不结球白菜品种鉴定SSR分子标记引物的筛选及应用的制作方法

不结球白菜品种鉴定ssr分子标记引物的筛选及应用
技术领域
1.本发明属于分子标记技术开发及应用技术领域，具体涉及一种不结球白菜品种鉴定ssr分子标记引物的筛选方法及应用。


背景技术：

2.不结球白菜(brassica campestris l.ssp chinensis makino)又称小白菜、油菜、青菜等，是十字花科(cruciferae)芸薹属(brassica)白菜种中不形成叶球的亚种中的两个变种，即普通白菜变种(var.communis tsen et lee.)和乌塌菜变种(var.rosularis tsen et lee.)，原产于我国，广泛栽培于我国长江流域地区，南北方均有分布，栽培面积由2005年的800万亩上升到现在的2，100万亩左右，因其品种多样，容易种植，生长快，产量高，已成为我国第三大蔬菜作物。不结球白菜由于营养价值丰富，含有糖类、脂肪、蛋白质、膳食纤维、磷、铁、钙、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素c、胡萝卜素等，深受广大群众的喜爱。
3.目前小白菜生产存在外观欠佳、品质较差、抗病能力较弱等问题，这些问题阻碍了小白菜的生产发展。因此，小白菜种质资源的创新是我国种子市场在我国继续立足的重要条件和动力所在。而资源创新须深入了解小白菜种质间的亲缘关系和遗传多样性。这不仅有利于保护小白菜的资源，更有利于杂交亲本的选配，从而提高小白菜的育种效率。
4.近年来，关于利用issr、srap、rapd、aflp等分子标记技术对不结球白菜品种进行品种鉴定及亲缘关系等方面的研究较多，但尚未有ssr标记应用于小白菜品种鉴定的相关报道。ssr(simple sequence repeats)标记是一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，每个ssr两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。微卫星中重复单位的数目存在高度变异，根据ssr两端序列设计特异性引物，通过pcr反应扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳技术分析序列长度的多态性，从而揭示其多态性。ssr标记的主要特点为数量丰富，多态性高、共显性、重复性好、操作简单等，近年来被广泛应用于遗传图谱的构建、种质资源的遗传多样性分析、品种鉴定等研究。
5.本发明利用ssr分子标记对收集的171份不结球白菜种质资源进行遗传多样性及其亲缘关系分析，筛选可用于品种鉴定的引物组合，从而有助于国内小白菜资源的搜集、研究和育种工作。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种不结球白菜品种鉴定ssr分子标记引物的筛选方法及应用。
7.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
8.第一方面，本发明提供了一种不结球白菜ssr分子标记引物组，包括9对ssr分子标记引物对：
9.brgms4497，f引物：atcaaaagatgcagggagagag，r引物：gtcctcaatggattacacatgc；
10.cnu_m288a，f引物：gcgtttcgtcctcttctcac，r引物：ttacccaccttggcttcatc；
11.cnu_m327a，f引物：ttcttgaccaaaagaatcatgg，r引物：ctaacacggggaaaagcaga；
12.fito438，f引物：cacaacacaacaaatcaacac，r引物：gaagacacggagttacgg；
13.brgms70，f引物：tacaatgaagatgtgatcccga，r引物：cgtgcgtgagcttatcaataca；
14.cnu_m289a，f引物：cccctggactccgtttatct，r引物：gatctacgacgatcggatgc；
15.brms
‑
027，f引物：gcaggcgttgcctttatgta，r引物：tcgttggtcggtcactcctt；
16.brgms4536，f引物：agtggaaggagaagagttggtg，r引物：agttatccaagcacccaaacac；
17.ra2
‑
f04，f引物：cctacaaacacataaataaagagagag，r引物：aacaacataaaagattcatttcg。
18.第二方面，本发明提供了一种不结球白菜ssr分子标记引物的筛选方法，所述方法包括如下步骤：
19.s1、提取不结球白菜dna；
20.s2、从已确定染色体位置的ssr引物中挑选出若干对；以部分步骤s1获得的dna为模板进行多重pcr扩增，初筛出具有多态性的ssr引物；所述多重pcr扩增采用的引物包括：tag的修饰引物，带tag序列的f引物，r引物；所述tag的修饰引物为通用tag的16个碱基的引物序列；
