一株克雷伯氏菌S1-3菌株及其在降解塑料方面的应用

一株克雷伯氏菌s1-3菌株及其在降解塑料方面的应用
技术领域
1.本发明属于生物降解技术领域，更具体地，涉及一株克雷伯氏菌s1-3菌株及其在降解塑料方面的应用。


背景技术：

2.聚乙烯具有高分子量、疏水性、缺少微生物可作用的官能团等特点，导致聚乙烯在自然环境中降解极其缓慢，严重威胁环境、动植物和人类安全。现有主要采用光降解、高温裂解、催化裂解、微生物降解等方法对聚乙烯进行污染治理，其中微生物降解法由于具备在降解塑料时不会对环境造成二次伤害等优势，成为现今降解塑料的首选方法。
3.目前已报道的塑料降解菌主要有嗜热裂孢菌(thermobifidafusca)、绿脓假单胞菌(pseudomonasaerugi nose)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、波茨坦短芽胞杆菌(brevibacillus borstelensis)、链霉菌属(streptomyces)、施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)与粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)等(r.s d,r.r,k.k,a.r a,v.r k.investigation of biodegradation potentials of high density polyethylene degrading marine bacteria isolated from the coastal regions of tamil nadu,india[j].marine pollution bulletin.2019,138.)，但现有技术中尚未有克雷伯氏菌在降解塑料方面的相关报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明针对现有技术的不足，首要目的是提供一株克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株，为降解塑料的制剂提供一种新的选择。
[0005]
本发明的另一目的是提供上述克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株在降解塑料中的应用。
[0006]
本发明的又一个目的是提供一种生物降解剂。
[0007]
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0008]
本发明提供了一株克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株，于2021年12月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：62163，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0009]
本发明从广东省湛江市高桥镇红树林自然保护区采集沉积物样品，分离、筛选得到菌株s1-3，并通过形态鉴定(革兰氏染色)和分子鉴定(16s rdna基因测序、系统发育树鉴定)，确定菌株s1-3属于克雷伯氏菌属，并将其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)。
[0010]
本发明试验发现所述克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株不仅可减少塑料的质量，对塑料的降解率达到了3.68～3.92％，还可通过使塑料表面产生羟基和发生氧化来改变塑料表面的官能团，以改变塑料的内部结构，从而实现对塑料的有效降解，因此，上述克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株在降解塑料中的应用应在本发明的保护范围之内。
[0011]
优选地，所述降解塑料包括减少塑料的质量和/或改变塑料的内部结构。
[0012]
进一步优选地，所述改变塑料的内部结构包括改变塑料表面的官能团，如使塑料表面产生羟基和/或发生氧化等。
[0013]
优选地，所述塑料包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、丙烯腈
─
丁二烯
─
苯乙烯共聚合物中的一种或几种。
[0014]
最优选地，所述塑料为聚乙烯。
[0015]
此外，本发明还提供了一种生物降解剂，该生物降解剂含有尚述克雷伯氏菌s1-3菌株和/或其发酵液，与塑料共同接种能以塑料为碳源和能源物质，保持正常生长代谢，不仅对塑料的降解率达到了3.68～3.92％，还可通过使塑料表面产生羟基和发生氧化来改变塑料表面的官能团，以改变塑料的内部结构，从而实现对塑料的有效降解。
[0016]
本发明具有以下有益效果：
[0017]
本发明所提供的克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株不仅可减少塑料的质量，对塑料的降解率达到了3.68～3.92％，还可改变塑料的内部结构，从而实现对塑料的有效降解。
附图说明
[0018]
图1是油镜下克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的形态照片。
[0019]
图2是克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的系统发育树。
[0020]
图3是克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的生长曲线。
[0021]
图4是对照组聚乙烯的ftir图谱。
[0022]
图5是实验组聚乙烯的ftir图谱。
具体实施方式
