗体可包括抗抑制性免疫检查点抗体，如抗pd-1、抗ctla-4、抗lag3等，或免疫刺激性抗体，如抗cd28、抗cd40、抗cd137、抗cd27、抗icos等。对于双特异性抗体，在抗体fc结构域与抗cd137 scfv之间放置连接子，即可生成双特异性抗体。
147.双特异性抗体的纯度大于90％(图14和图15)。在一步纯化工艺中，求得纯度大于90％，此纯度与具有正确分子量(mw＝220kd)的纯化融合蛋白一致。图14显示了纯化抗pd-l1-cd137双特异性抗体(bsab)的代表性page凝胶分析。采用蛋白g色谱法(赛默飞世尔)，对转染后4天收集的哺乳动物细胞培养上清液进行纯化处理。在凝胶(3μg/泳道)上装载之前，在还原或非还原条件下分析纯化蛋白质。结果表明，在非还原条件下，两种蛋白质的分子量约为220kda，而在还原条件下，重链cd137 scfv和轻链的分子量分别为～85kda和～25kda。图15显示了采用μce-sds法的蛋白a纯化抗pd-l1#6-cd137#54 bsab的纯度和完整性。
148.示例12
149.本示例说明通过抗pd-l1-cd137双特异性抗体进行抗原识别。
150.通过(加利福尼亚州menlo park)生物传感器分析，确定抗pd-l1-cd137双特异性抗体的结合活性。在含有0.02％吐温20和0.1％bsa的dpbs中，以5μg/ml的浓度将his标记的cd137(acrobiosystems)装载到his1k(抗penta-his)生物传感器(目录号18-5120)上并持续5分钟。然后，使用同一缓冲液，以100nm将传感器暴露于所示抗体5分钟，然后与100nm的第二抗原(pd-l1融合小鼠fc结构域)关联5分钟。然后，使用制造商所述的八位字节数据采集和分析软件编制图16所示的结合图。与对照抗体相比，两种双特异性抗体(抗pd-l1#6-cd137#31和抗pd-l1#6-cd137#54)都能首先识别cd137，然后识别pd-l1，证明双特异性抗体可以同时靶向pd-l1和cd137。
151.综上所述，这些结果表明，根据生物传感器分析的测定，抗pd-l1-cd137双特异性抗体可同时识别pd-l1和cd137。
152.示例13
153.本示例说明在同种异体混合淋巴细胞反应中，抗pd-l1抗体和抗pd-l1-cd137 scfv双特异性抗体(bsab)可显著增强t细胞活化。
154.使用rosettesep
tm
人单核细胞富集液(目录号15068)从健康献血者的外周血中分离单核细胞，在含有人gm-csf和il-4(各1000u/ml，研发)的rpmi1640分化培养基中培养6天。使用rosettesep
tm
人cd4 t细胞富集液(目录号15062)从人外周血中分离同种异体cd4 t细胞。根据cd3和cd4表达，cd4 t细胞的纯度约为95％。在有抗体导联(1、3和10μg/ml)的情况下，将cfse标记cd4 t细胞与dc共培养3天和5天。通过流式细胞术分析cd4 t细胞增殖，并通过elisa法分析培养基中il-2和inf-γ的细胞激素产生。与采用抗pd-l1和抗cd137抗体进行的单药治疗和联合治疗相比，抗pd-l1#6-cd137#54显著增强了t细胞的活化(图17，显示了两对供体的结果)。
155.这些结果表明，与抗pdl-1和抗cd137抗体单药治疗或联合治疗以及与抗pd-l1#6-cd137#31 bsab治疗相比，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab在混合淋巴细胞反应中能够诱导更有效的t细胞活化。
156.示例14
157.本示例说明通过抗pd-l1-cd137 scfv双特异性抗体导联促进抗原特异性t细胞活化。
158.分别使用easysep
tm
人记忆cd4 t细胞富集试剂盒(stemcell，目录号19157)和人cd8 t细胞分离试剂盒(stemcell，目录号17953)，分离人记忆cd4和cd8 t细胞。在有抗体(0.4、2和10μg/ml)的情况下，用cefx ultra superstim pool mhc-ii子集(1ug/ml，jpt)刺激记忆性cd4-t细胞和自体未成熟dc的共培养，并持续7天。在与cd8-t细胞共培养时，通过向分化培养基中加入il-1β(10ng/ml，peprotech)、tnf-α(10ng/ml，peprotech)、ifn-γ(5000iu/ml，peprotech)、pge2(250ng/ml，sigma)、poly i:c(10μg/ml，sigma)和r848(5μg/ml，sigma)，将作为未成熟dc生成的tlr-dc成熟24小时。在有抗体(0.4、2和10μg/ml)的情况下，用cefx ultra superstim pool(1μg/ml，jpt)刺激cd8 t细胞和tlr-dc的共培养，并持续7天。与示例12mlr中观察到的结果类似，与使用抗pd-l1或抗cd137单克隆抗体的单药治疗或使用抗pd-l1和抗cd137单克隆抗体的联合治疗相比，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab促进了记忆性cd4 t细胞(图18，图a)和cd8 t细胞(图18，图b)的回忆应答(图18a-b)。
159.综上所述，图17(示例13)和图18(本示例)中显示的结果表明，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab显著增强了t细胞活化，与单独或联合使用抗pd-l1和抗cd137单克隆抗体治疗时可见的t细胞活化相比，t细胞活化更为稳健。此外，根据使用cd4和cd8 t细胞进行的回忆应答分析可见，在使用抗pd-l1#6-cd137#54 bsab治疗后发现，t细胞活化具有抗原依赖性。在没有理论限制的情况下，与抗pd-l1#6-cd137#31 bsab相比，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab具有更大的t细胞活化效力，这表明双特异性抗体的抗cd137#54臂可与唯一cd137表位结合，而不会由于pd-l1结合双特异性抗体的抗pd-l1臂而产生空间位阻。
160.示例15
161.本示例说明了抗pd-l1-cd137双特异性抗体诱导的靶向依赖性t细胞活化。
162.使用rosettesep
tm
