兽疫链球菌的基因工程菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及兽疫链球菌的基因工程菌株及其应用，更具体地，本发明涉及兽疫链球菌的基因工程菌株、提高兽疫链球菌合成透明质酸的方法以及生产透明质酸的方法。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,ha)是由葡萄糖醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。
3.由于发酵方法简单，所需原料易得，成本相对较低，微生物发酵法生产透明质酸是当前生产透明质酸最主要的方式之一。目前可用于直接生产ha的微生物菌株主要分为链球菌属中的a类和c类，如酿脓链球菌和兽疫链球菌等。兽疫链球菌作为c类链球菌中的一员，由于其更低的致病性，更高的ha产率而常常受到青睐。然而，利用微生物发酵法生产ha也体现出许多局限。受宿主菌的影响，不同宿主生产ha的能力不同，但摇瓶产量大多小于1g/l，发酵罐产量也一般在7g/l以内，这不但增加了生产成本，也难以满足日益增长的市场需求。以目前的宿主改良技术而言，化学诱变或物理诱变技术是筛选优良生产菌株的主流方式之一，但诱变育种周期较长、结果不确定性大、高毒性的弊端也常常是限制其发展的主要因素之一。
4.相比诱变育种而言，利用基因工程手段来定向改造宿主，从而获得高产菌株的手段具有更快捷、更可控、周期短的优势，是当前及未来最主要的育种技术之一。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
6.本技术的发明人在研发过程中意外地发现，hasb基因在兽疫链球菌生产透明质酸中的作用尤其显著，并且本技术的发明人独创性地将hasab拆分成两个独立完成的表达框，并将hasb基因的稀有起始密码子gtg突变成atg，增强了hasb基因的表达比例，最终使摇瓶发酵产量达到2.4-2.8g/l，相比野生型兽疫链球菌生产透明质酸的产量0.8g/l-0.9g/l，产量提高了160％以上。
7.在本发明的第一方面，本发明提出了一种兽疫链球菌的基因工程菌株。根据本发明的实施例，所述基因工程菌株携带外源的基因表达框，所述外源的基因表达框包括第一基因表达框和第二基因表达框，其中，所述第一基因表达框包括第一启动子和hasa基因，所述第一启动子和hasa基因可操作的连接；所述第二基因表达框包括第二启动子和hasb基因，所述第二启动子和hasb基因可操作的连接。需要说明的是，本技术所述的“外源的基因表达框”是指来源于外部的基因表达框，而非兽疫链球菌自身基因组上具有的基因表达框，这种来源于外部的基因表达框可通过构建体或载体携带所需的基因表达框进入兽疫链球
菌菌体内获得，它的结构可以与兽疫链球菌自身基因组上具有的基因表达框相同或不同。根据本发明实施例的兽疫链球菌的基因工程菌株，携带外源的hasa基因表达框和外源的hasb 基因表达框，而不携带外源的hasc基因表达框，且外源的基因表达框中的hasa基因和hasb 基因可在两个独立地启动子下启动表达，相比于现有兽疫链球菌的基因工程菌株，具有显著更高的ha合成产量。
8.根据本发明的实施例，上述兽疫链球菌的基因工程菌株还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
9.根据本发明的实施例，所述第一基因表达框和第二基因表达框设置于不同的构建体或同一构建体上。
10.根据本发明的实施例，所述构建体包括选自pset4、pset4s、peu308、pdl276的至少之一。
11.根据本发明的实施例，所述第一基因表达框和第二基因表达框设置于同一构建体上，所述第一基因表达框的3’端与所述第二基因表达框的5’端相连或所述第二基因表达框的 3’端与所述第一基因表达框的5’端相连。
12.根据本发明的实施例，所述构建体为游离型pset4载体。根据本发明实施例的游离型 pset4载体稳定性更高。
13.根据本发明的实施例，所述第一启动子启动基因表达的强度弱于所述第二启动子启动基因表达的强度。发明人发现，当控制hasa基因的第一启动子的强度弱于控制hasb基因的第二启动子的强度时，根据本发明实施例的兽疫链球菌的基因工程菌株的ha合成产量更高。例如，发明人尝试当采用pldh控制hasa基因，pabc控制hasb基因,pabc启动子的强度弱于pldh启动子，或者是同时采用pldh控制hasa基因和hasb基因，所获得的ha 的产量均低于采用pabc控制hasa基因，pldh控制hasa基因。
14.根据本发明的实施例，所述第一启动子和第二启动子分别独立地选自pgapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子)、pack(乙酸激酶启动子)、pabc或pldh。
15.根据本发明的实施例，所述第一启动子为pabc，所述第二启动子为pldh。发明人发现，hasb基因在兽疫链球菌生产透明质酸中的作用尤其显著，采用和乳酸脱氢酶相同的启动子pldh来表达hasb基因，通过启动子竞争机制明显降低发酵过程中乳酸的生成，使发酵过程更容易控制。
16.根据本发明的实施例，所述hasb基因的起始密码子为atg。发明人发现，将hasb基因的gtg起始密码子更改成atg起始密码子，可进一步提升hasb基因的表达比例，进一步提高ha合成产量。
