一种制备富含古洛糖醛酸的褐藻四糖的方法

1.本发明涉及从海洋生物中制备能够用于生物医药的褐藻四糖，即一种制备富含古洛糖醛酸的褐藻四糖的方法；属于海洋生物资源海藻多糖制备技术领域。


背景技术：

2.褐藻胶是从海藻中提取的一类由甘露糖醛酸(m)和古洛糖醛酸(g)两种互为差向异构体的糖单元通过β-1,4糖苷键连接而成的多糖。其降解产物褐藻寡糖具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、免疫调节等多种不同的生物学活性在创新海洋药物及特医性食品等领域具有广阔的应用前景。
3.大量研究发现褐藻寡糖的活性与其结构组成直接相关，例如聚合度为5的褐藻寡糖在增强巨噬细胞抗菌活性和促进骨肿瘤病人恢复方面要优于其他聚合度的褐藻寡糖。但如何高效地制备出结构明确、聚合度单一的褐藻寡糖仍是一个难题，导致目前市场上供应的褐藻寡糖种类少且价格高，不利于褐藻寡糖产业链的快速发展。比如按照实验推算褐藻寡糖的推荐日剂量为10mg/天/人，然而d-甘露糖醛酸五糖每10mg的价格是650元，如此高的价格大大限制了均一性褐藻寡糖在医药等领域的广泛应用。
4.目前，均一性寡糖制备成本高的主要原因是过程繁琐、重复性差、产物难以纯化。而酶解法制备褐藻寡糖不仅催化效率高、反应条件温和环境友好，并且具有特异性高的优点，是未来均一性褐藻寡糖产业化发展的重要方法。因此迫切需要深入研究可用于均一性寡糖制备的褐藻胶修饰酶。褐藻寡糖的均一性涉及到化学组成和聚合度两个方面。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种制备富含古洛糖醛酸的褐藻四糖的方法，能够制备高纯度的褐藻四糖。
6.本发明提供一种褐藻胶裂解酶，所提供的褐藻胶裂解酶包含：
7.1)氨基酸序列为seq id no:1的蛋白酶；
8.mkfkslfcfilvcsflllglagcgsssptneatsvddetqmaqgnepvtsdlaedepyqwinfdfsspitlsavhisfydgdedaiyfrfessndnknwsthlntvnstsklefetfnldenvtaryfrlaslgtsnnnqtsiaevtfsatneqdtfaipglveaedysafydstagnqggeyrdddvdieqtsditgnynidfitdgewlaypinvgsggeynaklrvssangggsiiiyvddlekgrlavpattqwetkniqlgvlssgehtlkvlftagefelnwielsratlkastldpnlppsgnfdlsqwylgapiddnadgksdsisesqlaagyehpqwfytaddgamvfkveidapktstntsysrselremlragdtsistqginknnwvfstyssddknaaggidgeltatlkvdyvtttgessqvgrviigqihakddeparlyyrklkdnskgsiylahepnggndqlynmigtssstavdpvdgielgeiftysikvtgntllvtimrdgkpdvtqsvdmsnsgyhtgydqymyfkagvynqnntgdpsdyvqasfyrlftshn；
9.2)在1)中取代、缺失、添加一个或数个氨基酸，由1)衍生的，具有1)中酶解效果的蛋白酶；
10.编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其一种具体的序列为seq id no:2；
11.atgaagtttaaatcattgttttgttttatcttagtttgtagttttttgctgttagggctagcaggctgtggctcatcatcaccaactaatgaggctacttcagtagatgatgaaacgcagatggcacaaggtaacgaacctgtaacaagtgacttagcagaggatgaaccttatcaatggattaactttgatttttcatcgcctattacactaagtgctgtgcatatttcattttatgacggtgacgaggatgcaatttattttagattcgagtcatctaatgacaataaaaattggtctacccatctgaatacagttaattcaacgagtaagctcgaatttgaaacattcaacttagatgaaaatgtaactgctcgttattttagattagccagcttgggtacttcgaataacaatcaaacaagcatagcggaagttacatttagcgcaaccaatgagcaagacacttttgctatacctgggttagttgaggctgaagattatagcgctttttatgactcaactgctgggaatcaaggtggggaataccgcgatgatgatgttgatatagagcagacgtctgatatcacaggaaactataacatagattttattaccgatggagagtggttagcgtatcctattaacgtgggcagtggtggtgagtataatgcgaagctgcgtgtttcttctgctaatggcggtggttcaattattatttatgttgatgacctagaaaaaggtcgcttagcagtaccagcaacaacacaatgggaaactaaaaatattcaattaggtgtattgtcatccggtgagcatacgctcaaggttttatttacagctggtgaatttgaacttaattggattgagttatctagggctactttaaaagcatcgacgttagatccgaatttgccaccttcgggtaattttgatttgtctcagtggtatttaggcgcacccattgatgacaatgctgatggtaagtctgattctatctcagaatctcagctagcagctggttatgagcatcctcaatggttttatactgcagatgatggggcaatggtttttaaggttgagattgatgctccaaagacatcaactaacacaagctatagccgtagtgaactacgcgaaatgcttagagcgggtgatacgagtatcagcacgcaggggataaacaaaaataactgggtattttctacctattcgtcggatgataaaaatgcagctggtggcattgacggtgaattaacagcgacacttaaagttgattacgtaactacaactggtgaaagctctcaggttggacgcgttattattgggcaaattcatgcaaaagacgatgaaccagcgcgtctgtattaccgtaaattaaaagacaacagcaaaggctcaatttacctagctcatgaacctaatggtggaaatgatcagctttataacatgatcggcacaagtagtagcacagcagttgatcctgttgatggtattgaacttggtgaaatctttacttattccataaaagtaactggaaataccttgttggttactattatgcgtgatggtaagcctgatgtaactcaatcagttgatatgagcaatagcgggtatcataccggctatgatcaatatatgtattttaaagcaggtgtatataatcaaaataatactggtgatccaagtgattatgtacaagcctcattctatcgcttatttacttcacataattaa。
12.本发明还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体中插入有用于编码上述褐藻胶裂解酶基因的核酸片段；
13.本发明还提供重组工程菌株，所述的重组工程菌株中包含有上述的重组表达载体。
14.本发明还提供上述的褐藻胶裂解酶在制备褐藻四糖中的应用。
15.本发明还提供一种制备褐藻四糖的方法，是先使用褐藻胶异构酶来使褐藻胶中甘露糖醛酸(m)异构化为古洛糖醛酸(g)；再用上述的褐藻胶裂解酶来催化制备褐藻四糖；
16.所述的异构酶，作为本发明实施例的具体记载，其为褐藻胶异构酶alge4和/或alge6；
17.其中alge4、alge6的氨基酸序列分别为seq id no:3和seq id no:4。
18.mdynvkdfgalgdgvsddrasiqaaidaayaagggtvylpageyrvsaagepgdgclmlkdgvylagagmgetviklidgsdqkitgmvrsaygeetsnfgmrdltldgnrdntsgkvdgwfngyipggdgadrdvtiervevremsgygfdpheqtinltirdsvahdngldgfvadylvdsvfennvayandrhgfnvvtsthdfvmtnnvaygngssglvvqrgledlalpsnilidggayydnaregvllkmtsditlqnadihgngssgvrvygaqdvqildnqihdnaqaaavpevllqsfddtagasgtyyttlntriegntisgsanstygiqerndgtdysslidndiagvqqpiqlygphstvsgepgatpqqpstgsdgeplvggdtddqlqggsgadrldggagddildggagrdrlsggagadtfvfsaredsyr