人t细胞富集液(stemcell目录号15061)分离出人t细胞。用培养板结合的抗cd3(okt3，1μg/ml)使纯化t细胞活化，并在所示抗体治疗下与pd-l1过量表达或亲代hek293细胞共培养(图19)。如图19所示，与抗pd-l1和抗cd137单克隆抗体的单药治疗或联合治疗相比，抗pd-l1-cd137双特异性抗体在与pd-l1过量表达而非pd-l1阴性亲代细胞共培养时显著促进了t细胞活化。
163.综上所述，这些结果表明，在有培养板结合抗cd3(okt3)的情况下，与pd-l1过量表达hek-293细胞(而非亲代hek293细胞)共培养时，靶向依赖性t细胞活化仅由抗pd-l1#6-cd137 bsab诱导。
164.示例16
165.本示例说明了由抗肿瘤抗原特异性cd137#54双特异性抗体诱导的肿瘤抗原依赖性t细胞活化。
166.如上所述，通过阳性选择分离人cd8-t细胞(示例15)。在抗cd3(okt3)涂膜聚苯乙烯微球存在的情况下，纯化cd8-t细胞与pd-l1阳性肿瘤细胞(nci-h1975、pc-3和mda-md-231)以1:1的比例共培养。3天后，根据elisa测定的ifn-γ产生量，测定t细胞活化，并通过cytotox 细胞毒性分析(promega，目录号g1780)检测肿瘤细胞毒性。
167.与使用抗pd-l1#6和抗cd137#54抗体的单药或联合疗法相比，由抗pd-l1#6-cd137#54bsab诱导的ifn-γ产生更稳健(图20)。在与pc-3细胞共培养过程中，观察到cd8 t
细胞具有较高的肿瘤细胞毒性(图20b)。除pd-l1阳性肿瘤外，与单药或联合疗法相比，由抗her2(曲妥珠单抗或#3-7)和偶联cd137#54 scfv的抗肿瘤聚糖抗体靶向的her2阳性(skbr-3和mda-mb-361)和聚糖阳性(mcf-7和nci-n87)肿瘤细胞也产生了更强的ifn-γ产生(图21a-b和图22a-b)和cd8 t细胞的肿瘤细胞毒性(图22a)。
168.这些结果表明，肿瘤靶向cd137#54 bsab特异性诱导了靶向依赖性t细胞活化。
169.示例17
170.本示例说明抗pd-l1#6-cd137#54双特异性抗体对cd137内化的诱导。
171.为了测试cd137内化是否也由抗pd-l1#6-cd137#54双特异性抗体以及参照抗体乌瑞芦单抗和乌托鲁单抗诱导，利用cd137表达hek293细胞进行内化分析(图23)。将每孔5x103cd137表达细胞预先接种在含有10％胎牛血清(gibco)的达尔伯克改良伊格尔培养基(invitrogen)的黑色96孔板上，并在37℃、5％co2条件下培养过夜。根据制造商的方案，使用phab胺活性染料(promega corp.)标记所示抗体，然后在培养基中从100nm开始通过3倍连续稀释进行制备。然后用含有标记抗体的培养基替换预先接种细胞的培养基，细胞在培养箱中再培养24小时。培养后，冲洗细胞并将其保存在pbs中，用spectramax id3进行荧光记录。使用graphpad prism计算出ec50值。如图23所示，与参照抗cd137抗体治疗相比，在抗pd-l1#6-cd137#54双特异性抗体治疗中，观察到了更强的cd137内化诱导。在没有理论限制的情况下，如果双特异性ab仅通过cd137参与结合t细胞，则cd137的内化水平可使cd137活化减少。相应地，在体内施用双特异性抗体后，与参照抗体相比，特别是与乌瑞芦单抗相比，双特异性抗体的毒性较低。
172.示例18
173.本示例说明了通过抗pd-l1#6-cd137#54双特异性抗体拯救treg细胞介导的t细胞增殖抑制。
174.如示例12所述，利用混合淋巴细胞反应建立treg抑制试验。使用easysep
tm
人cd4

cd127
low
cd25

调节性t细胞分离试剂盒(stemcell，目录号18063)，从外周血中分离treg细胞，并使用human treg expander(gibco，目录号11129d)进行treg细胞扩增。扩增的treg细胞大大抑制了cd4 t细胞的增殖和il-2产生。通过向培养物中添加抗pd-l1#6-cd137#54 bsab，消除了treg细胞的抑制活性(图24a-b)。在有treg细胞的情况下，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab同时拯救了t细胞增殖(图24，图a)和细胞激素产生(图24，图b)。上述结果表明，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab能够拯救treg介导的t细胞活化抑制。
175.示例19
176.本示例说明体内抗pd-l1#6-cd137#54双特异性抗体对肿瘤生长的抑制。
177.为了验证抗pd-l1#6-cd137#54 bsab(其不与小鼠pd-l1和小鼠cd137发生交叉反应)的抗肿瘤活性，将人肿瘤细胞(nci-h292、nci-h1975和bxpc-3)与人pbmc预混合，并将其异种皮下移植到scid-beige小鼠，以评估体内抗癌活性。肿瘤接种后7天，每周两次腹腔注射等摩尔量的mab(m.w.150kda，1mg/kg)和bsab(m.w.195kda，1.3mg/kg)。每周测量两次肿瘤大小(mm3)，按(长
×
宽
×
宽)/2计算。在nci-h292肿瘤模型中，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab(tgi：67.5％)的肿瘤生长抑制指数(tgi)大于mpdl-3280a(tgi：44.3％)和pd-l1#6 cd137#54组合(tgi：-18.77％)(图25，图a)。同样，在nci-h1975肿瘤模型中，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab(tgi：80％)的tgi大于pd-l1#6 cd137#54的组合(tgi：67.2％)(图25，图b)。除肺癌以
外，在bxpc-3胰腺癌模型中，与联合疗法(tgi各为10mg/ml：-9.2％)相比，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab还显示出更强大的抗肿瘤活性(tgi1.3mg/kg为43％)(图25，图c)。因此，在两种不同类型的体内肿瘤模型中，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab均显示出了抗肿瘤活性。
