一种分离来源于人类诱导多能干细胞的间充质干细胞的方法与流程

1.本发明涉及细胞工程技术领域，具体而言，涉及一种分离来源于人类诱导多能干细胞的间充质干细胞的方法。


背景技术：

2.人类诱导多能性干细胞(human ips)是从人类终末分化细胞经过体外重编程技术诱导为多能性干细胞，具有体外自我更新稳定性，并维持正常核型和发育多能性。msc(间充质干细胞)是一种多潜能干细胞，可以分化为骨组织、结缔组织的多种结构，在损伤修复和血管再生等方面有着重要的意义。而由ips分化得到的msc基于细胞来源于自体细胞，具有无免疫排斥、细胞来源充足、细胞增殖能力强、细胞活力旺盛的优势，并可能在回输后能够有更好的损伤修复，免疫调节和抗衰老的功效。
3.目前，ips分化为间充质干细胞的方法主要是通过eb(拟胚体)途径分化，即通过悬滴培养或者悬浮培养技术，是ips聚集成球状结构，该结构称为拟胚体，在拟胚体分化过程中，往往需要添加较多种类的细胞因子，并且在悬滴培养或者悬浮培养若干天后，再转入贴壁培养，此后会有间充质干细胞迁出。
4.拟胚体分化法的缺点是分化效率低，分化过程复杂，耗时长，而且需要添加较多种类的细胞因子，成本较高。因此，现有的ips分化为间充质干细胞技术存在耗时长，产量低，技术要求高，细胞纯度有限等问题，不仅制约了自体间充质干细胞的大规模培养，还限制了其产业化和市场化的需求。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种分离来源于人类诱导多能干细胞的间充质干细胞的方法。
7.本发明是这样实现的：
8.本发明提供了一种分离来源于人类诱导多能干细胞的间充质干细胞的方法，方法包括如下步骤：
9.将细胞汇合度30％-50％的ips细胞培养液进行早期中胚层细胞的诱导，早期中胚层细胞的诱导所采用的诱导培养基为stemdiff
tm-acf mesenchymal induction medium，诱导培养至ips集落内的细胞出现上皮样细胞转化为间质细胞样细胞；
10.然后将早期中胚层细胞的诱导培养的细胞培养液进行msc前体细胞的诱导，msc前体细胞的诱导培养基为complete mesencult
tm-acf medium，msc前体细胞的诱导结束后，经消化收集细胞悬液，然后用complete mesencult
tm-acf medium半换液，培养至细胞汇合度达到80％以上时进行传代培养。
11.本发明提供了一种ips单层诱导法分离间充质干细胞的方法。该方法与现有的eb法相比具有明显的技术优势，主要表现在分化过程操作简单，分化效率高且便于纯化分离，
目前已经做到在分化过程中不涉及动物血清和其它非人源添加物，因此非常适合生产满足临床需求的足够数量的自体msc细胞。本发明提供的方法分离方法简单，耗时短，有利于自体间充质干细胞的大规模培养，满足其产业化和市场化的需求。
12.选择细胞汇合度为30％-50％的ips细胞培养液进行早期中胚层细胞的诱导，具有特定的技术效果。如果细胞密度过高，则不能用于分化。因为细胞生长速度很快，细胞密度过高开始诱导后培养基会迅速偏酸，影响细胞状态。在一种可选的实施方式中，ips细胞状态要求：ips细胞呈集落状生长，集落边界清楚，集落内细胞核质比高，核仁明显。这种状态的ips细胞可以提高分化的成功率，提高最终的间充质干细胞的产量。
13.ips集落内的细胞出现上皮样细胞转化为间质细胞样细胞的形态特征包括不限于：细胞由多角形的上皮样细胞变为间质细胞样细胞，集落界限消失，细胞核质比明显减小。
14.在本发明应用较佳的实施方式中，上述细胞汇合度30％-50％的ips细胞培养液的培养基为不含rock inhibitor的人胚胎干细胞培养基。rock inhibitor(rock抑制剂)包括不限于：y-27632、chroman 1、belumosudil和fasudil hydrochloride。
15.在本发明应用较佳的实施方式中，上述早期中胚层细胞的诱导发生在早期中胚层细胞的诱导步骤开始的第0d-3d，每天采用stemdiff
tm-acf mesenchymal induction medium进行换液。
16.在本发明应用较佳的实施方式中，上述msc前体细胞的诱导发生在早期中胚层细胞的诱导步骤开始的第4d-5d，并在第5d采用complete mesencult
tm-acf medium进行换液。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，上述消化是指：在早期中胚层细胞的诱导步骤开始的第6d，将msc前体细胞的诱导培养液进行清洗、消化，消化孵育8-10min，然后加入完全培养基终止消化，经离心，用添加rock inhibitor的complete mesencult
tm-acf medium重悬细胞，接种在干细胞培养基材上，培养获得第1代细胞。
18.在一种可选的实施方式中，上述细胞消化过程中，如果消化程度不好，可用培养基冲洗培养面使细胞脱落。
19.上述消化步骤采用的消化液包括不限于：edta、accutase消化液、胰蛋白酶消化液、胰蛋白酶-edta消化液或胶原酶消化液。消化孵育的温度为37