17.根据本发明的实施例，所述兽疫链球菌的分类命名为streptococcus equisubsp.zooepidemicus hec-se01,马链球菌兽疫亚种hec-se01，保藏号为cctcc no:m 2020231，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年6月22日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
18.在本发明的第二方面，本发明提出了一种提高兽疫链球菌合成透明质酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使得兽疫链球菌携带外源的基因表达框，所述外源的基因表达框包括第一基因表达框和第二基因表达框，其中，所述第一基因表达框包括第一启动子和hasa基因，所述第一启动子和hasa基因可操作的连接；所述第二基因表达框包括
第二启动子和hasb基因，所述第二启动子和hasb基因可操作的连接。根据本发明实施例的方法可显著提高透明质酸的合成量。
19.根据本发明实施例的方法具有与上述兽疫链球菌基因工程菌株相同的附加技术特征，所带来的技术效果相同，在此不再赘述。
20.根据本发明的具体实施例，使得兽疫链球菌携带外源的基因表达框是通过将携带所需基因表达框的构建体通过电穿孔法导入兽疫链球菌实现的。
21.在本发明的第三方面，本发明提出了一种生产透明质酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将前面所述的基因工程菌株进行发酵处理，以便获得所述透明质酸。根据本发明实施例的方法所获得的透明质酸的量显著提高。
22.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
23.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
24.图1是根据本发明实施例3的pset4-pat的质粒图谱；
25.图2是根据本发明实施例4的pset4-pasbt的质粒图谱；
26.图3是根据本发明实施例5的pset4-pasbsct的质粒图谱；
27.图4是根据本发明实施例6pset4-p1at-p1bt的质粒图谱；
28.图5是根据本发明实施例7pset4-p2at-p1bt的质粒图谱；
29.图6是根据本发明实施例8pset4-p2at-p2bt的质粒图谱；
30.图7是根据本发明实施例9pset4-p1at-p2bt的质粒图谱；
31.图8是根据本发明实施例9的转化子琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
32.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
33.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
34.根据本发明的具体实施例，本发明所提出的改造兽疫链球菌以用于生产透明质酸的方法如下所述：
35.1、以大肠-兽疫链球菌穿梭型基因组编辑载体pset4s为出发载体，经点突变技术将其突变成游离型pset4载体，并作为后续游离过表达载体的骨架载体；
36.2、用引物01f/01r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pabc hasa表达框(pabc为兽疫链球菌has基因簇启动子)。其中，01f引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，01r引入一段终止子序列 ter和ecor
ꢀⅰ
酶切位点，将克隆出的表达框命名为pat(pabc hasa ter)，并采用酶切酶连的方式将pat表达框插入到pset4载体的bgl
ꢀⅱ
和ecor
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第一个游离表达
载体pset4-pat；
37.3、用引物02f/02r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pldh启动子序列(乳酸脱氢酶启动子)，用引物03f/03r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasb基因。其中，通过02f引物引入ecor
ꢀⅰ
酶切位点，通过03f将hasb基因的gtg突变成为atg，以增强hasb的翻译效率，通过03r引入一段终止子序列ter和sal
ꢀⅰ
酶切位点。然后，用02f/03r将pldh启动子和hasb ter片段通过overlap pcr连接在一起，组成pldh hasb ter表达框，并命名为 p2bt。最后，采用酶切酶连的方式将p2bt插入到pset4-pat载体的ecor
ꢀⅰ
和sal
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第二个游离表达载体pset4-pat-p2bt；
38.4、将兽疫链球菌制备成感受态细胞，采用电穿孔法将pset4-pat-p2bt载体导入兽疫链球菌中，在含50μg/ml终浓度的壮观霉素bhi固体培养基上筛选转化子，用yf/yr对转化子进行验证，验证正确的转化子即最终菌种。