[0023]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0024]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0025]
一、液体培养基
[0026]
(1)mm30液体培养基
[0027]
s1.配制mixture44溶液，具体成分为：na2b4o7·
10h2o 17.7mg/100ml，cuso4·
5h2o 39.2mg/100ml，cacl2·
6h2o 20.1mg/100ml，znso4·
7h2o 1095mg/100ml，edta 250mg/100ml，100～150μl/100ml浓h2so4(其中，浓硫酸是为了防止产生沉淀)；
[0028]
s2.配制微量金属盐溶液，具体成分为：edta 0.5mg/100ml，caco
3 1mg/100ml，feso4·
7h2o 0.5mg/100ml，mgso4·
7h2o 10mg/100ml，mnso4·
h2o 10mg/100ml，mixture44 10ml/100ml；
[0029]
s3.配制大量元素溶液，具体成分为：(nh4)2so
4 1g/l，kh2po
4 3g/l，na2po
4 6g/l，微量金属盐溶液0.5ml/l，并用hcl与naoh协同调节ph至7.1。
[0030]
(2)lb液体培养基
[0031]
lb液体培养基的组成如表1所示。
[0032]
表1 lb液体培养基的组成
[0033][0034]
二、固体培养基
[0035]
(1)lb琼脂培养基
[0036]
lb液体培养基中加入1.8％琼脂，经高压蒸汽灭菌(121℃，0.1mpa)20min后，倒入培养皿中，待冷却凝固后备用。
[0037]
(2)mm30固体培养基
[0038]
mm30液体培养基中加入1.8％琼脂，经高压蒸汽灭菌(121℃，0.1mpa)20min后，倒入培养皿中，待冷却凝固后备用。
[0039]
实施例1克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的分离和筛选
[0040]
s1.从广东省湛江市高桥镇红树林自然保护区采集得到沉积物样品，带回实验室，取沉积物样品10g装入三角瓶中，加入90ml的无菌蒸馏水，充分振摇15分钟后，取1ml加入到mm30固体培养基中，并加入低密度聚乙烯(pe)粉末0.2g，在32℃的恒温震荡培养箱中以180r/min的转速持续震荡培养，每隔7d取1ml转移到新的mm30固体培养基中，连续传代5～7代；
[0041]
s2.取10μl菌液，用无菌pbs稀释10-5
倍，吸取500μl稀释后的菌液涂布在以聚乙烯为唯一碳源的固体培养基中，在35℃培养48h后，挑取不同形态菌落接种于lb琼脂培养基中，在35℃培养48h后，继续稀释并接种在以聚乙烯为唯一碳源的固体培养基中，直至得到单一菌落，将该菌落的菌株命名为菌株s1-3。
[0042]
实施例2克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的鉴定和保藏
[0043]
一、克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的鉴定
[0044]
(1)形态鉴定：
[0045]
采用油镜对革兰氏染色后的菌株s1-3进行形态鉴定，如图1所示，可见，菌株s1-3为革兰氏阴性菌，油镜下观察到粉红色球形，呈单个或成对存在的球形，成团块状或方形排列。
[0046]
(2)基因测序：
[0047]
将菌株s1-3接种于lb琼脂培养基中，培养48h后，取2ml菌液以8000rpm/min的转速离心后收集菌体，利用tianamp bacteria dna kit(tiangen)试剂盒提取菌株基因组dna。以提取的菌株总dna为模板，使用细菌通用引物进行扩增，将pcr产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序，得到菌株s1-3的16s rdna序列如seq id no.1所示。
[0048]
seq id no.1：
[0049]
tgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcgataaggttaataaccttgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggt
gcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggatta
[0050]
(3)系统发育树：
[0051]
经过blast对比，根据选择参考序列的原则，挑选出了部分相似度在98～100％之间的同源序列，使用mega 7.0软件建立系统发育树，并通过距离法中的neighbor joining(邻位归并法)构建系统发育进化树，bootstrap参数设置为1000，得到图2的聚类图，可知菌株s1-3与klebsiella pneumoniae最为接近，因此可以确定菌株s1-3属于克雷伯菌属(klebsiella pneumoniae)。
[0052]
二、克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的保藏
[0053]
克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株于2021年12月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：62163，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0054]
实施例3克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株对塑料的降解作用
[0055]
一、克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的生长情况
[0056]
1、实验方法
[0057]
