一种葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点的SNP分子标记及其应用

一种葡萄霜霉病抗性相关的qtl位点的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种葡萄霜霉病抗性相关的qtl位点的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.霜霉菌(plasmopara viticola)引起的霜霉病可以侵染葡萄多个器官，侵染部位以叶片为主，个别情况下也会侵染果实和新梢等其它部位，发病严重时可以造成叶片干枯脱落、果实变软易碎、嫰梢卷须死亡，给全世界葡萄产业造成了巨大的损失，在大部分产区均为葡萄第一大病害。
3.霜霉菌的防治主要采用喷施化学药剂的方法。众所周知，化学药品对环境安全、食品安全以及人类的安全都有很大的潜在风险，而频繁使用化学药剂也容易造成霜霉菌的耐药性，给病害防治带来更大的难度。
4.选育抗霜霉病的新品种可以从根本上解决这一问题。传统葡萄育种一般需要10-15年，而且新品种的选育多是以选育者的主观判断为标准，具有很大的不稳定性。定位抗性qtl位点，从中挖掘与抗病性连锁的分子标记并应用于辅助筛选育种可以在苗期对杂交后代进行筛选提高筛选的效率，同时利用不同分子标记靶向选育含有不同抗性种质的新品种则可以大大加快育种速度。


技术实现要素：

5.本发明提供一种葡萄霜霉病抗性相关的qtl位点的snp分子标记及其应用，可以大大加快育种速度。
6.第一方面，本发明提供了一种葡萄霜霉病抗性相关的qtl位点的snp分子标记，所述snp分子标记为chr14_14085672，位于14号染色体的第14085672位碱基，所述第14085672位碱基为a或g，该突变导致葡萄抗霜霉病能力产生变化，当该位置的碱基从g变成a时葡萄抗病性减弱，从a变成g时葡萄抗病性提高。
7.第二方面，本发明还提供了含有上述snp分子标记的检测试剂或试剂盒。
8.第三方面，本发明还提供了上述snp分子标记、或上述检测试剂或试剂盒在葡萄抗霜霉病辅助筛选育种中的应用。
9.第四方面，本发明还提供了检测上述snp分子标记的探针，所述探针是以上述snp分子标记为靶向位点设计，所述探针的碱基序列如seq id no.1所示，具体为：aatctagaattcagtctgcatttaaagtcagcagtacaaaattggaatcaaaccgatggaactttgcatgccttaatatcaaacataaactcaaaccataaaatgttcta。
10.第五方面，本发明还提供了含有上述探针的检测试剂或试剂盒。
11.第六方面，本发明还提供了上述探针、或上述检测试剂或试剂盒在葡萄抗霜霉病辅助筛选育种中的应用。
12.本发明利用507个snp分子标记构建了高密度分子遗传图谱，并定位了葡萄霜霉病
抗性qtl位点，开发出与其连锁的snp分子标记以及探针。利用与葡萄霜霉病抗性相关的snp分子标记以及探针，就能够预测葡萄对霜霉病的抗病性，当14号染色体的第14085672位碱基从g变成a时葡萄抗病性减弱，从a变成g时葡萄抗病性提高，进而可以快速筛选抗霜霉病葡萄用于葡萄抗霜霉病辅助筛选育种，辅助育种选择目标明确，提高了筛选效率，大大减少了所需时间和成本。
附图说明
13.图1是本发明实施例一中
‘
赤霞珠
’×’
18-1-5’杂交群体融合遗传图谱，其中：遗传距离采用kosambi函数计算，单位为cm；
14.图2是本发明实施例一中507个snp分子标记在遗传图谱和参考基因组物理图谱上位置线性对应关系，其中：x轴代表snp分子标记在遗传图谱上的位置，单位是cm；y轴代表snp分子标记在物理图谱上的位置，单位是mbp；
15.图3是本发明实施例二中葡萄叶盘抗霜霉菌等级分类标准，其中：1代表叶盘上孢子囊密度非常高，透过菌斑完全无法看到叶片；3代表叶盘孢子囊密度很高，但透过菌斑隐约能看到一点叶片；5代表孢子囊密度中等，透过长菌部位能清晰的看到叶片；7代表孢子囊密度很低，在叶片上只有零零散散几个地方有菌；9代表孢子囊密度极低或者没有孢子囊；