39.相比现有技术，本技术方案的兽疫链球菌改造方法具有如下优势：
40.1)相比于传统诱变育种而言，本方法操作简单、周期短，结果预期较好。在原始菌种的代谢流基础上，增强ha合成途径，即保持了菌种的优良特性又能提高产量，摇瓶产量达到2.4g/l-2.8g/l，15l发酵罐产量达到9g/l-11g/l，50l发酵罐产量达到9g/l-10g/l，而目前一般报导的兽疫链球菌摇瓶产量则一般为0.1g/l-1.0g/l，本发明的方法改造后的兽疫链球菌相对于原始菌株提升160％以上。
41.2)本技术将hasa基因和hasb基因单独过表达，每个基因均由单独的强启动子启动，并独创性的将hasb基因的gtg起始密码子更改成atg起始密码子，进一步提升hasb基因的表达比例，最终使摇瓶产量相比出发菌株提升160％以上，达到2.4-2.8g/l。
42.3)本技术中采用和乳酸脱氢酶相同的启动子pldh来表达hasb基因，通过启动子竞争机制明显降低发酵过程中乳酸的生成，使发酵过程更容易控制。
43.4)所构建的菌株在15l、50l发酵罐发酵稳定，结果重现性较高，在高产透明质酸的同时，分子量也能达到2-2.8mda，与原始菌株生产的ha分子量、分布宽度保持一致，没有降低，产品分子量集中均一，生产潜力巨大。
44.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
45.下列实施例所采用的原始菌株为保藏号为cctcc no:m 2020231的兽疫链球菌(在本技术中命名为马链球菌兽疫亚种hec-se01，streptococcus equi subsp.zooepidemicushec-se01)。
46.种子培养基(g/l)：葡萄糖10，蛋白胨15，酵母浸粉5，k2hpo
4 1.5，mgso
4 0.35， ph 6.5；
47.摇瓶发酵培养基(g/l)：葡萄糖30，酵母粉5.55，蛋白胨16.67，k2hpo
4 1.72，mgso
4 0.36，味精3.44，无水磷酸二氢钠9.36，十二水合磷酸氢二钠43.69，ph＝7.5。
48.以下实施例所使用的引物序列如下表1所示。
49.表1：
[0050][0051][0052]
以下实施例的构建体中的元素单元的核苷酸序列如下所示。
[0053]
兽疫链球菌has基因簇启动子pabc
[0054]
tcggagctccttatagaattgctttattaccaatatgaagtggcctgataagggct gcttttttgatgtcaaaaaagagagcgaaaagcggctgtccaaagcgctttagtttt ggacgggccatttagctgcttgttatcaggcacatgctagcgatagccacaggtaaac tcaggctatcatttgttttttgtaggggattgatgacttggtgagcataggcaaatctt agaaaaagctgtattgacactaagattaatctatctttaatagaatggtaaattaatga ccttgtttgcttgctgtgacagatagtatattatggttagcgtttaaaggcaaaataca aagcgcaagaaaggaacaaaccaatcaca(seq id no:1)。
[0055]
hasa基因
[0056]
atgagaacattaaaaaacctcataactgttgtggcctttagtattttttgggtact gttgatttacgtcaatgtttatctctttggtgctaaaggaagcttgtcaatttatggctt tttgctgatagcttacctattagttaaaatgtccttatcctttttttacaagccatttaa gggaagggctgggcaatataaggttgcagccattattccctcttataacgaagatgct gagtcattgctagagaccttaaaaagtgttcagcagcaaacctatcccctagcagaaa tttatgttgttgacgatggaagtgctgatgagacaggtattaagcgcattgaagactat gtgcgtgaaactggtgacctatcaagcaatgtcattgttcatcggtcagagaaaaatc aaggaaagcgtcatgcacaggcctgggcctttgaaagatcagacgctgatgtctttt tgaccgttgactcagatacttatatctaccctgatgctttggaggagctgttaaaaacc tttaatgacccaacagtatatgctgctacaggtcatttgaatgttcgaaatagagaagt gaatcttctaacgcgtttaacggatattcgctatgataatgcttttggcgtggagcgag ctgcccaatctgttacgggtaat
