一株植物乳杆菌及其产品和应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株植物乳杆菌及其产品和应用。


背景技术：

2.提升肉牛养殖效率及健康水平是当下肉牛产业面临的重要课题。为了达到促生长、提高出肉率、追求效益等目的，养殖者不惜挺而走险，滥用激素、药物、瘦肉精等违禁添加剂，严重制约了产业健康发展。因此亟待开发行之有效的肉牛饲料添加剂新产品，用以提高肉牛养殖效率、品质及健康水平。随着现代生物技术的快速发展，微生态类饲料添加剂产品的开发备受瞩目，因其能够调整和优化消化道菌群平衡，减少粪便的污染，提高饲料消化率和转化率，改善动物免疫机能，降低发病率及死亡率，改善畜产品质量等优势，为畜牧业的健康发展提供了有力的保障。开发肉牛育肥专用微生态制剂对推动肉牛产业朝着优质、高效、安全方向快速发展具有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一株植物乳杆菌及其产品和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的植物乳杆菌可以促进肉牛的生长，提高养分表观消化率、血液抗氧化水平以及瘤胃蛋白酶活性。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明提供一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)z-11，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20211493，保藏日期为2021年11月29日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
6.本发明还提供一种微生态制剂，含有上述的植物乳杆菌。
7.本发明还提供上述植物乳杆菌或上述微生态制剂在肉牛养殖中的应用。
8.进一步地，所述应用为促进肉牛的生长。
9.进一步地，所述应用为提高养分表观消化率。
10.进一步地，所述应用为提高肉牛的血液抗氧化水平。
11.进一步地，所述应用为提高肉牛的瘤胃蛋白酶活性。
12.本发明还提供上述的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)将上述的植物乳杆菌进行发酵培养获得发酵液，发酵液再经离心，收集菌体1；
14.(2)所述菌体1用无菌生理盐水重悬，洗涤，最后离心获得菌体2；
15.(3)所述菌体2用保护剂重悬，之后冷冻干燥，获得所述微生态制剂；
16.所述保护剂按重量份计包括：脱脂牛奶8份、海藻糖1份、谷氨酸钠1.5份和蒸馏水100份。
17.进一步地，所述保护剂与所述菌体2的体积比为1～5:1。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明从吉林省农业科学院工农五号紫花苜蓿地中苜蓿草中分离，并经过实验室
筛选，得到了一株可以耐受动物体内的酸环境和胆盐环境的植物乳杆菌。经过应用试验证实，该菌株具有促进肉牛的生长的作用，提高养分表观消化率、血液抗氧化水平以及瘤胃蛋白酶活性。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为菌株z-11的生长曲线。
具体实施方式
22.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
23.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
24.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
25.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
26.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
27.质控菌atcc25922，atcc25923，atcc140281购自微生物菌种保藏中心。
28.实施例1菌种筛选、鉴定和保藏
29.一、筛选
30.1.乳杆菌的初筛
31.从吉林省农业科学院工农五号紫花苜蓿中采集苜蓿原料，将原料置于37℃温箱厌氧条件下培养2d，取10g样品置于90ml无菌水中37℃，180r/min摇床中30min，吸取培养液1ml，用无菌生理盐水依次稀释至10-6
倍，每个稀释度取100μl涂布于mrs固体培养基，37℃厌氧培养24～48h，观察培养基上的菌落生长情况，挑选单个菌落，在mrs固体培养基上，反复划线镜检至纯种，4℃斜面保存。共分离得到1株菌，编号为z-11。
32.2.乳杆菌的复筛
33.2.1菌液培养
34.将冷冻保存于-80℃的初筛得到的菌株z-11，取菌种1ml分别接种于100ml的mrs液体培养基，于37℃恒温箱培养24h后备用。