16.图4是本发明实施例二中杂交群体霜霉病抗性表型，其中，图中从左到右依次为201901、201902、202001、202001、202003、202003、202101、202102批次的杂交群体的霜霉病抗性表型；
17.图5是本发明实施例二中
‘
赤霞珠
’ב
18-1-5’群体霜霉病抗性qtl定位结果，表明本发明各批次样本中与葡萄霜霉病抗性相关的qtl位点为chr14-spd；
18.图6是本发明实施例三中杂交后代qtl数量与霜霉病抗性能力的对应关系图，其中，从左至右分别为cs、null、qtl和18-1-5的qtl数量与霜霉病抗性能力的对应关系。
具体实施方式
19.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
20.实施例一
21.高密度分子遗传图谱的构建：
22.s1、利用抗病葡萄品种
‘
18-1-5’与感病葡萄品种
‘
赤霞珠’杂交获得280粒种子，低温砂藏后萌芽167粒种子，经炼苗和真杂种鉴定之后获得114株杂交后代。
23.s2、利用ctab方法提取杂交后代和亲本高质量dna；
24.s3、从葡萄染色体上筛选足量snp标记，采用简并基因组测序获取杂交群体dna信息，从中开发507个可用于构建遗传图谱的snp标记。具体筛选步骤如下：
25.(1)基于亲本基因型检测结果，分析亲本间具有多态性snp标记，过滤掉父母本都为纯和的snp标记(例如在
‘
赤霞珠’中基因型为
‘
gg’，在
‘
18-1-5’中基因型为
‘
aa’的标记)，将其余标记分为7种多态类型：ab
×
cd、ab
×
cc、cc
×
ab、ef
×
eg、hk
×
hk、lm
×
ll和nn
×
np。
26.(2)参照亲本snp多态性分析结果，分析snp标记在子代中分布，并丢掉以下不符合要求的标记：
27.异常碱基过滤：在子代中出现亲本没有的碱基类型(例如：某个snp位点在亲本中基因型分别为
‘
aa’和
‘
tt’，而某些子代中出现
‘
a’和
‘
t’之外的碱基)。
28.完整度过滤：采用0.90的完整度过滤标记，即100个子代中至少需要有90个子代有确定基因型的标记。
29.偏分离标记过滤：偏分离标记会影响图谱构建的精度以及后续qtl定位的准确性，因此采用卡方检验，对标记进行过滤，偏分离阈值为0.05。
30.s4、利用joinmap4.0软件构建
‘
赤霞珠
’ב
18-1-5’杂交群体高密度遗传图谱，具体步骤如下：
31.(1)点击菜单栏
‘
file’，从下拉菜单中选择
‘
new project’。
32.(2)保存
‘
.jmp’文件。
33.(3)点击菜单栏
‘
dataset’，从下拉菜单中选择
‘
creat new dataset’。
34.(4)在
‘
pop.name’处添加图谱名称，在
‘
nr.of loci’处填写标记数量，在
‘
nr.of indiv’处填写子代数量，
‘
pop.type’选择
‘
cp’模型。
35.(5)将需要构建遗传图谱的snp标记输入到excel中。
36.(6)将excel中数据拷贝到
‘
内容与数据’部分
‘
dataset’中。
37.(7)点击菜单栏
‘
dataset’，从下拉菜单中选择
‘
highlight errors’，检查填入数据是否有错误。
38.(8)点击菜单栏
‘
dataset’，从下拉菜单中选择
‘
create population node’，产生群体节点。
39.(9)选择
‘
similarity of individuals’，点击工具栏中
‘
calculate button’，检查是否有相似度为1的个体。
40.(10)选择
‘
individual genot.freq’，点击工具栏中
‘
calculate button’，浏览每个个体中snp标记信息缺失情况，去除snp标记缺失太多的子代。
41.(11)选择
‘
similarity of loci’，点击工具栏中
‘
calculate button’，检查snp标记之间相似度，去除相似度0.95以上的标记。
42.(12)选择
‘
locus genot.freq’，点击工具栏中
‘
calculate button’，浏览每个标记在子代中分布情况，去除含有缺失带型太多的标记，同时观察每个标记偏分离情况，丢掉在0.05水平上呈显著差异的偏分离标记。