atccttgtttgctcaggacctcttagcatttacaga cgcgaggttgtagtacctaacatagataaatacatcaatcaaaccttcttaggcattcc tgtaagcatcggtgatgataggtgcttgaccaactatgcaactgatttaggaaagacc gtttatcaatctactgctaaatgtattacagatgttcctgacaagatgtctacttacttg aagcagcaaaaccgctggaacaagtccttctttagagagtccattatttctgttaaga aaatcatgaacaatccttttgtagccctatggaccatacttgaggtgtctatgtttatga tgcttgtttattctgtggtggatttctttgtaggcaatgtcagagaatttgattggtta agggttttagcctttctggtgattatcttcattgttgctctttgtcgtaatattcactata tgcttaagcacccgctgtccttcttgttatctccattttatggggtgctgcacttgtttg tcctacagcccttgaaattatattctctttttactattagaaacgctgactggggaaca cgtaaaaaattattataa(seq id no:2)。
[0057]
hasb基因
[0058]
gtgaaaatttctgtagcaggctcaggatatgtcggcctatccttgagtattttact ggcacaacataatgacgtcactgttgttgacattattgatgaaaaggtgagattgatc aatcaaggcatatcgccaatcaaggatgctgatattgaggagtatttaaaaaatgcgcc gctaaatctcacagcgacgcttgatggcgcaagcgcttatagcaatgcagaccttatta tcattgctactccgacaaattatgacagcgaacgcaactactttgacacaaggcatgt tgaagaggtcatcgagcaggtcctagacctaaatgcgtcagcaaccattattatcaaa tcaaccataccactaggctttatcaagcatgttagggaaaaataccagacagatcgtat tatttttagcccagaatttttaagagaatcaaaagccttatacgataacctttacccaa gtcggatcattgtttcttatgaaaaggacgactcaccaagggttattcaggctgctaa agcctttgctggtcttttaaaggaaggagccaaaagcaaggatactccggtcttattt atgggctcacaggaggctgaggcggtcaagctatttgcgaatacctttttggccatgc gggtgtcttactttaatgaattagacacctattccgaaagcaagggtctagatgctca gcgcgtgattgaaggagtctgtcatgatcagcgcattggtaaccattacaataaccctt cctttggatatggcggctattgcctgccaaaggacagcaagcagctgttggcaaatta tagaggcattccccagtccttgatgtcagcgattgttgagtccaacaagatacgaaaa tcctatttagctgaacaaatattagacagagcctctagtcaaaagcaggctggtgtac cattaacgattggcttttaccgcttgattatgaaaagcaactctgataatttccgagaa agcgccattaaagatattattgatatcatcaacgactatgggattaatattgtcatttac gaaccaatgcttggtgaggacattggctacagggttgtcaaggacttagagcagttc aaaaacgagtctacaatcattgtgtcaaatcgctttgaggacgacctaggagatgtca ttgacaaggtttacacgagagatgtctttggaagagactag(seq id no:3)。
[0059]
hasc基因
[0060]
atgaccaaagtcagaaaagccattattcctgctgcaggtctaggaacacgttttt tacctgctaccaaagctcttgccaaagagatgttgcccatcgttgataaaccaaccat ccagtttatcgtcgaagaagcgctaaaatctggcatcgaggaaatccttgtggtgacc ggaaaagctaaacgctctatcgaggaccattttgattcaaactttgaattagaataca acctccaagctaaggggaaaaatgaactgttgaaattagtggatgaaaccactgcca ttaaccttcattttatccgtcaaagccacccaagagggctgggagatgctgtcttaca agccaaagcctttgtgggcaatgaaccctttgtggtcatgcttggagatgacttaatg gacattacaaatgcatccgctaaacctctcaccaaacaactcatggaggactatgaca agacgcatgcatccactatcgctgtgatgaaagttcctcatgaagatgtgtctagctat ggggttatcgctcctcaaggcaaggctgtcaagggcctttacagtgtagacacctttg ttgaaaaaccacaaccagaagatgcgcctagtgatttggctattattggtcgttacct cctaacccctgaaatttttggtattttggaaagacagacccctggagcaggtaacgaa gtgcaactcacagatgctatcgataccctcaataaaactcagcgtgtctttgcacgag aatttaaaggcaatcgttacgatgttggggataaatttggattcatgaaaacatctatc gact