tdtavfndlildfeasedridlsalgfsglgdgyggtlllktnaegtrtylksfeadaegrrfevaldgdhtgdlsaanvvfaatgtttelevlgdsgtqagaiv(seq id no:3)；
19.mdynvkdfgalgdgvsddrvaiqaaidaahaagggtvylppgeyrvsaagepsdgcltlrdnvylagagmgqtviklvdgsaqkitgivrspfgeetsnfgmrdltldgnrantvdkvdgwfngyapgqpgadrnvtiervevremsgygfdpheqtinlvlrdsvahhngldgfvadyqiggtfennvayandrhgfnivtstndfvmrnnvaygnggnglvvqrgsenlahpenilidggsyydnglegvlvkmsnnvtvqnadihgngssgvrvygaqgvqilgnqihdnaktavapevllqsyddtlgvsgnyyttlntrvegntitgsanstygvqerndgtdfsslvgntingvqeaahlygpnstvsgtvsappqgtdgndvligsdvgeqisggagddrldggagddlldggagrdrltgglgadtfrfalredshrsplgtfsdlildfdpsqdkidvsalgfiglgngyagtlavslsadglrtylksydadaqgrsfelaldgnhaatlsagnivfaaatpvdpsaeaqpivgsdlddqlhgtllgeeisggggadqlygygggdlldggagrdrltggegadtfrfalredshrsaagtfsdlildfdptqdkldvsalgftglgngyagtlavsvsddgtrtylksyetdaegrsfevslqgnhaaalsadnilfatpvpvdpgvegtpvvgsdlddelhgtlgseqilggggadqlygyagndlldggagrdklsggegadtfrfalredshrsplgtfgdrildfdpsqdridvsalgfsglgngyagslavsvsddgtrtylksyeadaqglsfevalegdhaaalsadnivfaatdaaaagelgvigasgqpddpav(seq id no:4)。
20.本发明在筛选获得了一种新型的褐藻胶裂解酶的基础上，建立了一种制备发明富含古洛糖醛酸的褐藻四糖的方法，所制备的褐藻四糖结构明确，组成稳定；具有在医药等领域应用的前景。
附图说明
21.图1：褐藻胶裂解酶alypc1结构域示意图；
22.图2：alypc1多序列比对图，其中pa1167,来自于pseudomonas aeruginosa pao1(aag04556.1)；a1
‑ⅱ’
来自于sphingomonas sp.a1(bad16656.1)；alya来自klebsiella pneumoniae(aaa25049.1)；alyq来自于persicobacter sp.ccb-qb2(wp_053404615.1)；algat5、alyb来自于vibrio spendidus ou02；
23.图3：alypc1基因pcr扩增结果图，其中泳道m：2000bp dna marker；泳道1：扩增的alypc1基因片段。
24.图4：alypc1蛋白纯化结果图，其中泳道m：蛋白marker；泳道1：经iptg诱导后菌体；泳道2：alypc1超声后上清；泳道3：蛋白酶酶切后的alypc1；
25.图5：alypc1对不同底物降解过程图；
26.图6：alye4、alye6纯化后电泳图，其中泳道1：pgex-6p-1-alge4；泳道2：pgex-6p-1-alge6；
27.图7：alypc1与al-e1反应tlc以及hplc分析图，其中图a中m为分子量已知的aos(dp2,dp3)；1为tlc分析alypc1与al-e1反应产物；图b为hplc分析alypc1与al-e1反应产物图；