43.(13)选择
‘
groupings(tree)’，点击工具栏中
‘
calculation options’，在对话框中点击
‘
population’，选择
‘
independence lod’计算连锁群。选择lod＝7作为连锁群阈值。
44.(14)在上一步对话框中点击
‘
regression mapping’，选择回归作图中
‘
kosambi’s’函数计算连锁群中标记之间遗传距离，
‘
rec.freq’小于0.4作为连锁阈值。
45.最终得到高密度分子遗传图谱，含507个snp分子标记，总遗传距离为1443.88cm，标记间平均遗传距离为2.92cm。图谱信息如图1和表1所示。
46.表1
‘
赤霞珠
’ב
18-1-5’杂交群体融合遗传图谱详细信息
[0047][0048]
在此基础上将构建好的高密度分子遗传图谱与参考基因组进行共线性分析，如图2所示，发现19条连锁群均呈现较好的共线性，由此，本实施例构建的高密度分子遗传图谱，可以用于下一步qtl定位。
[0049]
实施例二
[0050]
葡萄霜霉病抗性相关的qtl定位分析：
[0051]
s1’、在5月上旬从亲本及每个单株上采集第5-6片完全展开的嫩叶；取回后用无菌水冲洗2遍，将叶表面杂质洗净后用打孔器将洗净后叶片分离成直径1cm的叶盘；将灭过菌的滤纸平铺到一次性无菌培养皿上，并用无菌水打湿；每个单株采集16个叶盘，并将叶盘背面朝上摆放在盛有湿润滤纸的培养皿上，然后用无菌滤纸将叶盘背面水分吸净；将霜霉菌孢子囊浓度调成105个/ml，然后在每个叶盘上滴20微升；在22℃，12h/12h光周期条件下培养24小时后将菌液吸掉，然后继续培养；接菌后4-6天分别拍照用作后续评价霜霉菌抗性。
[0052]
为评价霜霉菌的抗性表型，本实施例采用孢子囊密度法计算离体叶盘霜霉病抗性，如图3所示。每个单株的抗性表型值均用16个叶盘的平均值代表。
[0053]
经过2019-2021连续3年的表型统计，如图4所示，发现杂交后代对霜霉病抗性在每一年均呈现连续分布，这表明该群体霜霉病抗性表型是由数量性状位点决定的。
[0054]
s2’、分析s4构建的高密度分子遗传图谱和s1’鉴定的抗霜霉病表型，本实施例采用mapqtl6.0进行qtl分析，如图5所示，在14号连锁群上分别得到1个与葡萄霜霉病抗性相
关的qtl位点，chr14-spd。
[0055]
实施例三
[0056]
葡萄霜霉病抗性相关的qtl位点的snp分子标记的筛选：
[0057]
s1”、将杂交后代按照qtl区域snp分子标记单体型进行分类并计算抗性平均值。在14号染色体qtl位点区域中标记chr14_14085672连锁能力最强。经过分析测序原始数据，chr14_14085672位于14号染色体14085672bp位置，在
‘
赤霞珠’中碱基类型为aa，在
‘
18-1-5’中碱基类型为ga，其中碱基g是抗性筛选的标志碱基，14号染色体14085672bp位置的碱基突变导致葡萄抗霜霉病能力产生变化，当该位置的碱基从g变成a时葡萄抗病性减弱，从a变成g时葡萄抗病性提高。这个snp分子标记的抗性碱基可以分别作为各自qtl位点的筛选标记用于后续分析。
[0058]
chr14_14085672的探针序列为：aatctagaattcagtctgcatttaaagtcagcagtacaaaattggaatcaaaccgatggaactttgcatgccttaatatcaaacataaactcaaaccataaaatgttcta。
[0059]
s2”、将获得的这个snp分子标记(chr14_14085672)结合到一起在子代中分析qtl位点与霜霉病抗性的对应关系，如图6所示。当子代同时含有这个qtl位点时抗霜霉病水平可以达到抗性亲本
‘
18-1-5’对霜霉病抗性水平的89-97％。这表明利用这个qtl位点筛选杂交群体后代可以迅速的找到抗性单株，加快育种速度。
[0060]
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明实施例进行了较为详细的说明，但是本发明实施例不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。