一种基于EST-SSR分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法与流程

一种基于est
‑
ssr分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法
技术领域
1.本发明属于植物生物学领域，涉及一种植物品种的鉴定方法，具体来是一种基于est
‑
ssr分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法。


背景技术：

2.随着我国经济社会发展的不断深入，生态文明和美丽中国建设的不断推进，人们对观赏植物品种多样性的需求与日俱增。杜鹃花是杜鹃花科 (ericaceae)杜鹃花属(rhododendron)的重要植物类群，是我国十大名花之一，具有重要的经济价值和观赏价值，在城市绿化、庭院美化中占据重要地位。目前，全世界杜鹃花属植物约967种，品种已经超过3万种，其中，大多品种是以杂交育种的方式培育的。我国由于引种驯化工作开展较晚，目前国家林业和草原局植物新品种办公室审定授权的杜鹃花新品种刚刚突破百种。为了缩短与国外杜鹃花育种水平的差距，迫切需要加快新品种培育的步伐。但是杜鹃花是异花授粉的木本植物，幼龄期较长，从播种到开花需要3
‑
10年不等，在杂种育种过程中又容易受到外来花粉污染的影响，造成真假后代混杂的情况。如果这些假杂种不能及时筛选和清除，必然会造成大量土地、人力和物力的浪费，降低育种效率。因此，杂种真实性的早期鉴定是杜鹃花育种过程非常重要的环节。目前，杂交子代鉴定的方法主要有形态学鉴定、细胞学标记鉴定、生化标记鉴定、分子标记鉴定等。
3.随着分子技术的不断发展，分子标记以其快速准确的优势逐渐在杂交子代鉴定中崭露头角，特别是第三代分子标记est
‑
ssr(expressed sequencestags
‑
simple sequence repeats)因共显性遗传、重复性好、通用性好等优点，被认为是一种较为理想的鉴定杂交种的方法。目前，杜鹃花est
‑
ssr引物相继被开发，但是进一步的研究主要集中在引物通用性和物种遗传多样性分析上，而针对杜鹃花杂交子代鉴定的研究未见相关报道。考虑可能是因为目前杜鹃花 est
‑
ssr引物数量有限，且page银染检测读带效率低，易受主观因素影响，无法进行大量杂交子代的鉴定工作。毛细管电泳荧光检测技术可以得到目标dna 片段的准确大小，灵敏度高、重复性好，适用于大批量样品检测。目前，已经在百合、火龙果(hylocereus undulatus britt.)、豌豆(pisumsativum l.) 等众多植物的ssr检测中有较好的应用。本研究拟利用est
‑
ssr分子标记结合毛细管电泳荧光检测技术对3个杜鹃花杂交组合及88个f1代植株进行杂种鉴定和遗传多样性研究，在辨别杂交子代真实性同时筛选出几对能够快速、准确、高效鉴别杂种的核心引物，为杜鹃花杂交子代早期鉴定提供便捷可靠的方法，以期提高杜鹃花杂交育种工作效率，为加快杜鹃花杂交新品种培育进程奠定基础。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于est
‑
ssr分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法，所述的这种基于est
‑
ssr分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法要解决现有技术中对于杜鹃花杂交子代的鉴定方法过程复杂，准确率
不高的技术问题。
5.本发明提供了一种基于est
‑
ssr分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法，采用下面的引物对杜鹃花杂交品种的样品进行扩增，然后利用荧光毛细管电泳方法对所有供试样品的扩增条带进行比对，通过比较鉴定杜鹃花杂交品种。
[0006][0007]
进一步的，在鉴定的过程中，pcr扩增体系为：
[0008]
①
梯度pcr反应体系为20μl:超纯水7.4μl，上下游引物各0.8μl，上下游引物的浓度为2.5μmol/l，dna样品1μl，pcrmix10μl；
[0009]
②
梯度pcr反应程序：94℃预变性5min，94℃变性20s，退火30s，72℃延伸1min，72℃保持10min，4℃保存；