±
0.5℃。
20.在一种可选的实施方式中，用添加rock inhibitor的complete mesencult
tm-acf medium重悬细胞后，调整细胞密度为5
×
10
3-5.5
×
103cells/cm2，进行后续的接种步骤。
21.在本发明应用较佳的实施方式中，上述将第1代细胞从早期中胚层细胞的诱导步骤开始的第7d起，每天用complete mesencult
tm-acf medium半换液，培养至细胞汇合度达到80％以上时进行传代培养。
22.在本发明应用较佳的实施方式中，上述传代培养的方法包括将待传代培养的培养基进行清洗、消化，终止消化后，经离心，用complete mesencult
tm-acf medium重悬细胞，接种在干细胞培养基材上，培养获得第2代细胞，继续传代培养至早期中胚层细胞的诱导步骤开始的第21天。
23.在一种可选的实施方式中，当培养基颜色变为桔黄色时(ph＜6.8)，即用mesencult
tm-acf medium半换液，培养基颜色变化不明显可不换液。一般至第4代细胞时，在传代前即可不换液。
24.在一种可选的实施方式中，用complete mesencult
tm-acf medium重悬细胞后，调整细胞密度为8
×
10
3-8.5
×
103cells/cm2，进行后续的接种步骤。
25.在本发明应用较佳的实施方式中，上述早期中胚层细胞的诱导步骤开始的第21天后，进行msc细胞的扩增；msc细胞的扩增包括将待扩增的细胞培养液依次进行清洗、消化、离心、重悬和培养。
26.上述清洗是采用dpbs清洗2-3次。重悬是采用含有5％hpl的α-mem培养基重悬细胞。
27.在本发明应用较佳的实施方式中，上述msc细胞的扩增后还包括细胞的定向诱导分化；
28.将msc细胞的扩增培养后的细胞定向诱导分化为成脂细胞、成骨细胞或成软骨细胞。
29.本发明还提供了一种由上述的分离来源于人类诱导多能干细胞的间充质干细胞的方法获得的间充质干细胞。
30.本发明具有以下有益效果：
31.本发明提供了一种ips单层诱导法分离间充质干细胞的方法。该方法与现有的eb法相比具有明显的技术优势，主要表现在分化过程操作简单，分化效率高且便于纯化分离，目前已经做到在分化过程中不涉及动物血清和其它非人源添加物，因此非常适合生产满足临床需求的足够数量的自体msc细胞。本发明提供的方法分离方法简单，耗时短，有利于自体间充质干细胞的大规模培养，满足其产业化和市场化的需求。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
33.图1为分步诱导过程中细胞形态学变化显微图；
34.图2为ips分化的msc形态特征显微图；
35.图3为ips分化而来的msc细胞表达阳性标记流式细胞图；
36.图4为ips分化而来的msc细胞不表达阴性标记流式细胞图；
37.图5为ips分化的msc细胞的分化能力检测的结果图。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
39.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
40.一、主要试剂：
[0041][0042]
二、试剂的配制与保存：
[0043]
试剂的配制与保存：
[0044]
1.complete mesencult
tm-acf medium:
[0045]
①
mesencult
tm-acf 5x supplement的融解：
[0046]
室温下(15-25℃)融解30分钟，边融解边轻轻晃动玻璃瓶，直至完全融解。
[0047]
②
按照10ml分装mesencult
tm-acf 5x supplement至10个15ml离心管中，-20℃保存，保存期限为2年。
[0048]
③
在50ml离心管中，吸取39.5ml mesencult
tm-acf basal medium，加入10ml mesencult
tm-acf 5x supplement，轻轻混匀后，再加入0.5ml l-glutamine(200mm)，使l-glutamine的终浓度为2mm，轻轻混匀。4℃保存，期限为2周。
[0049]
2.stemdiff
tm-acf mesenchymal induction medium:
[0050]
室温下(15-25℃)融解30分钟，边融解边轻轻晃动玻璃瓶，直至完全融解。
[0051]
3.animal component-free cell attachment substrate
[0052]
animal component-free cell attachment substrate铺板的方法：1:300稀释animal component-free cell attachment substrate，稀释液用dpbs。1个六孔板的孔用1ml稀释后的animal component-free cell attachment substrate，铺板后在室温下放置至少2小时后使用。使用前，吸掉铺板液，用2ml dpbs洗一遍后接种细胞。
[0053]
实施例1
[0054]