178.综上所述，上述结果表明，在小鼠异种移植肿瘤模型中，与抗pd-l1和抗cd137抗体联合治疗相比，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab治疗对肿瘤生长的抑制作用较强。
179.示例20
180.本示例说明了体外存在双特异性抗体时的细胞激素释放。
181.来自三个供体的人pbmc与同型、抗cd3抗体(okt3，作为阳性对照)和三种双特异性抗体(抗pd-l1#6、抗her2#3-7和与cd137#54 scfv偶联的抗聚糖)在0.67、6.67和66.67nm下培养24小时。利用multiplex procartaplex immunoassay(赛默飞世尔科技公司)，对释放到培养基中的细胞激素进行检测。okt3诱导深层细胞激素释放，而三种双特异性抗体并未诱导细胞激素释放(图26)。
182.这些结果表明，与okt3相比，pd-l1#6-cd137#54、her2#3-7-cd137#54和聚糖cd137#54bsab在与人pbmc培养时不会诱导明显的细胞激素释放。
183.示例21
184.本示例说明了抗pd-l1#6-cd137#54双特异性抗体在恒河猴体内的药代动力学参数。
185.两组(每组一只雄性和一只雌性)恒河猴均采用双特异性抗pd-l1#6-cd137#54抗体(5和25mg/kg体重)经静脉推注给药。在注射后0.5、6、24、48、72和144小时几个时间点采集外周血。用elisa法测定抗体的血浆浓度。将cd137-fc融合蛋白(ap biosciences，1μg/ml)涂在maxisorp板(invitrogen)上，然后将连续稀释的血浆样本和抗pd-l1#6-cd137#54 bsab作为标准曲线。使用tmb底物，通过生物素化pd-l1-fc融合蛋白(ap biosciences)和hrp偶联链酶亲和素检测结合抗体。用插值法计算抗体血浆浓度。使用pksolver软件计算pk参数(zhang、huo、zhou和xie，2010)。在25mg/kg和5mg/kg注射组中，抗pd-l1#6-cd137#54 bsab的t
1/2
分别约为87小时和49小时(图27a-b)，实验期间未观察到alt/ast水平升高(未显示)。
186.序列
187.seq id no 1：抗cd137克隆15重链
188.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycasdlyqllfpyyygmdvwgqgttvtvss
189.seq id no 2：抗cd137克隆15轻链
190.qlvltqppsasaslgasvtltctlssgysnykvdwyqqrpgkgprfvmrvgtggivgskgdgipdrfsvlgsglnryltikniqeedesdyhcgadhgsgsnlfwvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
191.seq id no 3：抗cd137克隆15的cdr-h1
192.ggtfssy
193.seq id no 4：抗cd137克隆15的cdr-h2
194.ipilgi
195.seq id no 5：抗cd137克隆15的cdr-h3
196.dlyqllfpyyygmdv
197.seq id no 6：抗cd137克隆15的cdr-l1
198.tlssgysnykvd
199.seq id no 7：抗cd137克隆15的cdr-l2
200.vgtggivgskgd
201.seq id no 8：抗cd137克隆15的cdr-l3
202.gadhgsgsnlfwv
203.seq id no 9：抗cd137克隆31重链
204.qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardlrgafdpwgqgttvtvss
205.seq id no 10：抗cd137克隆31轻链
206.qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvgaynfvswyqqrpgkapelmiydvsdrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqtedeadyycssytssitryvfgtgtkvtvlgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
207.seq id no 11：抗cd137克隆31的cdr-h1
208.gytftgy
209.seq id no 12：抗cd137克隆31的cdr-h2
210.npnsgg
211.seq id no 13：抗cd137克隆31的cdr-h3
212.dlrgafdp
213.seq id no 14：抗cd137克隆31的cdr-l1
214.tgtssdvgaynfvs
215.seq id no 15：抗cd137克隆31的cdr-l2
216.dvsdrps
217.seq id no 16：抗cd137克隆31的cdr-l3
218.ssytssitryv
219.seq id no 17：抗cd137克隆54重链
220.qvqlvqsgaevkkpgstvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycasppyydssgyyplgafdiwgqgtmvtvss
221.seq id no 18：抗cd137克隆54轻链
222.syeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgekyaswyqqkagqspilviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisglqagdeadyycqawdgsstyvfgtgtkvtvfgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
223.seq id no 19：抗cd137克隆54的cdr-h1
224.ggtfssy
225.seq id no 20：抗cd137克隆54的cdr-h2
