一种富集新月柄杆菌分泌的holdfast的方法与流程

1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种富集新月柄杆菌分泌的holdfast的方法。


背景技术：

2.目前面世的粘性材料主要为化学合成材料，然而随着化学合成工艺日渐成熟，粘性材料的性能提升也遇到了瓶颈。自然界中存在很多天然粘性物质，比现有的化学粘性材料强度更高，新月柄杆菌(caulobacter crescentus)能够分泌一种超高粘性的物质-holdfast(characterization of the adhesive holdfast of marine and freshwater caulobacters)，研究表明，holdfast的粘性强度可达68n/mm2。holdfast具有良好的防水性、耐腐蚀性、生物相容性、多界面适用性。但是由于其分泌量小，难以富集，目前尚无大量制备holdfast的方法。
3.新月柄杆菌的生长周期比一般细菌较长，约16-24小时，而holdfast的分泌阶段一般只占其生长周期的四分之一。已知holdfast的分泌受鞭毛接触刺激影响，在培养过程中菌体互相粘连成菌团会导致holdfast更难分离，同时在纯化holdfast的过程中难以去除菌体物质的污染。除了菌体自身粘连造成的难以分离holdfast，培养容器的内壁上也容易粘附大量菌体，影响holdfast的富集效率。
4.使用微球富集新月柄杆菌holdfast可以提升菌体接触刺激，分泌更多holdfast；然而常规微球由于自发沉降造成holdfast与菌体的分离困难。现有研究中富集holdfast的方法为棉片吸附，该方法富集量大，但存在着分离纯化难、棉片成分对后续分析有影响等缺点。单分散磁性微球具有多种材质、粒径，在水中分散性好，容易与新月柄杆菌充分接触发生粘附作用。而且由于其磁性特征，可以通过磁力架进行吸附洗涤，因此成为富集新月柄杆菌holdfast的最佳材料。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种富集新月柄杆菌分泌的holdfast的方法。
6.一种富集新月柄杆菌分泌的holdfast的方法，按照如下步骤进行：
7.(1)使用磁性微球与新月柄杆菌共培养；
8.(2)使用磁力架将富集了分泌holdfast的新月柄杆菌的磁性微球与与未分泌holdfast的新月柄杆菌分离；
9.(3)提纯并获得holdfast。
10.所述磁性微球内含磁性fe3o4，外包材质为聚苯乙烯，粒径20μm。
11.所述共培养的条件为温度25-35℃、转速150-250rpm、离心力1.0-1.4g。
12.步骤(2)所述分离方法为：将培养结束的磁性微球菌液倒入40-60ml离心管中并置于磁力架上，8-12s内匀速翻转8-12次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中菌液；加入40-60ml去离子水，盖上管盖，拿起离心管翻转8-12次洗涤磁性微球，再次
放入磁力架，8-12s内匀速翻转8-12次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中液体，重复洗涤2-4次。
13.步骤(3)所述提纯方法为：
14.(1)将洗涤后的磁性微球用1ml的pbs重悬，转移至1.5ml离心管中；
15.(2)在离心管中加入溶菌酶至终浓度为8-12mg/ml，于37℃孵育28-32min，离心移除上清；
16.(3)用1ml的甲醇重悬微球，于超声清洗仪中超声20-40min以使甲醇充分溶解holdfast；
17.(4)离心吸取上清，得到holdfast的甲醇溶液。
18.所述pbs的ph为6.0-7.0。
19.本发明的技术原理：单分散磁性微球具有多种材质和粒径，在水中分散性好，可以有效提高新月柄杆菌接触效率，促进诱导holdfast分泌。利用磁性特征，可在磁力架上吸附富集并洗涤微球表面杂质。将洗涤后的微球用溶菌酶处理可除去粘附在微球上的菌体，使holdfast留在微球上。最后使用有机溶剂甲醇超声清洗微球，提取holdfast，并通过蒽酮-硫酸法检测糖含量，相当于holdfast含量。
20.本发明的有益效果：本发明揭示一种基于磁性微球共培养的高粘性物质的富集方法，所述高粘性物质为新月柄杆菌分泌的粘性物质-holdfast。该holdfast是目前已知最高粘性的天然物质，但分泌量小、分离困难，单分散磁性微球使得新月柄杆菌更容易接触粘附在球体表面，可以高效的富集holdfast。本发明使用特定材质和粒径的微球，并对材料、粒径、共培养、富集、纯化等各种条件进行了优化，以达到holdfast的良好富集效果。
附图说明
21.图1为磁性微球复合新月柄杆菌荧光观察；
22.a：微球白光照；b：微球荧光照；
23.c：微球复合新月柄杆菌白光照；d：微球复合新月柄杆菌荧光照。
具体实施方式
24.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
25.实施例1
26.本实施例筛选出了一种特定材质的磁性微球，该微球的粒径和材质：粒径20μm、内含磁性fe3o4、外包材质为聚苯乙烯。
27.一种富集新月柄杆菌分泌的holdfast的方法，包括如下步骤：