本实施例提供了一种分离来源于人类诱导多能干细胞的间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：
[0055]
1.诱导前细胞的准备
[0056]
①
培养板的处理(-2d)
[0057]
培养板用matrigel(基底胶)室温孵育30分钟以上。
[0058]
②
细胞消化和接种(-2d)
[0059]
t25瓶中培养的ips(ips细胞系本公司分离构建的细胞系)弃培养基，dpbs洗两遍，每次1min；加入0.5mm edta消化液2ml；37℃孵育5min后，弃edta，加入e8完全培养基终止消化；收集细胞悬液，细胞计数；根据细胞密度和需要细胞量取不同量细胞悬液，800转/分离心5min；用添加rock inhibitor(y-27632)的e8完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为接种后5
×
104cells/cm2，以保证第二天细胞汇合度达到30％至50％。接种于6孔板中，放置回培养箱培养24小时。
[0060]
③
换液(-1d)
[0061]
24小时后，轻轻吸取培养孔中的培养液，用不含rock inhibitor的e8培养基等体积换液。放置回培养箱培养24小时。
[0062]
2.早期中胚层细胞的诱导(0-3d)
[0063]
24小时后，轻轻吸取培养孔中的培养液，每孔用3ml dpbs轻轻洗培养孔一次。每孔添加3ml stemdiff
tm-acf mesenchymal induction medium，放置回培养箱培养4天，每天每孔用3ml stemdiff
tm-acf mesenchymal induction medium换液。
[0064]
3.msc细胞的诱导
[0065]
在诱导的第4天，轻轻吸取培养孔中的培养液，每孔用1ml dpbs轻轻洗培养孔一次。每孔添加2ml mesencult
tm-acf medium，放置回培养箱培养1天。
[0066]
在诱导的第5天，轻轻吸取培养孔中的培养液，每孔添加2ml mesencult
tm-acf medium，放置回培养箱培养1天。
[0067]
在诱导的第6天，轻轻吸取培养孔中的培养基，dpbs洗两遍，每次1min；加入0.5mm edta消化液2ml；37℃孵育8-10min后，弃edta，加入2ml mesencult
tm-acf medium终止消化；收集细胞悬液至15ml离心管中；再用1ml mesencult
tm-acf medium轻轻清洗原培养孔，并一起收集至15ml离心管中。800转/分离心5min；用添加rock inhibitor的mesencult
tm-acf medium重悬细胞，调整细胞密度为接种后1.5-10
×
103cells/cm2。接种于attachment substrate处理的6孔板中，每孔2ml添加rock inhibitor的mesencult
tm-acf medium，放置回培养箱培养，此为第1代细胞记为p1。
[0068]
从第7天起，每天观察细胞并用mesencult
tm-acf medium半换液，当细胞汇合度达到80％时即进行传代培养。
[0069]
当细胞汇合度达到80％时，轻轻吸取培养孔中的培养基，dpbs洗两遍，每次1min；加入4倍稀释的accutase消化液0.5ml；37℃孵育8min后，加入1ml mesencult
tm-acf medium终止消化；收集细胞悬液至15ml离心管中；再用1ml mesencult
tm-acf medium轻轻清洗原培养孔，并一起收集至15ml离心管中。800转/分离心5min；用mesencult
tm-acf medium重悬细胞，调整细胞密度为接种后3-8
×
103cells/cm2。接种于attachment substrate处理的6孔板中，每孔2ml mesencult
tm-acf medium，放置回培养箱培养，此为第2代细胞记为p2。每天观察细胞，当培养基颜色变为桔黄色时(ph＜6.8)，即用mesencult
tm-acf medium半换液。当细胞汇合度达到80％时即进行传代培养。传代方法与p1至p2传代方法一致。直至分化的第21天。
[0070]
4.ips分化的msc的扩增
[0071]
在分化21天后，细胞汇合度达到80％以上，轻轻吸取培养孔中的培养基，dpbs洗两遍，每次1min；加入4倍稀释的accutase消化液0.5ml；37℃孵育8min后，加入含有5％hpl的α-mem培养基终止消化；收集细胞悬液至15ml离心管中；800转/分离心5min；用含有5％hpl的α-mem培养基重悬细胞，六孔板每孔接种至一个t25瓶中。此后，即可按常规的msc培养方法培养，扩增和冻存。
[0072]
实验例1
[0073]
分步诱导过程中细胞形态学变化。
[0074]
如图1所示，当培养液换为stemdiff
tm-acf mesenchymal induction medium后的