226.ipilgi
227.seq id no 21：抗cd137克隆54的cdr-h3
228.ppyydssgyyplgafdi
229.seq id no 22：抗cd137克隆54的cdr-l1
230.sgdklgekyas
231.seq id no 23：抗cd137克隆54的cdr-l2
232.qdskrps
233.seq id no 24：抗cd137克隆54的cdr-l3
234.qawdgsstyv
235.seq id no 25：重链中的恒定域(igg4)
236.astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
237.seq id no 26：重链中的恒定域(工程化igg1)
238.astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
239.seq id no 27：sp1
240.metdtlllwvlllwvpgstg
241.seq id no 28：gs连接子
242.ggggs
243.seq id no 29：(g4s)2连接子
244.ggggsggggs
245.seq id no 30：抗pd-l1#6轻链
246.qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsntvnwyqqlpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycatwdlslnawvvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
247.seq id no 31：抗pd-l1#6-cd137#31 bsab重链
248.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrrysiswvrqapgqglewmggiipvfgaakyaqkfqgrvtitadeftstaymelssltsedtavyycalsgdsdafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggqsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvgaynfvswyqqrpgkapelmiydvsdrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqtedeadyycssytssitryvfgtgtkvtvlggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardlrgafdpwgqgttvtvssa
249.seq id no 32：抗pd-l1#6-cd137#54 bsab重链
250.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrrysiswvrqapgqglewmggiipvfgaakyaqkfqgrvtitadeftstaymelssltsedtavyycalsgdsdafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgstvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycasppyydssgyyplgafdiwgqgtmvtvssaggggsggggsggggsggggssyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgekyaswyqqkagqspilviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisglqagdeadyycqawdgsstyvfgtgtkvtvlg
251.seq id no 33：cd137#31-scfv
252.qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvgaynfvswyqqrpgkapelmiydvsdrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqtedeadyycssytssitryvfgtgtkvtvlggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardlrgafdpwgqgttvtvssa
253.seq id no 34：cd137#54-scfv
254.qvqlvqsgaevkkpgstvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycasppyydssgyyplgafdiwgqgtmvtvssaggggsggggsggggsggggssyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgekyaswyqqkagqspilviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisglqagdeadyycqawdgsstyvfgtgtkvtvlg
255.seq id no 35：曲妥珠单抗轻链
256.diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
257.seq id no 36：曲妥珠单抗cd137#54 bsab重链
258.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgstvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycasppyydssgyyplgafdiwgqgtmvtvssaggggsggggsggggsggggssyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgekyaswyqqkagqspilviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisglqagdeadyycqawdgsstyvfgtgtkvtvlg