28.图8：tlc(a)以及hplc(b)分析凝胶过滤样品组成图。
具体实施方式
29.本发明筛选获得了一种新型的褐藻胶裂解酶，能够特异性裂解富含g的褐藻胶，产生褐藻四糖。其具体的氨基酸序列为seq id no:1。但本领域的普通技术人员能够通过在
seq id no:1的氨基酸上通过取代、缺失、添加一个或数个氨基来获得也具有将甘露糖醛酸(m)异构化为古洛糖醛酸(g)功效的衍生蛋白。
30.编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其一种具体的核苷酸序列为seq id no:2；但还可以是其它编码上述蛋白的具体序列。
31.本发明还提供一种制备富含古洛糖醛酸的褐藻多糖的方法，是将褐藻胶先用藻胶异构酶进行异构化，再用本发明所筛选获得的褐藻胶裂解酶进行处理，酶解产物可通过常规的褐藻寡糖纯化方法，例如胶层析技术来进行纯化，从而制备获得富含古洛糖醛酸g的褐藻四糖。
32.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
33.实施例1：新型褐藻胶裂解酶alypc1的筛选及重组表达
34.1、褐藻胶裂解酶alypc1的序列及相关分析
35.发明人筛选获得了一个新型褐藻胶裂解酶alypc1,其具有优先识别polyg(多聚古洛糖醛酸)的功效，其产物分布中四糖含量在特定时间含量很高(》50％)。
36.本发明所提供的新型的褐藻胶裂解酶基因，命名为alypc1。alypc1的cdna有1737bp(seq id no:2)，编码578个氨基酸(seq id no:1)。
37.经过signalp5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.signalp-5.0)预测alypc1的信号肽，其中alypc1前22个氨基酸为信号肽。将去掉信号肽的氨基酸序列在smart(letunic,khedkar,&bork,2021)以及pram(mistry et al.,2021)中进行结构域的预测，如图1所示，alypc1由3个结构域构成，包括两个非催化结构域以及一个催化结构域，两个非催化结构域分别是f5_f8_type_c以及cbm6,催化区为pl7家族的褐藻胶裂解酶。
38.将alypc1催化结构域与已有晶体结构的褐藻胶裂解酶进行多序列比对，如图2所示，alypc1催化区与alya的同源性仅为58.5％。蛋白序列ncbi blast结果表明同源性最高的为69％，说明本发明的褐藻胶裂解酶alypc1是一种新型的褐藻胶裂解酶。
39.2、alypc1酶的制备与活性研究
40.1)alypc1原核表达系统的构建以及蛋白纯化
41.以pseudoalteromonas sp.为模板克隆alypc1，扩增引物中分别引入了酶切位点bamh
ꢀⅰ
以及xho
ꢀⅰ
，序列如表1所示。首先克隆alypc1片段，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，克隆正确的片段经过胶回收获得纯度较高的pcr产物。同时提取质粒pet32a，将质粒以及纯化的pcr产物利用bamhⅰ以及xhoⅰ限制性酶进行酶切，酶切体系如表2a、表2b所示，在37℃下反应20h，酶切后按照纯化试剂盒说明书对酶切片段进行纯化，利用t4连接酶将线性pet32a质粒与酶切片段连接，将其转化至e.coli.bl21(de3)，挑取单克隆菌株，进行测序分析并于-80℃冰箱保存菌株。
42.表1：alypc1克隆引物表
[0043][0044]
注：引物f以及r中分别带有bamhⅰ以及xhoⅰ酶切位点
[0045]
表2a：alypc1酶切体系表
[0046][0047]
表2b:质粒pet32a酶切体系表
[0048][0049][0050]
将测序正确的菌株经过活化后扩大培养，将活化的菌株按照1％的接种量接种于含有1l液体lb培养基的锥形瓶中，在37℃条件下培养约1.5h，测定培养液在od
600
的吸收值，待od
600
值为0.6-0.8时向培养基中加入400μl的iptg(终浓度为0.1mm)。在16℃，180rpm培养20h。在4℃条件下3500g离心30min收集菌体。使用15ml的缓冲液(20mm tris-hcl，500mm nacl，10mm咪唑)重悬菌体，使用超声破碎仪破碎菌体，随后12000g离心30min，收集上清液。将上清液与平衡好的ni-nta琼脂糖凝胶柱子混合，在4℃结合约1h，用结合缓冲液冲洗柱子，用考马斯亮蓝检测流出的杂蛋白，至无杂蛋白流出，冲洗结束，使用蛋白酶对alypc1上的标签进行酶切，按照目的蛋白与蛋白酶100：1的比例加入蛋白酶，在4℃进行酶切4h，酶切结束后目标蛋白随缓冲液流出，纯化的各步骤均取样进行sds-psge电泳检测。如图4所示，经过ni-nta琼脂糖凝胶纯化后可以获得纯度较高的alypc1蛋白(图4第3泳道表现为单一条带)，分子量为61kda，与预测分子量相符。