atgccttagaacacccacaggtcaaagaggacttgaaaaattacattatcaaac taggaaaagctttggaaaaaagtaaagtaccaacacattcaaagtaa(seq idno:4)。
[0061]
pldh:
[0062]
cttaaggaatgctccttttctagtcaatactcttttaattataccataaaatccttat tttttctggttggaaacgctatccgaaaacaattttcataatttggtcgaatatcatga caaagacattacaatgtgttaaaataagatcgtatgagcaatttgctctaactaaaatg aaggagatgtttagaa(seq id no:5)。
[0063]
实施例1出发菌株摇瓶发酵验证
[0064]
取兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)菌株按千分之一接种量接种到种子培养基中，培养至od
660
＝0.5-0.6，按10％接种量转接至发酵培养基中，37℃，220rpm培养48h，取样检测ha产量及分子量，产量为0.8-0.9g/l，分子量为2-3mda。
[0065]
实施例2 pset4游离型表达载体的构建
[0066]
用pset4-f/pset4-r点突变引物对pset4s载体进行整体扩增，扩增得到的pcr产物经dpnⅰ酶切消化后转化大肠杆菌，挑取转化子接种到含50μg/ml壮观霉素lb液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，提取质粒送测序，测序结果正确的载体即为游离型pset4。
[0067]
实施例3 hasa过表达菌株构建过程
[0068]
用引物01f/01r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pabc hasa表达框(pabc为兽疫链球菌has基因簇启动子)。其中，01f引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，01r引入一段终止子序列ter 和ecor
ꢀⅰ
酶切位点，将克隆出的表达框命名为pat(pabc hasa ter，并采用酶切酶连的方式将pat表达框插入到pset4载体的bgl
ꢀⅱ
和ecor
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成hasa过表达载体pset4-pat，pset4-pat的质粒图谱如图1所示；将兽疫链球菌制备成感受态细胞，采用电穿孔法将pset4-pat载体导入兽疫链球菌中，在含50μg/ml终浓度的壮观霉素 bhi固体培养基上筛选转化子，用yf/yr对转化子进行验证，验证正确的转化子即hasa 过表达菌株，摇瓶发酵ha产量为1.1-1.26g/l。
[0069]
实施例4 hasab联合过表达菌株构建
[0070]
用引物01f/04r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasab表达框 (pabc hasa-rbs-hasb，pabc为兽疫链球菌has基因簇启动子，rbs为核糖体结合位点)。其中，01f引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，04r引入一段终止子序列ter和sma
ꢀⅰ
酶切位点，将克隆出的表达框命名为pasbt(pabc hasa rbs hasb ter)，并采用酶切酶连的方式将pasbt 表达框插入到pset4载体的bgl
ꢀⅱ
和sma
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成hasab联合过表达载体pset4-pasbt，pset4-pasbt的质粒图谱如图2所示；将兽疫链球菌制备成感受态细胞，采用电穿孔法将pset4-pasbt载体导入兽疫链球菌中，在含50μg/ml终浓度的壮观霉素bhi固体培养基上筛选转化子，用yf/yr对转化子进行验证，验证正确的转化子即 hasab联合过表达菌株，摇瓶产量为1.4-1.6g/l。
[0071]
实施例5 hasabc联合过表达菌株构建
[0072]
用引物01f/05r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasab表达框 (pabc hasa rbs hasb rbs hasc，pabc为兽疫链球菌has基因簇启动子)。其中，01f 引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，05r引入一段终止子序列ter和sma
ꢀⅰ