259.seq id no 37：抗her2#3-7轻链
260.qtvvtqepsfsvspggtvtltcglssgsvstsyypswyqqtpgqaprtliystntrssgvpdrfsgsilgnkaaltitgaqaddesdyycvlymgsgiwvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypg
avtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
261.seq id no 38：抗her2#3-7-cd137#54 bsab重链
262.evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysftsywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycarqdnwnhgpydafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgstvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycasppyydssgyyplgafdiwgqgtmvtvssaggggsggggsggggsggggssyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgekyaswyqqkagqspilviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisglqagdeadyycqawdgsstyvfgtgtkvtvlg
263.seq id no 39：抗聚糖轻链
264.eivltqspstlslspgeratlscqasedvsymhwyqqkpgqapqpwiygtsnkasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqqwsrrpftfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
265.seq id no 40：抗聚糖cd137#54 bsab重链
266.qitlqesgptlvkptqtltltctfsgfslyrfdmgvgwirqppgqglewlahiwwdddkyynpalksrltiskdtsknqvvltmtnmdpvdtatyycarvrglhdyyyyfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgstvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycasppyydssgyyplgafdiwgqgtmvtvssaggggsggggsggggsggggssyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgekyaswyqqkagqspilviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisglqagdeadyycqawdgsstyvfgtgtkvtvlg
267.seq id no 41：抗her2#3-7的cdr-h1
268.gysftsy
269.seq id no 42：抗her2#3-7的cdr-h2
270.ypgdsd
271.seq id no 43：抗her2#3-7的cdr-h3
272.qdnwnhgpydafdi
273.seq id no 44：抗her2#3-7的cdr-l1
274.glssgsvstsyyps
275.seq id no 45：抗her2#3-7的cdr-l2
276.stntrss
277.seq id no 46：抗her2#3-7的cdr-l3
278.vlymgsgiwv
279.表1.单克隆抗体定义cdr区和双特异性抗体单链可变片段(scfv)的序列。
[0280][0281]
参考文献
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[0285]
除非上下文另有明确规定，否则本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数含义。因此，例如，对“方法”的引用包括本发明所述类型的一个或多个方法和/或步骤，在阅读本公开等内容后，本领域技术人员将明确知道这些方法和/或步骤。
[0286]
在与通过引用对各出版物、专利或专利申请予以具体和单独表示的相同程度上，本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过本发明的引用成为本发明的一部分。
[0287]
除非另有规定，否则本发明中所采用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。在本发明的实践或检验中，尽管可以采用与本发明所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但可以理解的是，修改和变化都包含在本公开的精神和范围内。
[0288]
范围：在本公开中，本发明的各个方面可以用范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅出于方便和简洁起见，而不应解释为对本发明范围的不灵活限制。相应地，范围描述应视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及此范围内的各个数值。例如，从1到6等范围的描述应视为具有具体公开的子范围，如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及此范围内的单个数字，例如1、2、2.1、2.2、2.7、3、4、5、5.5、5.75、5.8、5.85、5.9、5.95、5.99和6。无论范围广度如何，此要求均适用。
[0289]
尽管已参照上述示例对本发明进行了描述，但是应当理解，须在本发明的精神和范围内包含相应的修改和变化。相应地，本发明仅受以下权利要求的限制。