[0051]
实施例2：alypc1蛋白酶的底物特异性研究
[0052]
将poly m和poly g两种底物溶解在20mm tris-hcl(ph8.5)200mm nacl中(底物浓度是2mg/ml)，在200μl的反应体系中进行反应，其中含有190μl的底物以及10μl(0.02mg/ml)酶alypc1，在30℃条件下，在96孔板中使用酶标仪(synergy-h1,bio-tek)检测反应在235nm的变化。
[0053]
结果如图5所示，结果表明本发明筛选获得的新型褐藻胶裂解酶alycp1能特异性的降解ployg底物，对polym底物在该实验条件下未检测到降解活性。说明该酶具有很强的底物识别特异性，可以进一步提高降解产物中g的含量。
[0054]
实施例3：制备富含古洛糖醛酸的褐藻四糖
[0055]
一、异构酶法制备polyg
[0056]
褐藻胶异构酶又称为甘露糖醛酸c-5差向异构酶，是一种具有催化β-d-(1,4)-甘露糖醛酸通过异构化转化为α-l-(1,4)-古洛糖醛酸的酶。
[0057]
使用褐藻胶异构酶alg e4(seq id no:3)和alg e6(seq id no:4),并选择海洋巨藻来源的底物，配合两种异构酶获得了高古洛糖醛酸g含量的褐藻胶样品。
[0058]
1、alge4、alge6重组表达
[0059]
alge4(1662bp)、alge6(2625bp)由上海生工生物工程有限公司合成，与载体puc57构建质粒，根据片段两端bamh i、xho i限制性酶切位点进行酶切，并与表达载体pgex-6p-1，转化e.coli bl21(de3)，构建原核表达载体。
[0060]
正向引物alge4 bamh i：cgggatccatggattacaacgtcaaggatttcg、
[0061]
反向引物alge4 xho i：ccctcgagctagacgatcgccccggcctg、
[0062]
正向引物alge6 bamh i：cgggatccatggattacaacgtcaaggatttcg、
[0063]
反向引物alge6 xho i：ccctcgagtcagacggccggatcgtccg。
[0064]
2、alge4、alge6的纯化
[0065]
0.5l lb液体培养基，1％接菌量，37℃培养至od
600
达到0.4-0.6时，在培养基中加入iptg至终浓度为0.2mm，16℃诱导表达过夜。4℃，3000g离心30min收集菌体，使用1x pbs缓冲液重悬菌体，于冰水浴环境下进行超声破碎15min(超声2s，间隔4s，50％功率)，破碎后的混合液在4℃，12 000g条件下离心30min，收集上清液。
[0066]
运用亲和层析、柱上酶切的方法对目的蛋白进行纯化。取适量gst-sepharose 4b凝胶填料加入层析柱中，1x pbs缓冲液平衡柱子，将超声后上清与凝胶填料于4℃环境中充分结合。结合完成后，将未与凝胶填料结合的蛋白流出，加入40倍填料体积的1
×
pbs缓冲液洗涤凝胶填料，去除剩余的未与凝胶填料结合的蛋白和杂蛋白。在凝胶填料中加入适量1
×
pbs缓冲液与prescission酶(酶与目的蛋白质量比约为1:80)，在4℃的条件下进行柱上酶切3h。待酶切反应完成后，收集流出液，即得到纯化后的目的蛋白，结果如图6所示。其中pgex-6p-1-alge4蛋白大小约为84kda,pgex-6p-1-alge6蛋白大小约为116kda。从图6中可以看出，经prescission蛋白酶酶切后，在预期目的蛋白大小处获得了特异性条带。
[0067]
3、异构化反应
[0068]
