用于制备作为PROTACBTK降解剂的双官能化合物的方法与流程

2018071606)中被公开或讨论。
4.布鲁顿(bruton)酪氨酸激酶(btk)属于tec酪氨酸激酶家族(vetrie等人,nature 361:226-233,1993；bradshaw,cell signal.22:1175-84,2010)。btk主要在大多数造血细胞(诸如b细胞、肥大细胞和巨噬细胞)中表达(smith等人,j.immunol.152:557-565,1994)并且定位于骨髓、脾脏和淋巴结组织中。btk在b细胞受体(bcr)和fcr信号传导途径中发挥重要作用，所述途径涉及b细胞发育、分化(khan,immunol.res.23:147,2001)。btk被上游src家族激酶激活。一旦被激活，btk进而磷酸化plcγ，导致影响b细胞功能和存活(humphries等人,j.biol.chem.279:37651,2004)。必须精确调节这些信号传导途径。编码btk的基因的突变会导致人类的遗传性b细胞特异性免疫缺陷疾病，称为x连锁无丙种球蛋白血症(xla)(conley等人,annu.rev.immunol.27:199-227,2009)。异常的bcr介导的信号传导可能导致失调的b细胞激活，导致许多自身免疫和炎性疾病。临床前研究表明，btk缺陷小鼠对发展胶原诱导的关节炎有抵抗力。此外，对美罗华(rituxan)(一种耗尽成熟b细胞的cd20抗体)的临床研究揭示了b细胞在许多炎性疾病(诸如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化)中的关键作用(gurcan等人,int.immunopharmacol.9:10-25,2009)。因此，btk抑制因子可以用于治疗自身免疫和/或炎性疾病。
5.已经显示对btk的抑制会影响癌症发展(b细胞恶性肿瘤)和细胞活力，并且改善自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎和狼疮)。还已报道经由替代策略(诸如通过降解btk)进行对btk的抑制(alexandru d.等人,biochemistry 2018,57,26,3564-3575；adelajda z.等人,pnas 2018 115(31)；dennis d.,等人,blood,2019,133:952-961；yonghui s.等人,cell research,2018,28,779-781；yonghui s.等人,leukemia,2019,degradation of bruton’s tyrosine kinase mutants by protacs for potential treatment of ibrutinib-resistant non-hodgkin lymphomas)。
6.需要比已知btk抑制因子更有效并且经由替代策略(诸如通过降解btk)来抑制btk的新btk抑制因子或降解剂以及其制备方法。本技术解决了所述需要并且提供了一种用于制备protac btk降解剂的方法。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的是提供一种用于通过将btk抑制因子与e3连接酶配体缀合来制备蛋白降解靶向嵌合体(protac)化合物的方法，所述化合物的功能是将靶向蛋白募集到e3泛素连接酶以进行降解。具体地，本技术提供了一种具有式(i)的protac化合物的制备方法。
8.方面1：一种用于制备式(i)化合物的方法：
[0009][0010]
其包括：
[0011][0012]
步骤1：在碱性条件下由i1和i2合成i3；
[0013]
步骤2：在碱性条件下或以金属作为催化条件将i3与i4偶联以形成i5；
[0014]
步骤3：在pd/c条件下脱除苄基，得到i6；
[0015]
步骤4：用mscl将i6转化为i7；
[0016]
步骤5：通过加热由i7和nan3合成i8；
[0017]
步骤6：在存在cuso4和抗坏血酸钠的情况下将i8与i9偶联，得到化合物(i)；
[0018]
其中，x1选自-cr1r
2-、-nr
1-或-co-；
[0019]
ra是卤素(f、cl、br或i)；
[0020]
n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0021]
r1和r2各自独立地为氢、卤素、-c
1-8
烷基，-c
2-8
烯基、-c
2-8
炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，所述-c
1-8
烷基，-c
2-8
烯基、-c
2-8
炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基中的每个任选地被卤素、羟基、-c
1-8
烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基取代。
[0022]
方面2：根据方面1所述的方法：其中x1是-ch
2-或-co-。
[0023]
方面3：根据方面1所述的方法：其中ra是br。
[0024]
方面4：根据方面1所述的方法：其中n是3。
[0025]
方面5：根据方面1所述的方法：在步骤1中，所述碱性条件是在干thf中的t-buok；步骤1的反应在ar气氛下进行。
[0026]
方面6：根据方面1所述的方法：在步骤2中，所述金属是pd
2
和/或cu