[0010]
2)琼脂糖凝胶电泳：
[0011]
用1
×
tae电泳缓冲液制备质量体积百分比浓度为2％的琼脂糖凝胶，将2μl 的pcr扩增产物在凝胶板上进行点样，电压220v，电泳时间20min；
[0012]
3)荧光毛细管电泳
[0013]
将1μlpcr扩增产物、10.41μl高浓度去离子甲酰胺和0.05μl分子量内标liz500，混匀后加入96孔板，94℃变性5min，冰水冷却1min,
‑
20℃冰箱5min，使用测序仪进行毛细管电泳，对检测结果进行读取分析；
[0014]
如果后代的扩增带具有父系特有的条带，则它们是真正的杂种；反之，是自交或伪杂交种。
[0015]
进一步的，采用下面的引物对杜鹃花杂交品种的样品进行扩增，然后利用荧光毛细管电泳技术对所有供试样品的扩增条带进行比对，通过比较鉴定杜鹃花杂交品种。
[0016][0017][0018]
本发明还提供了一种用于鉴定映山红亚属杜鹃花杂交品种的试剂盒，含有如下的引物序列：
[0019]
[0020]
附图说明
[0021]
图1杂合型条带；注1)从上到下依次是父本、母本和子代。
[0022]
图2父本型条带；注1)从上到下依次是父本、母本和子代。
具体实施方式
[0023]
1.1材料和方法
[0024]
1.1.1实验材料
[0025]
试验样品于2019年4月采自于浙江省宁波市北仑万景杜鹃良种园。分别是杜鹃花品种
‘
紫鹤’与
‘
红苹果’、
‘
紫波’与
‘
麒麟’、
‘
白鹤’与
‘
粉红泡泡’3组杂交组合的亲本及稳定开花的88个杂交f1代植株，见表。采集当年生枝条上新鲜完整的幼嫩叶片3
‑
4片置于冰盒内带回实验室，于硅胶干燥剂中干燥保存，作为dna提取的材料。
[0026]
表1杜鹃花杂交组合
[0027][0028]
1.1.2实验方法(dna提取全过程中所使用的试剂均由《dneasy植物核酸提取试剂盒》提供,为市售产品)
[0029]
1.1.2.1 dna提取
[0030]
(1)样品预处理采集新鲜完整的当年生枝条上幼嫩叶片3
‑
4片置于塑封袋内并做好标记，统一将所有样品至于冰盒内保存。将叶片带回实验室后迅速放置硅胶干燥剂中吸水干燥，置于常温保存。
[0031]
(2)叶片dna提取
[0032]
用dneasy植物核酸提取试剂盒(qiagen gmbh公司生产)对杜鹃花叶片dna 进行提取的。操作步骤如下：
[0033]
1)称取30mg叶片干样置于2ml离心管中并加入3粒钢珠。加入液氮速冻后置于研磨仪中研磨2min；
[0034]
2)取出研磨仪中的离心管放置冰盒中，加入400μl ap1和4μl rnasea 后置于65℃的水浴锅中预热10min,期间每隔3min进行充分混匀；
[0035]
3)离心管中加入130μl缓冲液p3混匀后置于冰盒5min。
[0036]
4)将离心管按顺序放置离心机中，以14000rpm的速度运行5min。
[0037]
5)用移液器取上清液置qi ashredder mini离心柱(紫色)中，下接2ml 离心管，将离心管按顺序放置在离心机中，以14000rpm的速度运行2min。
[0038]
6)用移液器将混合溶液转移置新的离心管中，加入600μl缓冲液aw1并充分混匀，静置2
‑
3min。
[0039]
7)用移液器吸取650μl混合溶液置dneasy mini离心柱(白色)中，下接2ml离心管，将离心管按顺序放置在离心机中，以10000rpm的速度运行1min 后倒掉离心后的溶液。
[0040]
8)将剩余混合溶液加入离心管中，重复7)的操作。
[0041]
9)将离心柱移至新的离心管中并加入500μl缓冲液aw2溶液，将离心管按顺序放置在离心机中，以10000rmp的速度运行1min后倒掉离心后的溶液。
[0042]
10)向离心柱内加入500μl缓冲液aw2溶液，离心管按顺序放置在离心机中，以14000rmp的速度运行2min后倒掉离心后的溶液。
[0043]
11)将离心柱放置新的离心管中后加入100μl缓冲液ae静置5min，将离心管按顺序放置在离心机中，以10000rmp的速度运行1min。
[0044]
12)重复操作11)
[0045]
13)将收集的溶液放置4℃冰箱中备用。
[0046]
(3)dna纯度检测与琼脂糖电泳检测
[0047]