35.2.2对低ph的耐受性
36.取2.1培养好的菌液，分别加入提前调制好的ph为2.5的mrs液体培养基，1ml菌液加入9ml的mrs液体培养基于20ml的玻璃试管中摇匀后，置入37℃恒温箱中培养，并做三个平行重复避免误差，一个ph正常(即ph值为6)的做对照，每隔1h从试管中取样涂板进行菌落计数统计其存活率。结果见表1。
37.表1
[0038] 1h(cfu/ml)2h(cfu/ml)3h(cfu/ml)z-112.1
×
1072.7
×
1061.8
×
105[0039]
2.3对胆盐的耐受性
[0040]
取2.1培养好的菌液加入提前调制好的胆盐浓度为0.5％的mrs液体培养基，1ml菌液加入9ml的mrs液体培养基于20ml的玻璃试管中摇匀后置入恒温箱中培养，条件控制在37℃，并做三个平行重复避免误差，每隔1h从试管中取样涂板进行菌落计数统计其存活率，结果见表2。
[0041]
表2
[0042] 1h(cfu/ml)2h(cfu/ml)3h(cfu/ml)z-111.7
×
1052.2
×
1053.1
×
104[0043]
2.4抑菌性
[0044]
将冷冻保存于-80℃的菌种1ml接种于100ml的mrs液体培养基，于摇床37℃恒温培养48h后，离心取上清液并使用0.2μm滤膜进行过滤后，存于4℃冰箱中备用。
[0045]
取质控菌atcc25922，atcc25923，atcc140281，各100微升于10ml的mrs液体培养基中于摇床37℃恒温培养3h后传两代，并于分光光度计下调整od值为0.1后取100微升点于提前制备好的双层培养基，用棉棒均匀涂开后，在提前用牛津杯打好的孔洞中加入200微升的过滤液，于4℃冰箱中静置8h后挪于37℃恒温箱培养8-14h后观察是否有抑菌圈的出现以及抑菌圈的大小测量，结果见表3。
[0046]
表3
[0047] 大肠杆菌25922(cm)金黄色葡萄球菌25923(cm)沙门氏菌14028(cm)z-1121.51.5
[0048]
2.5药物敏感性试验
[0049]
将2.1培养好的菌液调整为103cfu/ml后取100微升于mrs平板上用棉棒均匀涂开后依次将药敏片贴于mrs平板上于37℃恒温箱中培养16h后观察是否敏感，结果见表4。
[0050]
表4
[0051][0052]
由表4可知，z-11对β1内酰胺类、四环素类、酰胺醇类、大环内酯类以及磺胺类抗生素敏感，林可胺类处于中介，多肽类、喹诺酮类、氨基糖苷类以及硝基呋喃类不敏感。
[0053]
2.6生长曲线
[0054]
将保存于-80℃的菌液活化后取1ml加入100ml的mrs液体培养基中，前6个小时每隔一个小时取样以mrs液体培养基为对照组测od
600
的吸光值，并倍比稀释涂板计数，6-12小时每隔2h取样以mrs液体培养基为对照组测od
600
的吸光值，并倍比稀释涂板计数，12-24小时每隔4h取样以mrs液体培养基为对照组测od
600
的吸光值，并倍比稀释涂板计数，结果见图1。
[0055]
二、菌种鉴定
[0056]
1.形态学鉴定
[0057]
菌株z-11短小的杆菌、两端顿圆，凸起且边缘整齐光滑，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》，推断z-11可能为乳杆菌属。
[0058]
2.分子生物学鉴定
[0059]
将分离纯化的菌液摇匀，用移液枪分别无菌吸取1ml菌液加入1.5ml灭菌后的离心管中，封口膜封口并做标记，送往派森诺生物公司进行16srdna基因序列测序，测序结果利用genbank中的blast程序比对，对细菌种属进行鉴定，最终鉴定为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。
[0060]
16s rdna序列如seq id no.1所示：
[0061]
seq id no.1：
[0062]
tgcctaatacatgcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagtttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagat
atatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaaggtggacaga
[0063]
三、菌种保藏
[0064]
菌株z-11保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20211493，保藏日期为2021年11月29日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
[0065]
实施例2微生态制剂的制备
[0066]