。
[0027]
方面7：根据方面1所述的方法：步骤3的反应在ar气氛下进行。
[0028]
方面8：根据方面1所述的方法：步骤4的反应在ar气氛下进行；将所述反应温热至室温。
[0029]
方面9：根据方面1所述的方法：将步骤5中的反应混合物加热至80℃。
[0030]
方面10：根据方面1所述的方法：步骤6的反应在ar气氛下进行。
[0031]
方面11：根据方面1所述的方法，所述式(i)化合物选自
[0032]
实施例
[0033]
下面的实施例旨在纯粹是示例性的，并且不应被认为以任何方式进行限制。已经努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则温度以摄氏度计。试剂购自商业供应商，诸如sigma-aldrich、alfa aesar或tci，并且不经进一步纯化而使用，除非另有说明。除非另有说明，否则以下阐述的反应在正压的氮气或氩气下或用干燥管在无水溶剂中进行；反应烧瓶配有橡胶隔片以用于经由注射器引入底物和试剂；并且将玻璃器皿进行烘箱干燥和/或加热干燥。
[0034]
在400mhz下运行的安捷伦(agilent)仪器上记录1h nmr光谱。
[0035]1hnmr使用cdcl3、cd2cl2、cd3od、d2o、d
6-dmso、d
6-丙酮或(cd3)2co作为溶剂并且使用四甲基硅烷(0.00ppm)或残留溶剂(cdcl3:7.25ppm；cd3od:3.31ppm；d2o:4.79ppm；d
6-dmso:2.50ppm；d
6-丙酮:2.05；(cd3)3co:2.05)作为参考标准来获得光谱。当报告峰多重性时，使用以下缩写：s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、qn(五重峰)、sx(六重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)、dd(双二重峰)、dt(双三重峰)。如果得到耦合常数，则以赫兹(hz)报告。
[0036]
lc-ms光谱仪(agilent 1260)检测器：mwd(190-400nm)，质量检测器：6120sq，流动相：a：含0.1％甲酸的乙腈，b：含0.1％甲酸的水，柱：poroshell 120 ec-c18，4.6x 50mm，2.7pm，梯度方法：流速：1.8ml/min，时间(min)a(％)b(％)
[0037][0038]
在柱(150x 21.2mm id，5pm，gemini nxc 18)上在室温下以20ml/min的流速、2ml的注射体积进行制备型hplc，并且在214nm和254nm处进行紫外(uv)检测。
[0039]
在以下实施例中，使用以下缩写：
[0040]
cbz苄氧基羰基dcm二氯甲烷dmfn,n-二甲基甲酰胺r.t.或r.t.室温thf四氢呋喃tlc薄层色谱法
[0041]
实施例1：(7s)-7-(1-(1-(2-(3-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丙氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-羰基)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0042][0043][0044]
步骤1：((2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)甲基)苯
[0045][0046]
将2-(苄氧基)乙-1-醇(10g，65.8mmol)和t-buok(3.9g，34.87mmol)在干thf(100ml)中的混合物在圆底烧瓶中在室温下在ar气氛下搅拌20min。然后，逐滴添加3-溴丙-1-炔(8.08g，69.1mmol)。在室温下在ar气氛下将混合物搅拌12h。用tlc监测反应(通过kmno4染色)。当反应完成时，在真空中蒸发溶剂，并且添加饱和nacl水溶液以淬灭反应。将混合物用1m hcl酸化至ph＝3-5，然后用dcm萃取。将有机层经无水na2so4干燥，并且在真空中蒸发，得到粗产物，将其用硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)进一步纯化，得到产物
(8g，70％)。
[0047]
步骤2：3-(4-(3-(2-(苄氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
[0048][0049]
将((2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)甲基)苯(0.4g，1.24mmol)、3-(4-溴-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(0.59g，3.1mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(ii)(87mg，0.124mmol)和cui(47mg，0.248mmol)在干dmf(10ml)中的混合物在圆底烧瓶中在室温下在ar气氛下搅拌2min。然后，添加干et3n(10ml)。在80℃下在ar气氛下将混合物搅拌3h。用tlc监测反应。当反应完成时，在真空中蒸发溶剂。将由此获得的粗产物用硅胶柱色谱法(dcm:meoh＝50:1-10:1梯度洗脱)进一步纯化，得到产物(0.5g，94％)。[m h]

＝433.0。
[0050]
步骤3：3-(4-(3-(2-羟基乙氧基)丙基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
[0051][0052]
将3-(4-(3-(2-(苄氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(0.5g，1.16mmol)在meoh(10ml)和dmf(10ml)中的混合物在圆底烧瓶中在室温下在ar气氛下搅拌2min。添加pd/c。将在底部的ar用h2替代。在h2下在50psi的压力下将混合物在38℃下搅拌12h。用tlc监测反应。当反应完成时，经由过滤从溶液中除去黑色固体。在真空中蒸发溶剂，得到粗产物，将其用硅胶柱色谱法(dcm:meoh＝40:1-15:1梯度洗脱)进一步纯化，得到产物(10mg，2.5％)。[m h]