1)当dna的样品中含有苯酚、蛋白质或其他小分子等污染物时，就会影响 pcr的反应，可以利用分光光度计对dna样品进行检测。如果dna样品中od260/od280＝1.8，则意味着样品中的其他杂质较少；如果dna样本中 od260/od280＞2.0，则表明可能存在rna污染；如果dna样品中的od260/od280 ＜1.6，有可能存在蛋白质污染或酚类等污染的情况；如果dna样品中的2＜ od260/od280＜2.5时，则表明dna样品中存在残余核苷酸、氨基酸、苯酚和其他盐和小分子。
[0048]
2)在1％(质量体积百分比(g/ml))的琼脂糖中加入3μl的superred核酸染料制成凝胶。取2μldna溶液加入2μl溴酚蓝，将混合溶液用移液器添加至凝胶的点样孔中，在1
×
tae电泳缓冲液中以120v的电压进行40
‑
50min电泳, 待蓝色条带迁移至琼脂糖凝胶的2/3处停止。取出凝胶后在g
‑
box紫外线照射下检测电泳条带并拍照，观察dna条带情况。
[0049]
1.1.2.2引物设计
[0050]
引物设计的原则如下：
[0051]
在ncbi核酸数据库中下载全部杜鹃相关的est序列(截至2019年11月)；利用cd
‑
hit
‑
est在线软件除去已下载序列中冗余序列；利用mias软件对ssr 位点进行筛选。筛选标准是单碱基重复次数大于18，二碱基重复次数大于9，三碱基复次数大于5，四碱基以上重复单元其重复次数大于4，复合碱基ssr位点之间碱基最长为100bp；对ssr位点进行筛选，筛选标准：ssr位点长度大于20bp，小于100bp，ssr位点距离侧翼长度大于100bp；利用primer
‑
blast进行引物设计，设计条件：ssr位点距离侧翼长度大于50bp,扩增产物大小在100
‑
250bp，退火温度在57
‑
63℃，引物长度在18
‑
22bp，gc含量在45％
‑
55％；利用oligo7 对引物进行评价，确保引物无发夹结构，无二聚体，无错配；设计好的引物在 ncbi数据库进行blast对比验证，除去无效引物。
[0052]
1.1.2.3引物筛选及评价
[0053]
除了自主设计引物(如下)，从已经发表的文献中筛选了30个杜鹃花est
‑
ssr 引物进行评价，见表。
[0054]
表2文献中筛选的引物
[0055][0056]
[0057]
[0058]
[0059][0060]
[0061][0062]
将设计出的引物(19对)和文献中选取的引物(30对)一起委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成和荧光毛细管电泳，根据实验结果筛选出条带清晰、多态性好的通用性引物用于杜鹃花亲缘关系分析和子代鉴定。
[0063]
(1)pcr扩增体系和电泳体系
[0064]
1)pcr扩增体系
[0065]
①
梯度pcr反应体系(20μl):超纯水7.4μl，上下游引物各0.8μl(浓度为2.5μmol/l)，dna样品1μl，pcrmix10μl。
[0066]
②
梯度pcr反应程序：94℃预变性5min，94℃变性20s，退火(tm
±
5℃) 30s，72℃延伸1min，72℃保持10min，4℃保存。
[0067]
2)琼脂糖凝胶电泳
[0068]
用1
×
tae电泳缓冲液制备2％的琼脂糖凝胶，将2μl的pcr扩增产物在凝胶板上进行点样，电压220v，电泳时间20min。
[0069]
3)荧光毛细管电泳
[0070]
将1μlpcr扩增产物、10.41μl高浓度去离子甲酰胺(hidi)和0.05μl 分子量内标liz500，混匀后加入96孔板，94℃变性5min，冰水冷却1min,
‑
20℃冰箱5min。使用abi3730xl测序仪进行毛细管电泳，利用genemarkerv3.0.1对检测结果进行读取分析。
[0071]
1.1.2.4杂交子代真实性检测
[0072]
筛选出的est
‑
ssr引物可以在亲代之间产生特定的带，具有高稳定性和多态性，用于杜鹃花的后代样本的真实性鉴别分析。如果后代的扩增带具有父系特有的条带，则它们是真正的杂种。在其他情况下，它们可能是自交或伪杂交种，需要其他引物来鉴定和分析。
[0073]
1.1.3数据分析
[0074]