第1天，即诱导的第1天时，细胞虽仍呈集落状，但已失去ips集落的典型形态特征，集落不再是封闭的，集落边界开始不明显，集落内细胞变长，核质比明显下降，这是典型的上皮间质转化的形态特征(图1，a,b)。在诱导的前6天，细胞增殖明显。诱导的第6天，细胞长满培养面，并且细胞彼此紧密排列(图1，c，d)。此时进行细胞传代，得到的p1代细胞已经具有msc细胞的形态特征，即细胞呈梭形，核质比低(图1，e,f)。当p1代细胞汇合度达80％时进行第二次传代，得到p2代细胞，细胞形态仍呈典型的msc细胞形态特征(图1,g,h)。
[0075]
ips分化的msc形态特征
[0076]
诱导21天后，如图2中a显示，p5代细胞全部呈典型的msc细胞形态(图2a)，将此细胞在含有5％hpl的α-mem培养基中继续传代三次，即p8代时(图2,b)，可见细胞形态特征与脐带来源的msc细胞无明显差异。
[0077]
实验例2
[0078]
本实验例进行ips分化的msc的流式细胞仪检测。
[0079]
①
细胞消化
[0080]
用移液器移去细胞培养液，加入无钙镁pbs，轻轻晃动培养瓶，弃无钙镁pbs，重复上述过程一次；后加入4倍稀释的accutase，37℃放置，显微镜下观察细胞消化情况；当细胞大部分脱壁时，轻拍培养皿，收集细胞悬液至50ml离心管中。
[0081]
②
单细胞悬液制备
[0082]
30μm孔径筛网过滤上述50ml离心管中细胞悬液至新的50ml离心管，300g
×
5min收集细胞，弃去上清液。
[0083]
③
细胞固定
[0084]
收集的细胞用10ml无钙镁pbs重悬混匀，并取样50ul进行细胞计数，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；再用10ml无钙镁pbs重悬混匀，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；加入1ml 4％多聚甲醛溶液，室温固定30min。
[0085]
④
封闭
[0086]
固定后的细胞300g
×
5min离心，弃上清，用1ml无钙镁pbs重悬混匀，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；再用1ml无钙镁pbs重悬混匀，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；第三次用1ml无钙镁pbs重悬混匀，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；加入1ml 1％bsa封闭液室温封闭30min。
[0087]
⑤
荧光染色
[0088]
封闭后的细胞300g
×
5min离心，弃上清，加入0.7ml无钙镁pbs重悬细胞，轻轻吹打混匀，分装至7个1.5ml ep管中，留1个做对照，其余6个分别按比例加入抗体，4℃冰箱避光孵育30分钟，300g
×
5min离心，弃上清；用1ml无钙镁pbs重悬混匀，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；再用1ml无钙镁pbs重悬混匀，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；第三次用1ml无钙镁pbs重悬混匀，300g
×
5min洗涤一次，弃上清；加入200ul无钙镁pbs，轻轻吹打混匀后转移至流式细胞仪管，用于流式细胞仪检测。
[0089]
三轮试验中均是利用p8代细胞做msc表面标记物的流式检测。结果如图3所示，由ips分化而来的msc细胞表达阳性标记cd90(第一轮阳性率为97.5％；第二轮阳性率为98.4％，第三轮阳性率为78.2％)，表达阳性标记cd105(第一轮阳性率为98.3％；第二轮阳性率为93.1％，第三轮阳性率为95.5％)。
[0090]
如图4所示，由ips分化而来的msc细胞不表达阴性标记cd34(第一轮阳性率为2.73％；第二轮阳性率为8.68％，第三轮阳性率为5.34％)，不表达阴性标记cd45(第一轮阳性率为0.264％；第二轮阳性率为1.77％，第三轮阳性率为4.25％)。
[0091]
实验例3
[0092]
本实验例进行ips分化的msc的多能性检测。ips分化的msc的成骨分化，成软骨分化和成脂分化方法均采用通行方法，此处不再赘述。
[0093]
三轮ips分化的msc细胞在含有5％hpl的α-mem培养基(本公司msc常规培养基)中扩增后，分别进行成骨分化试验，成软骨分化试验和成脂分化试验。结果如图5所示，ips分化的msc细胞成骨分化28天后，茜素红染色，可见明显的红色着色的钙化结节，说明msc细胞分化为成骨细胞(图5)；ips分化的msc细胞成软骨分化14天后，经酸化处理，阿新蓝染色，可见软骨骨质呈蓝色，说明msc细胞分化为成软骨细胞(图5)；ips分化的msc细胞成脂分化14天后，油红-o染色，可见红色脂滴呈颗粒状分布于细胞质中，说明msc细胞分化为脂肪细胞(图5)。因此，由ips分化的msc细胞经过扩增后仍具有分化为成骨，成软骨和成脂分化的能力。
[0094]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。