＝347.0。
[0053]
步骤4：甲磺酸2-(3-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丙氧基)乙酯
[0054][0055]
将3-(4-(3-(2-羟基乙氧基)丙基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(6mg，0.0173mmol)和et3n(5.2mg，0.0519mmol)在干thf中的混合物(10ml)在圆底烧瓶中在0℃下在ar气氛下搅拌5min。然后，添加mscl(2.6mg，0.0225mmol)。将混合物温热至室温并且在ar气氛下搅拌4h。用tlc监测反应。当反应完成时，在真空中蒸发溶剂。将由此获得的粗产物用制备型tlc(dcm:meoh＝50:1)进一步纯化，得到产物(8mg，90％)。[m h]

＝425.0。
[0056]
步骤5：3-(4-(3-(2-叠氮基乙氧基)丙基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
[0057][0058]
将甲磺酸2-(3-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丙氧基)乙酯(8mg，0.019mmol)和nan3(2.5mg，0.038mmol)在干dmf中的混合物(6ml)在圆底烧瓶中在80℃下在ar气氛下搅拌4h。用tlc监测反应。当反应完成时，添加饱和nacl水溶液以淬灭反应，并且用etoac萃取。将有机层经无水na2so4干燥，并且在真空中蒸发，得到粗产物，将其用制备型tlc(dcm:meoh＝50:1)进一步纯化，得到产物(10mg，90％)。[m h]

＝372.0。
[0059]
步骤6：(7s)-7-(1-(1-(2-(3-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丙氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-羰基)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0060][0061]
将3-(4-(3-(2-叠氮基乙氧基)丙基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(10mg，0.027mmol)、(s)-2-(4-苯氧基苯基)-7-(1-丙炔酰基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(15.2mg，0.0323mmol)、cuso4(10.8mg，0.0432mmol)、抗坏血酸钠(15.7mg，0.089mmol)和h2o(0.5ml)在t-buoh中的混合物(5ml)在圆底烧瓶中在70℃下在ar气氛下搅拌7h。将反应用饱和nahco3水溶液淬灭，并且用dcm萃取。将有机层经无水na2so4干燥，并且在真空中蒸发，得到粗产物，将其用制备型tlc(dcm:meoh＝20:1)进一步纯化，得到产物(2.3mg，10.5％)。1h nmr(400mhz,dmso)δ
h 10.99(s,1h),8.49(s,1h),7.58-7.32(m,,7h),7.17(t,j＝7.2hz,1h),7.07(dd,j＝12.0,8.4hz,4h),6.67(s,1h),5.12(dd,j＝12.8,4.4hz,1h),4.80(s,1h),4.70-4.49(m,4h),4.34(dd,j＝60.8,17.2hz,3h),4.03-3.95(m,1h),3.83-3.77(m,2h),3.44-3.35(m,3h),3.15-2.82(m,6h),2.75-2.60(m,5h),2.07-1.71(m,10h),1.67-1.40(m,5h)；[m h]

＝841.0。
[0062]
实施例2：(7s)-7-(1-(1-(2-(2-(3-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丙氧基)乙氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-羰基)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0063][0064]
以类似于实施例1的程序合成标题化合物。1h nmr(400mhz,dmso)δ
h 10.99(s,1h),8.46(s,1h),7.61-7.36(m,8h),7.17(t,j＝7.6hz,1h),7.06(dd,j＝11.6,8.4hz,4h),6.68
1000
×
储备溶液转移到99μl培养基中来制造在细胞培养基中的10
×
溶液；(3)将11μl 10
×
溶液添加到细胞中并且孵育16h。
[0074]
elisa测定
[0075]
通过离心(1200rpm)收获在96孔板中的细胞，并且将其用冰冷的pbs洗涤一次。然后，在每个孔中添加100μl 1
×
细胞提取缓冲液。将细胞放置在振摇器上在4℃下20min；将5μl裂解物转移到在elisa板中的45μl 1
×
细胞提取缓冲液中，并且在每个孔中添加50μl抗体混合物；将板密封并且在板振摇器上在室温下孵育1小时；将培养基从板上弃去，将板轻拍在纸巾上，洗涤3
×
200μl elisa洗涤缓冲液；向每个孔中添加100μl tmb，并且将板在室温下在振摇器上在黑暗中孵育15min；向每个孔中添加100μl stop溶液；读取在450nm处的吸光度。使用fastscan总btk elisa试剂盒(cell signaling目录号36609)进行btk elisa测定。
[0076]
表1.实施例1至实施例162的降解结果
[0077]
[0078]
某些实施方案的前述实施例和描述应当被认为是说明性的，而不对如由权利要求书限定的本发明进行限制。如将容易理解的，在不背离如在权利要求书中阐述的本发明的情况下，可以利用上面阐述的特征的许多变化和组合。所有此类变化都旨在包括在本发明的范围内。将所引用的所有参考文献均通过引用以其整体并入本文。
[0079]
应当理解，如果本文提到任何现有技术出版物，则这样的引用不构成以下承认：所述出版物在任何国家都形成本领域公知常识的一部分。