利用genemarker软件读取荧光毛细管电泳实验结果，通过比对扩增片段荧光信号与分子量标准品的差异，按比例得到个信号处片段大小，存入excel中。利用dataformater把原始数据转换成分析软件可以读取的数据格式，利用 popgen32和powermarker软件分析引物等位基因数(number of alleles,na)、有效等位基因数(number of effective alleles，ne)、观测杂合度(observedheterozygosity,ho)、期望杂合度(expected heterozygosity，he)、nei’s 遗传多样性指数(h)、shannon’s信息指数(i)和多态信息含量(pic)。
[0075]
(1)等位基因数(na)：某个位点上扩增出现在不同长度片段的总数；
[0076]
(2)有效等位基因数(ne):反应群体遗传变异大小的指标；
[0077]
(3)观测杂合度(ho):任意抽取的两样本之间等位基因不同的概率。计算公式：
[0078]
h
o
＝a
÷
b(公式1)
[0079]
(a是杂合个体总数；b是样本总数。)
[0080]
(4)期望杂合度(h
e
):通过理论计算得出的杂合度。计算公式：
[0081][0082]
(n是等位基因总数,p
i
指的是第i个等位基因所展示的基因频率)
[0083]
(5)nei`s遗传多样性指数(h):根据群体之间不同基因所占的比例计算遗传距离，分析遗传多样性的指标。计算公式：
[0084][0085]
(p
ik
为i个等位基因在所有基因中的出现频率)
[0086]
(6)shannon’s信息指数(i):代表群体中遗传多样性的指数。计算公式：
[0087]
i＝∑(p
i
×
lnp
i
)
ꢀꢀ
(公式4)
[0088]
(7)多态信息含量(pic)：表示群体中微卫星dna多态性水平的高低。计算公式：
[0089][0090]
(n表示等位基因总数；式子中字母p
i
、p
j
是第i和第j位基因的基因频率)
[0091]
(当pic＞0.5，0.25≤pic≤0.50，pic＜0.25时，分别代表多态性的高、中、低)
[0092]
1.2结果与分析
[0093]
1.2.1引物设计和筛选
[0094]
(1)利用primer
‑
blast进行引物设计，最终选出18个ssr位点(ncbi数据库可以下载)，共设计出54条引物；
[0095]
[0096][0097]
(2)利用oligo7对引物进行评价，同时在ncbi数据库进行blast对比验证，除去无效引物，最终选出19对est
‑
ssr引物进行后续实验。
[0098]
[0099][0100]
结合30对文献中挑选出的est
‑
ssr引物对所有供试杜鹃花样品进行dna片段扩增。
[0101]
(3)利用powermarker对亲本的扩增条比对时发现，当母本
×
父本扩增条带出现bb
×
aa、bc
×
aa、aa
×
ab、ac
×
ab、cc
×
ab、cd
×
ab这6种带型时，引物具备鉴定杂交子代的潜力。在对88个杂交子代的带型进行分析发现，子代带型可以分成4种：杂合型、父本型、母本型、其他型。杂合型是指后代包含父母双方的特定带；父本型是指后代包含父本的特定带，但不包含母本的特定带。母本型是指后代包含父本的特定带，但不包含分本的特定带；其他型相对比较复杂，有些子代都产生了新的条带。其中，可以判别样品为真杂种的带型为杂合型和父本型，见图1和图2。根据这个标准，最终筛选出15对引物可作为杜鹃花杂交子代鉴定的引物，见表3。
[0102]
(4)通过15对引物对6个亲本和88个子代的实验结果可以发现，利用这 15对est
‑
ssr引物在94份样品中进行dna扩增，结果分析见表4。15对引物多态位点百分比是100％，共扩增出95个等位基因，na为6.3333，ne为3.9622，观测等位基因数和有效等位基因数存在较大差距，说明等位基因在群体内的分布不均匀；多态信息含量(pic)变化范围为0.8925(s14)—0.2400(s9)，平均值为0.5767，其中r13、r14、r15、r26、r28、s1、s10、s14和s19的pic ＞0.5000，引物多态性较高，可作为子代鉴定核心引物的备选。
[0103]
表3 15对杜鹃花est
‑
ssr引物信息
[0104]
[0105][0106]
表4 15对est
‑
ssr引物的多态性
[0107]
[0108][0109]
1.2.2杂交子代真实性鉴定
[0110]