酶切位点，将克隆出的表达框命名为pasbsct(pabc hasa rbs hasb rbs hasc ter)，并采用酶切酶连的方式将 pasbsct表达框插入到pset4载体的bgl
ꢀⅱ
和sma
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成hasabc联合过表达载体pset4-pasbsct，
pset4-pasbsct的质粒图谱如图3所示；将兽疫链球菌制备成感受态细胞，采用电穿孔法将pset4-pasbsct载体导入兽疫链球菌中，在含 50μg/ml终浓度的壮观霉素bhi固体培养基上筛选转化子，用yf/yr对转化子进行验证，验证正确的转化子即hasab联合过表达菌株，摇瓶产量为1.2-1.3g/l。
[0073]
实施例6采用pabc启动子分别过表达hasa和hasb
[0074]
用引物01f/01r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pabc hasa表达框(pabc为兽疫链球菌has基因簇启动子)。其中，01f引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，01r引入一段终止子序列ter 和ecor
ꢀⅰ
酶切位点，将克隆出的表达框命名为p1at(pabc hasa ter)，并采用酶切酶连的方式将pat表达框插入到pset4载体的bgl
ꢀⅱ
和ecor
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第一个游离表达载体pset4-p1at；用引物06f/06r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pabc启动子序列，用引物07f/03r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasb基因。其中，通过07f引物引入ecor
ꢀⅰ
酶切位点，并将hasb基因的gtg突变成为atg，以增强hasb的翻译效率，通过03r引入一段终止子序列ter和sal
ꢀⅰ
酶切位点。然后，用06f/03r将pabc启动子和 hasb ter片段通过overlap pcr连接在一起，组成pabc hasb ter表达框，并命名为p1bt。最后，采用酶切酶连的方式将p1bt插入到pset4-p1at载体的ecor
ꢀⅰ
和sal
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第二个游离表达载体pset4-p1at-p1bt，pset4-p1at-p1bt的质粒图谱如图 4所示。
[0075]
实施例7使用pldh启动子过表达hasa，pabc启动子过表达hasb
[0076]
用引物04f/07r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pldh启动子(标记为p2),08f/01r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasa片段，用04f/01r对pldh、hasa片段进行融合。其中， 04f引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，01r引入一段终止子序列ter和ecor
ꢀⅰ
酶切位点。将克隆出的表达框命名为p2at(pldh hasa ter，首字母简写)，并采用酶切酶连的方式将p2at表达框插入到pset4载体的bgl
ꢀⅱ
和ecor
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第一个游离表达载体 pset4-p2at；用引物06f/06r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pabc启动子序列，用引物 07f/03r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasb基因。其中，通过07f引物引入ecor
ꢀⅰ
酶切位点，并将hasb基因的gtg突变成为atg，以增强hasb的翻译效率，通过03r引入一段终止子序列ter和sal
ꢀⅰ
酶切位点。然后，用06f/03r将pabc启动子和hasb ter片段通过overlap pcr连接在一起，组成pabc hasb ter表达框，并命名为p1bt。最后，采用酶切酶连的方式将p1bt插入到pset4-p2at载体的ecor
ꢀⅰ
和sal
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第二个游离表达载体pset4-p2at-p1bt，pset4-p2at-p1bt的质粒图谱如图5所示。
[0077]
实施例8使用pldh分别过表达hasa和hasb
[0078]
用引物04f/07r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pldh启动子(标记为p2),08f/01r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasa片段，用04f/01r对pldh、hasa片段进行融合。其中， 03f引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，01r引入一段终止子序列ter和ecor