28.(1)配制pye培养基(peptone 2.0g，yeast extract 1.0g，mgso47h2o 0.2g，tap water 1000ml)；
29.(2)将培养基分装至250ml锥形瓶中，每瓶50ml，分别加入微球至终浓度0.1mg/ml，于121℃、0.1mpa灭菌30min；
30.(3)在微球培养基中接种od
600
读数为0.5的新月柄杆菌菌液100μl，于30℃、
200rpm、离心力1.16g条件下培养14h；
31.(4)取20μl培养后菌液，用纯水稀释至100μl，加入0.1mg/ml的wga-fitc荧光染料2μl，室温避光孵育15min，于荧光显微镜下观察holdfast粘附情况(图1)；
32.(5)将培养结束的磁性微球菌液倒入50ml离心管中并置于磁力架上，10s内匀速翻转10次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中菌液；
33.(6)加入50ml去离子水，盖上管盖，拿起离心管翻转10次洗涤磁性微球，再次放入磁力架，10s内匀速翻转10次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中液体，重复洗涤3次；
34.(7)将洗涤后的磁性微球用1ml的pbs(ph6.5)重悬，转移至1.5ml离心管中；
35.(8)在离心管中加入溶菌酶至终浓度为10mg/ml，于37℃孵育30min，离心移除上清；
36.(9)用1ml的甲醇重悬微球，于超声清洗仪中超声30min以使甲醇充分溶解holdfast；
37.(10)离心吸取上清，即为holdfast的甲醇溶液。
38.实施例2
39.一种富集新月柄杆菌分泌的holdfast的方法，包括如下步骤：
40.(1)配制pye培养基(peptone 2.0g，yeast extract 1.0g，mgso47h2o 0.2g，tap water 1000ml)；
41.(2)将培养基分装至250ml锥形瓶中，每瓶50ml，分别加入微球至终浓度0.1mg/ml，于121℃、0.1mpa灭菌30min；
42.(3)在微球培养基中接种od
600
读数为0.5的新月柄杆菌菌液100μl，于28℃、200rpm、离心力1.16g条件下培养12h；
43.(4)取20μl培养后菌液，用纯水稀释至100μl，加入0.1mg/ml的wga-fitc荧光染料2μl，室温避光孵育15min，于荧光显微镜下观察holdfast粘附情况；
44.(5)将培养结束的磁性微球菌液倒入50ml离心管中并置于磁力架上，8s内匀速翻转8次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中菌液；
45.(6)加入50ml去离子水，盖上管盖，拿起离心管翻转8次洗涤磁性微球，再次放入磁力架，8s内匀速翻转8次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中液体，重复洗涤2次；
46.(7)将洗涤后的磁性微球用1ml的pbs(ph6.5)重悬，转移至1.5ml离心管中；
47.(8)在离心管中加入溶菌酶至终浓度为8mg/ml，于37℃孵育25min，离心移除上清；
48.(9)用1ml的甲醇重悬微球，于超声清洗仪中超声25min以使甲醇充分溶解holdfast；
49.(10)离心吸取上清，即为holdfast的甲醇溶液。
50.实施例3
51.一种富集新月柄杆菌分泌的holdfast的方法，包括如下步骤：
52.(1)配制pye培养基(peptone 2.0g，yeast extract 1.0g，mgso47h2o 0.2g，tap water 1000ml)；
53.(2)将培养基分装至250ml锥形瓶中，每瓶50ml，分别加入微球至终浓度0.1mg/ml，
于121℃、0.1mpa灭菌30min；
54.(3)在微球培养基中接种od
600
读数为0.5的新月柄杆菌菌液100μl，于32℃、200rpm、离心力1.16g条件下培养14h；
55.(4)取20μl培养后菌液，用纯水稀释至100μl，加入0.1mg/ml的wga-fitc荧光染料2μl，室温避光孵育18min，于荧光显微镜下观察holdfast粘附情况；
56.(5)将培养结束的磁性微球菌液倒入50ml离心管中并置于磁力架上，12s内匀速翻转12次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中菌液；
57.(6)加入50ml去离子水，盖上管盖，拿起离心管翻转12次洗涤磁性微球，再次放入磁力架，12s内匀速翻转12次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中液体，重复洗涤4次；
58.(7)将洗涤后的磁性微球用1ml的pbs(ph6.5)重悬，转移至1.5ml离心管中；
59.(8)在离心管中加入溶菌酶至终浓度为10mg/ml，于37℃孵育35min，离心移除上清；
60.(9)用1ml的甲醇重悬微球，于超声清洗仪中超声35min以使甲醇充分溶解holdfast；
61.(10)离心吸取上清，即为holdfast的甲醇溶液。
62.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。