利用荧光毛细管电泳技术对所有供试样品的扩增条带进行了比对，根据检测结果可以说明，所有供试样品均为真子代。在实验过程中发现，有的引物在某些杂交组合中表现优异，在某些组合中却没有鉴别能力，说明这些引物通用性不足，见表5，但是有的引物具有很强的鉴别能力，如引物s14、s1、r29、r28和r26 的鉴别数量在全部子代数量的一半以上且在3个杂交组合中均具有较好的通用性。所以，以这5对引物作为杜鹃花子代鉴定的核心引物，在杂交子代真实性检测时可以核心引物为基础，采用多标记联合鉴定法完成子代鉴定，见表6。根据鉴定结果可知，
‘
紫鹤
’ב
红苹果’组合最少可以用2对引物进行子代鉴定，
‘
紫波
’ב
麒麟’和
‘
白鹤
’ב
粉红泡泡’两个杂交组合均可以用1对引物进行子代鉴定。3个杂交组合中所有供试杂交子代均为真杂种，最少用2对引物就可以完成鉴定。
[0111]
表5 15对杜鹃花est
‑
ssr辨别子代数量统计
[0112][0113]
表6杜鹃花子代联合标记鉴定
[0114]
[0115][0116]
1.3讨论
[0117]
1.3.1引物设计和筛选
[0118]
本发明节共筛选出15对多态性丰富的est
‑
ssr引物。在引物筛选的过程中发现，母本
×
父本的带型中有6种带型(bb
×
aa、bc
×
aa、aa
×
ab、ac
×
ab、cc
ꢀ×
ab、cd
×
ab)的引物具有鉴别杂交子代的潜力，但是每种带型的鉴别效率不同。本研究中引物s1和s14是cd
×
ab带型，鉴别最高的鉴别率，分别是95.45％、 97.73％，说明cd
×
ab带型鉴别效率最高，可以作为杂交子代鉴定引物的首选，这和雷雨等研究结果一致。在子代鉴定过程中，利用最少的引物鉴定更多的物种是引物优化的方向，这就需要引物具备良好的多态性和通用性。est
‑
ssr位于基因转录的编码区域，所以序列更保守，通用性更高，虽然比genomic
‑
ssr引物多态性有所降低，但是一些研究表明，在遗传多样性的评价方面两者之间没有显著差异。在本次试验中文筛选出的15对引物的平均等位基因数(na)、shannon’s 信息指数(i)和多态信息含量(pic)分别为6.3333、1.2977和0.5767，表现出丰富而稳定的多态性，尤其是s14、s1、r29、r28和r26这5对引物效率最高，可作为核心引物进行杂交子代的筛选工作，有助于不同杂交组合甚至于远缘杂交组合的遗传多样性分析和分子标记辅助育种鉴定。ests是来自不同组织器官或不同发育阶段的cdna随机挑选克隆产生的序列，如果筛选过程中获得与某一性状连锁的est
‑
ssr，则该标记可能与控制这一性状的基因有关。如引物s1涉及的est
‑
ssr就源自对比冷驯化和非冷驯化的杜鹃花的cdna文库，该引物与杜鹃抗寒能力的关联性有待进一步挖掘。同时，针对杜鹃花的其他抗性特征也可以构建出cdna文库进行est
‑
ssr筛选，例如：抗盐碱、抗高温等。如果将est
‑
ssr 子代鉴定与标记辅助选择技术相结合，在杜鹃花发育的早期阶段进行筛选，就可以选出同时满足真实性和目标特性的优良子代，从而大大提高杜鹃花的育种效率。
[0119]
1.3.2杂交子代鉴定
[0120]
本发明利用est
‑
ssr荧光分子标记对所有供试映山红亚属杜鹃花样品进行杂种鉴定。由于传统的page银染技操作繁琐、耗时长，尤其是面对大批量、多批次实验时容易产生人为误差，而荧光毛细管技术能够准确得到扩增片段大小，灵敏度高、重复性好，适用于大批量杂交子代的检测，可以大大提高检测效率和准确性。est
‑
ssr更为保守的特点使其通用
性更高，有助于揭示不同基因型之间的遗传关系，甚至在不同的种、属和科之间都具备很好的通用性。这样的特性用于杜鹃花杂交子代鉴定往往能有效提高引物的使用效率。从试验结果中可以发现，
‘
紫鹤
’ב
红苹果’组合最少可以用2对引物进行子代鉴定，
‘
紫波
’ב
麒麟’和
‘
白鹤
’ב
粉红泡泡’两个杂交组合均可以用1对引物进行子代鉴定。而对于这3个杂交组合中所有杂交子代进行完全鉴定时，却只需要 2对引物，说明筛选出的引物在3个杂交组合中具有良好的通用性。为保证结果的可靠性，每个杂交子代至少要被2对引物鉴别为真时才能确定真杂种，因此本研究中所有杂交子代需要4对引物即可完成准确鉴定。
[0121]
同时表明利用est
‑
ssr荧光分子标记在杜鹃杂种的鉴定上是可行的，对于改善育种效率有重要的价值。但是，由于本次试验涉及的样本数量有限，只能在一定程度上反应引物的鉴别能力。今后可以在此基础上继续扩大试验范围，增加更多杂交组合和杂交子代，验证引物的通用性和鉴别能力。