21.s3、再次以步骤s1获得的所有dna为模板，利用步骤s2中初筛得到的ssr引物分别对所述dna进行pcr扩增，复筛出条带清晰、多态性好的ssr引物，即所述不结球白菜ssr分子标记引物。
22.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中的dna模板包括菜薹变种、普通白菜变种和塌菜品种分别提取得到的dna。
23.作为本发明的一个实施方案，所述菜薹变种包括广良cx101、广良cx102、苏薹4号；所述普通白菜变种包括金品592、金品549和xin35692；所述塌菜品种包括xin41629、xin41630和xin44008。
24.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，已确定染色体位置的ssr引物指的是：从数据库获取ssr引物若干对；从ncbi数据库下载不结球白菜的基因组序列信息，用dnaman进行引物序列匹配，确定扩增序列所在染色体。
25.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，每20μl pcr反应体系中含：金牌mix(green)16.45μl、10μmol/l的f引物0.15μl、10μmol/l的带tag序列的f引物1.2μl、10μmol/l的r引物1.2μl、100～200ng/μl的dna模板1.0μl。
26.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，每20μl pcr反应体系中含：金牌mix(green)17μl、10μmol/l的f引物1μl、10μmol/l的r引物1μl、100～200ng/μl的dna模板1.0μl；其中f引物进行了荧光修饰。
27.作为本发明的一个实施方案，步骤s2、s3中，pcr扩增程序为：98℃变性2in；98℃10sec、60℃10sec、72℃10sec，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
28.第三方面，本发明还提供了前述的不结球白菜ssr分子标记引物组在不结球白菜种质资源遗传多样性分析或品种亲缘关系鉴定中的应用。
29.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
30.(1)现有技术中往往需要20多对及以上的引物来进行不结球白菜品种的区别，且即便如此，往往仅能区别比较少(如50个以内)的不结球白菜品种，鉴定效率较低、成本高；且在一些情况下，其鉴定的不结球白菜品种均来自同一家育种公司，品种数量及表型多态性存在一定不足，筛选出的引物组合极可能无法很好地应用于不结球白菜品种鉴定中。而本发明采用9对引物对区别169个品种，显著提高了鉴定效率，鉴定的准确度，还节省了成本。
31.2)本发明从dna提取方法、pcr反应体系、pcr扩增程序、电泳检测方法均针对不结球白菜进行了调整优化，从而达到最优的筛选效果；如引物设计上，本发明加入了荧光引物进行pcr扩增，再如电泳检测方法上，本发明采用了毛细管电泳。
附图说明
32.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
33.图1为不结球白菜品种聚类图。
具体实施方式
34.下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
35.实施例
36.本实施例利用ssr分子标记对收集的171份不结球白菜种质资源进行遗传多样性及其亲缘关系分析，筛选可用于品种鉴定的引物组合；具体如下：
37.1材料与方法
38.1.1试验材料
39.试验材料包括166份不结球白菜品种(表1)，3份甘蓝型油菜，于2020年9月28日播种于上海市农业科学院庄行基地，采集供试材料的幼嫩叶片，用冰盒保存带回实验室。
40.表1供试材料表
41.42.43.44.45.46.47.[0048][0049]
1.2试验方法
[0050]
1.2.1小白菜dna的提取使用tsingke植物dna提取试剂盒(通用型)，按操作说明进行。
[0051]
1.2.2dna纯度和浓度检测采用紫外分光光度计检测dna：取dna样品1μl，用微量紫外分光光度计(美国thermo nanodropnd
‑
2000c)测定样品，记录260、280nm的样品光密度(od)值，用od260/od280判断所提取dna的质量。
[0052]
1.2.3ssr引物染色体定位
[0053]
从参考文献及数据库(http://www.brassica.info/resource/markers.php)中获
取ssr引物1273对，从ncbi数据库下载不结球白菜的基因组序列信息，用dnaman进行引物序列匹配，确定扩增序列所在染色体。
[0054]
1.2.4引物筛选与电泳检测
[0055]