将菌株z-11接种到mrs液体培养基中37℃温箱中厌氧培养24h，取发酵液于4℃下经7500r/min离心10min，去掉上清液，收集菌体用无菌生理盐水重悬，按上述条件再次离心，弃去上清液，反复洗涤2次。分别用5倍(或1:1比例)体积的保护剂(脱脂牛奶8g，海藻糖1g，谷氨酸钠1.5g，加入100g蒸馏水，115℃灭菌15min。)重悬菌体，搅拌30min，置于-80℃冰箱预冻3h，待真空冷冻干燥机温度降至-40℃～-50℃时，冻干条件为真空度0.2mbar，冷丼温度为-55℃，冻干12-15h。冻干后的菌粉经真空包装机抽真空，置于4℃保存。经检测，植物乳杆菌的活菌数为1
×
10
12
cfu/g。
[0067]
动物试验
[0068]
西门塔尔公肉牛20头，体质量为(500
±
20)kg，按体质量随机分为2组，试验组和对照组。试验前对场地进行消毒，并对肉牛进行驱虫。饲养过程中将饲料以全混合日粮(tmr)形式进行饲喂，每天早晚各饲喂1次，期间自由饮水。试验预饲期7d，试验组每头牛微生态制剂的添加量为80g/d，对照组不添加任何添加剂。试验正试期55d，饲喂方式及添加剂的使用与预饲期相同。试验开始及试验期结束对实验动物空腹测体质量，试验期结束采集静脉血进行相关血液指标检测。
[0069]
测定指标
[0070]
(1)生产性能指标测定
[0071]
每次饲喂时精确称量日粮的投喂量和剩余量，并于试验开始和试验期结束空腹测体质量，用以计算干物质采食量(dmi)、平均日增重(adg)以及料重比(f/g)，结果见表5。
[0072]
表5微生态制剂对肉牛生产性能的影响
[0073][0074]
由表5可知，试验组干物质采食量比对照组提高2.74％(p＜0.05)，说明微生态制剂促进了对瘤胃的发酵起到了一定的调控作用，从而提高其采食水平。平均日增重比对照组提高27.51％(p＜0.05)；试验组料重比降低19.38％，虽未达到显著水平，但是已经有显著趋势。
[0075]
(2)养分表观消化率的测定
[0076]
对饲料中和粪样中干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性纤维含量进行测定，测定参照《饲料分析及饲料质量检测技术》的方法进行。利用酸不溶灰分法(aia)进行营养成分表观消化率的测定，结果见表6。
[0077]
计算公式如下：
[0078]
某营养成分的表观消化率(％)＝(1-bc/ad)
×
100％
[0079]
式中：a为饲粮中某营养成分的含量；b为粪样中某营养成分的含量；c为饲粮中aia的含量；d为粪样中aia的含量。
[0080]
表6微生态制剂对肉牛营养物质表观消化率的影响(％)
[0081][0082][0083]
由表6可知，试验组干物质消化率提高不明显(p＞0.05)；但是试验组粗蛋白消化率比对照组提高1.59％(p＜0.05)；中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维的消化率虽然比对照组有所提高，但均未达到显著水平(p＞0.05)。
[0084]
(3)血液抗氧化指标指标测定
[0085]
试验期结束，颈静脉空腹采血，3000r/min离心10min，血清-20℃保存备用。采用试剂盒法测定血清中超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、丙二醛(mda)及总抗氧化能力(t-aoc)等指标，结果见表7。上述试剂盒购自上海劲马试验设备有限公司。
[0086]
表7微生态制剂对肉牛血清抗氧化指标的影响
[0087][0088]
由表7可知，试验组血液中丙二醛含量比对照组降低29.70％(p＜0.01)；超氧化物歧化酶活性比对照组升高10.03％(p＜0.01)；过氧化氢酶活性比对照组降低16.93％(p＜0.01)；试验组的总抗氧化能力虽然比对照组有提高的趋势，但并未出现显著差异(p〉0.05)。
[0089]
(4)瘤胃液中消化酶活性测定
[0090]
试验期结束，采集瘤胃液，采用3－二硝基水杨酸比色法和试剂盒法(试剂盒购自上海劲马试验设备有限公司)进行测定瘤胃液消化酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶酶、木聚糖酶、果胶酶、滤纸酶)活性，结果见表8。
[0091]
由表8可以看出，试验组瘤胃液中蛋白酶活性比对照组提高7.79％(p＜0.01)；淀粉酶活性比对照组提高10.23％(p＜0.01)；但是瘤胃液中两组脂肪酶活性变化不显著(p〉0.05)；试验组瘤胃液中果胶酶活性比对照组提高12.80％(p＜0.01)；木聚糖酶和滤纸酶活性与对照组差异不显著(p〉0.05)。
[0092]
表8微生态制剂对肉牛瘤胃消化酶活性的影响
[0093][0094]
本试验中的微生态添加剂对肉牛的干物质采食量和增重效果都有促进作用，并能够在一定程度上改善料重比。此外，微生态制剂还能够提高抗氧化水平，能够提高部分瘤胃消化酶活性，改善营养物质的消化吸收。
[0095]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。