反应缓冲液为20mm tris-hcl，20mm nacl，ph 7.5，底物为1％(m/v)褐藻胶10ml，加入预先添加ca2 冰上孵育30min的1.5ml alge4(0.23mg/ml)和0.5ml alge6(0.94mg/ml)，反应体系ca2 终浓度为1mm，在37℃，120rpm条件下进行反应，并于21h补加0.9ml alge4和0.2ml alge6，于45h补加0.6ml alge4和0.2ml alge6(alge4浓度为0.23mg/ml，alge6浓度为0.94mg/ml)。取不同反应时间的产物于100℃加热5min终止反应，以检测反应过程中的异构效果。将反应后的褐藻胶样品于12000g离心10min后，室温下透析2.5～3h，透析外液为去离子水，透析结束后将样品冻干。
[0069]
4、异构化效率的检测
[0070]
将异构化反应前后的褐藻胶样品，分别制备为20ml的1mg/ml褐藻胶水溶液。将两份褐藻胶溶液分别用hcl(1mol/l,0.1mol/l)调ph为5.6，将其置于100℃水浴中反应1h；之后用hcl(1mol/l,0.1mol/l)调ph为3.8，将其置于100℃水浴中反应30min；接着再用naoh(1mol/l,0.1mol/l)调ph为7～8后，将所得样品溶液冻干(48h)；冻干样品再用99.9％的d2o
(1ml)溶解后，溶液再次冷冻干燥(约20h)。取所得冻干样品粉末10mg，用d2o(1ml)溶清，再加入事先配制的ttha(三乙基四胺六乙酸，在d2o中按0.3mol/l的浓度配制，并用dcl或naod调节ph值至5～5.5，溶清。)溶液。在bruker avance iii 400核磁共振波谱仪上进行检测。测试温度353k。
[0071]1h-nmr数据计算(具体数据计算方法参照中华人民共和国医药行业标准《yy/t 1654-2019组织工程医疗器械产品海藻酸钠》)结果，异构化反应前褐藻胶样品中g的含量是m含量的2.3倍；而经过异构化反应后，褐藻胶样品中g的含量是m含量的4.8倍，g的含量有明显升高，说明异构化反应使褐藻胶中部分m转化为g，异构化反应有显著效果。
[0072]
二、褐藻四糖的制备与表征
[0073]
1、酶解制备褐藻四糖
[0074]
100mg的异构化后的褐藻胶溶液溶解于4ml的去离子水中，加入浓度为1.9mg/ml的alypc1蛋白酶进行30min反应。反应结束分别利用tlc以及hplc法对于降解产物进行分析。
[0075]
1)tlc检测：取合适大小的硅胶板，将样品均匀点样至距离硅胶板下端1.5cm处，随后硅胶板放置于盛有展开剂(展开剂为正丁醇，甲酸，水按照4:6:1(v:v:v)加入)的层析杠中，待层析液展开至距离硅胶板最上端1cm处，取出硅胶板，待样品吹干后，将硅胶板放置于显色剂中显色10s，显色剂中含有二苯胺(2g)，苯胺(2ml)，丙酮(100ml),磷酸(10ml),浓盐酸(1ml)，在高温下(》100℃)烘烤10min，观察产物分布。
[0076]
2)hplc检测
[0077]
将ymc-pack ods-am 150x 4.6mmi.d.柱连接到ultimate 3000系统中，洗脱缓冲液为5nm的四丁基溴化铵(tbab)(a)和乙腈(b)，流速为1ml/min，样品经过醇沉后过滤有机滤膜(0.22μm),取5μl上样，洗脱从20％b的等梯度洗脱5min开始，然后从20％到45％b的13min梯度洗脱样品。然后在7min内使用55％b的梯度清洗柱上的剩余化合物，然后用90％b洗脱5min。
[0078]
结果：综合tlc和hplc检测的结果，发现酶解产物是以dp4为主的褐藻寡糖的混合物，其中dp4的比例约为50％(图7)。
[0079]
2、褐藻四糖样品纯化
[0080]
将bio-gel p-2gel柱(柱体积是500ml)与atka pure蛋白纯化仪连接，使用0.2m nh4hco3作为流动性去分离纯化酶解产物，流速为0.7ml/min，通过检测235nm处的吸收值收集洗脱峰。纯化后样品的tlc和hplc分析，可以获得纯度＞95％的aos。
[0081]
3、nmr测试与数据分析
[0082]
将所得四糖样品溶液冻干，之后用d2o溶解样品，在bruker avance iii 400核磁共振波谱仪上进行检测。测试温度为353k。
[0083]1h-nmr数据计算结果显示，所得褐藻四糖中，与δ(δ表示α-l-古洛糖醛酸或β-d-甘露糖醛酸的4,5位因裂解酶酶解而发生β-消除，生成4,5位为共轭双键的不饱和单糖)相连单糖的古洛糖醛酸g的含量是甘露糖醛酸m含量的8倍；还原端单糖中古洛糖醛酸g的含量是甘露糖醛酸m含量的13.5倍；这说明酶解后寡糖中古洛糖醛酸g的含量较所使用的异构化褐藻胶中古洛糖醛酸g的含量又有明显上升，结果表明本发明的新型褐藻胶裂解酶alypc1在高古洛糖醛酸g含量褐藻四糖制备中具有重要应用开发前景。