从已确定染色体位置的引物中挑选出140对，用9份不同类型不结球白菜进行引物筛选，其中152、153、139为菜薹变种，42、43和44为普通白菜变种，165、166和103为塌菜品种。所用ssr引物由北京擎科生物科技有限公司上海分公司合成。合成的时候所有正向引物f的5’端加上通用tag的16个碱基的引物序列cagtcgggcgtcatca seq id no.81，第一次扩增dna时片段就多带一段tag序列。第二轮筛选扩增条带理想的pcr产物进行荧光引物pcr，用的引物就是tag修饰引物和各自对应的反向r引物。用tag的修饰引物，带tag序列的f引物，r引物共3条引物可以一起多重扩增达到目的，用最后扩增良好的荧光pcr产物进行3730xl测序仪检测，得到的数据进行genemapper软件分析，根据分析结果，判断不同引物是否具体片段多态性。
[0056]
每20μlpcr反应体系中，金牌mix(green)16.45μl、f引物(10μmol/l)0.15μl、tag序列的f引物、r引物(10μmol/l)各1.2μl、dna模板(100～200ng/μl)1.0μl。
[0057]
pcr扩增程序为：98℃变性2in；98℃10sec、60℃10sec、72℃10sec，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
[0058]
1.2.5品种鉴定引物筛选
[0059]
重新合成筛选出来有多态性的40对引物，其中f引物进行荧光修饰，分别加上fam、hex、rox和tamra四种荧光标记的一种，对全部样品进行pcr扩增。每20μlpcr反应体系中，金牌mix(green)17μl、f引物(10μmol/l)1μl、r引物(10μmol/l)各1μl、dna模板(100～200ng/μl)1.0μl。扩增程序同引物筛选。
[0060]
1.2.6电泳检测pcr扩增产物用琼脂糖凝胶检测(2μl样品 6μl溴酚蓝)，在恒压300v条件下电泳12h，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度。取0.5μl样品模板与10μlmix混合后上abi 3730测序仪进行毛细管电泳。
[0061]
1.3数据处理与分析
[0062]
用软件gene mapper 4.1进行数据准确位点的分析，分析数据按照引物对应关系的核心碱基重复数来确定位点准确大小。应用ntsys
‑
pc(version2.1)软件处理，得到遗传相似系数，采用非加权平均法(upgma)进行聚类分析，并根据遗传相似系数建立聚类图(图1)。
[0063]
2结果与分析
[0064]
2.1不结球白菜引物初步筛选结果
[0065]
140对引物中，有13对没有扩增产物，18对只有1条带，26对只有2条带，20对有3条带，最多的引物可产生14条带，平均每对引物产生3.38条带。最后初步筛选出每条染色体上4对引物，共40对引物用于不结球白菜品种鉴定(表2)。
[0066]
表2不结球白菜品种鉴定的ssr引物初筛结果
[0067]
[0068][0069]
2.2不结球白菜品种鉴定引物筛选
[0070]
40对引物在169个品种中共扩增出476个多态性位点，每对引物的多态性条带数从3～34之间，平均11.9个，其中有效等位基因数为150.2个(表3)，shannon信息指数变化范围0.5967～2.869。由于部分引物等位基因数较多，具有较强的分辨率，结合2对引物(brgms802和ra2
‑
f04)可区分111个品种，3对引物(brms
‑
006、ra2
‑
f04和fito438)可区分151个品种，在此基础上再增加一对引物cnu_m289a则可以鉴别165个品种，仅需5对引物就
可以区分所有的实验品种，而且有8种引物组合均可区分所有品种，这8种组合理论上可以鉴定1.3
×
107～1.6
×
108个品种。其中cnu_m327a、fito438、brgms70、brms
‑
027、ra2
‑
f04分别位于3、4、5、6、8号染色体上，组合后理论上可以鉴定9.4
×
107个品种。8种组合共涉及9对染色体，分别是ra2
‑
f04、brgms70、fito438、brms
‑
027、brgms4497、cnu_m289a、cnu_m288a、brgms4536、cnu_m327a，推荐这9对引物为不结球白菜品种鉴定引物(表4)，这一组合理论上可区分1.8
×
10
13
个品种。
[0071]
40对引物扩增结果用于计算166个不结于白菜品种间的遗传相似系数，结果表明遗传相似性系数范围为0.777～0.996，平均值为0.864，表明不结球白菜尽管3种类型间形态差异较大，但品种间的遗传多样性较狭窄，其中16与90、25与89两对品种的遗传相似系数高达0.996。
[0072]
表3不结球白菜ssr引物多态性信息
[0073]
[0074]
[0075][0076]
表4不结球白菜ssr品种鉴定引物信息
[0077]
序号引物基因型数量1ra2
‑
f04552brgms70463fito438434brms
‑
027235brgms4497146cnu_m289a417cnu_m288a218brgms4536169cnu_m327a36
[0078]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。