ꢀⅰ
酶切位点。将克隆出的表达框命名为p2at(pldh hasa ter)，并采用酶切酶连的方式将p2at表达框插入到pset4 载体的bgl
ꢀⅱ
和ecor
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第一个游离表达载体pset4-p2at；用引物02f/02r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pldh启动子序列(乳酸脱氢酶启动子)，用引物03f/03r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasb基因。其中，通过02f引物引入ecor
ꢀⅰ
酶切位点，通过03f将hasb基因的gtg突变成为atg，以增强hasb的翻译效率，通过 03r引入一段终止子序列ter和sal
ꢀⅰ
酶切位点。然后，用02f/03r将pldh启动子和hasb ter 片段通过overlap pcr连
接在一起，组成pldh hasb ter表达框，并命名为p2bt。最后，采用酶切酶连的方式将p2bt插入到pset4-pat载体的ecor
ꢀⅰ
和sal
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第二个游离表达载体pset4-p2at-p2bt，pset4-p2at-p2bt的质粒图谱如图6所示。
[0079]
实施例9 hec-se02菌株构建
[0080]
用引物01f/01r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pabc hasa表达框(pabc为兽疫链球菌has基因簇启动子)。其中，01f引入bgl
ꢀⅱ
酶切位点，01r引入一段终止子序列ter 和ecor
ꢀⅰ
酶切位点，将克隆出的表达框命名为p1at(pabc hasa ter)，并采用酶切酶连的方式将pat表达框插入到pset4载体的bgl
ꢀⅱ
和ecor
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第一个游离表达载体pset4-p1at；用引物02f/02r从兽疫链球菌的基因组中克隆出pldh启动子序列(乳酸脱氢酶启动子)，用引物03f/03r从兽疫链球菌的基因组中克隆出hasb基因。其中，通过02f引物引入ecor
ꢀⅰ
酶切位点，通过03f将hasb基因的gtg突变成为atg，以增强hasb的翻译效率，通过03r引入一段终止子序列ter和sal
ꢀⅰ
酶切位点。然后，用 02f/03r将pldh启动子和hasb ter片段通过overlap pcr连接在一起，组成pldh hasb ter 表达框，并命名为p2bt。最后，采用酶切酶连的方式将p2bt插入到pset4-p1at载体的 ecor
ꢀⅰ
和sal
ꢀⅰ
酶切位点之间，由此生成第二个游离表达载体pset4-p1at-p2bt， pset4-p1at-p2bt的质粒图谱如图7所示；将兽疫链球菌制备成感受态细胞，采用电穿孔法将pset4-p1at-p2bt载体导入兽疫链球菌中，在含50μg/ml终浓度的壮观霉素bhi固体培养基上筛选转化子，用yf/yr对转化子进行验证，转化子琼脂糖凝胶电泳图如图8所示，验证正确的转化子即最终菌种。
[0081]
实施例10最终菌种摇瓶发酵验证
[0082]
取实施例9所获得的最终菌种在含有50μg/ml终浓度的壮观霉素bhi固体培养基上划线活化，37℃培养24h；取5ml无菌的生理盐水将菌体洗下，按百分之一接种到添加有 50μg/ml终浓度的壮观霉素的种子培养基中，37℃，220rpm培养12h至od
660
＝0.3-0.6，按 10％接种至发酵培养基中，37℃，220rpm培养48h，取样稀释20倍用gpc测ha产量和分子量，摇瓶ha产量2.4-2.8g/l，分子量2-2.8mda。
[0083]
实施例11最终菌种15l发酵罐发酵过程乳酸含量检测
[0084]
取甘油管中储存的实施例9所获得的最终菌种菌株，按1％接种量接种到1l添加有50 μg/ml终浓度壮观霉素的种子培养基中培养至od
660
＝0.4左右，将种子液接种到15l发酵罐中，37℃发酵48h，期间采取流加naoh的方式调节ph＝7.0，取最终发酵液样品检测乳酸含量。经检测发现，hec-haz菌株的乳酸含量在30-35g/l，而出发菌株的乳酸含量在 42-50g/l，有明显降低。
[0085]
以上各实施例的基因型和ha摇瓶产量、分子量对比如表2所示。
[0086]
表2：各实施例基因型和ha摇瓶产量、分子量对比
[0087][0088]
由表1结果可以看出，联合表达hasab相比于单独过表达hasa或联合表达hasabc， ha摇瓶产量更高；pabc表达hasa，pldh表达hasb相比于pabc分别表达hasa和hasb、pldh表达hasa，pabc表达hasb或pldh分别过表达hasa和hasb，ha摇瓶产量更高。
[0089]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0090]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。