取-80℃冰箱保存的克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株，活化后将其接种到lb培养基上，接种24h后，使用分光光度计测量od
600
值，并调节od
600
值至1。取4ml菌液与36ml mm30固体培养基共同接种于50ml广口锥形瓶中，然后加入0.2g低密度聚乙烯(pe)粉末,每隔24小时测量其od
600
值，观察克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株的生长情况，每组设定三个重复，克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株在以聚乙烯为唯一碳源的基础培养基中的生长曲线如图3所示。
[0058]
2、实验结果
[0059]
由图3可知，克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株对mm30固体培养基的适应性较好，菌株s1-3生长到12h就进入对数期，96h进入稳定期，168h进入衰亡期，说明菌株s1-3可利用pe作为碳源和能源物质进行正常的生长代谢。
[0060]
二、克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株对聚乙烯的降解
[0061]
1、降解体系
[0062]
实验组：取-80℃冰箱保存的克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株，活化后将其接种到lb培养基上，接种24h后，使用分光光度计测量od
600
值，并调节od
600
值至1。取4ml菌液与36ml mm30固体培养基共同接种于50ml广口锥形瓶中，然后加入0.2g低密度聚乙烯(pe)粉末。
[0063]
对照组：将4ml生理盐水加入到36ml mm30固体培养基中。
[0064]
两组分别在32℃、150r/min的培养箱内连续培养60天，终反应体系一直维持在40ml，每组设定三个重复。
[0065]
2、降解情况
[0066]
(1)克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株可减少聚乙烯的质量
[0067]
将实验组聚乙烯分别用磷酸缓冲液(ph＝7)冲洗，去除表面多余的培养基与细菌
后，用2％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液浸泡2小时，温蒸馏水冲洗去除多余sds，再用2％的戊二醛固定液浸泡2h,50％乙醇超声两次(每次30分钟)后，加入75％乙醇静置12h，100％无水乙醇超声3次(每次30分钟)，超声结束后将聚乙烯烘干至恒重，最后用万分之一天平称重，按以下公式计算聚乙烯的失重率：聚乙烯失重率(％)＝(聚乙烯原始重量-降解后聚乙烯重量)/聚乙烯原始重量*100％，结果如表2所示。
[0068]
表2聚乙烯的失重情况
[0069] 原始重量/g降解后重量/g失重率/％重复组10.02170.02093.68％重复组20.02580.02483.88％重复组30.03060.02943.92％
[0070]
由表2可知，克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株与聚乙烯共同接种60天后，对聚乙烯的降解率达到3.68～3.92％，说明克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株可有效减少聚乙烯的质量，实现对聚乙烯的降解。
[0071]
(2)聚乙烯基团的改变
[0072]
将实验组和对照组的聚乙烯分别用磷酸缓冲液(ph＝7)冲洗，去除表面多余的培养基与细菌后，用2％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液浸泡2小时，温蒸馏水冲洗去除多余sds，再用2％的戊二醛固定液浸泡2h,50％乙醇超声两次(每次30分钟)后，75％乙醇过夜，100％无水乙醇超声3次(每次30分钟)，超声结束后将聚乙烯烘干至恒重，最后用傅里叶变换红外光谱仪对实验组和对照组的聚乙烯分别进行红外透射吸收实验，测定聚乙烯基团的改变，结果如图4、5所示，其中，图4是对照组聚乙烯的ftir图谱，图5是实验组聚乙烯的ftir图谱。
[0073]
由图4可知，对照组的红外光谱图中，2920cm-1
、2853cm-1
、1466cm-1
、1373cm-1
和721cm-1
处存在明显的吸收峰，其中，2920cm-1
、2853cm-1
的吸收峰为烷烃-ch2中c-h的伸缩振动所致，1466cm-1
的吸收峰为烷烃-ch2中c-h的面内弯曲振动所致，721cm-1
处较强的吸收峰为烯烃c-h的摇摆振动所致，充分表明该材料为典型的聚乙烯结构。
[0074]
由图5可知，实验组的红外光谱图中发生了两处变化：(1)相比对照组，3600～3300cm-1
处的吸收峰更强，此处的吸收峰为o-h的伸缩振动所致，说明在被克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株降解后，聚乙烯表面产生了羟基；(2)1720cm-1
处出现了比较强的吸收峰，为c＝o的伸缩振动所致，说明聚乙烯表面发生了氧化。这两处变化均表明了克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株可使塑料表面产生羟基和发生氧化，以改变塑料表面的官能团，说明菌株s1-3可使塑料内部结构发生变化，从而实现对聚乙烯的有效降解。
[0075]
综上，本发明所述克雷伯氏菌(klebsiella sp.)s1-3菌株不仅可减少塑料的质量，对塑料的降解率达到了3.68～3.92％，还可改变塑料的内部结构，从而实现对塑料的有效降解。
[0076]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。