一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用。


背景技术：

2.猪乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。蚊子是乙型脑病毒的主要传播媒介。猪是乙型脑炎病毒的重要储存宿主和扩增宿主，是乙型脑炎的主要传染源。猪乙型脑炎主要变现为怀孕母猪繁殖障碍，公猪睾丸炎。目前，我国用于预防猪乙脑感染的疫苗主要是经鼠脑组织培养制备的灭活疫苗、地鼠肾原代细胞和vero细胞制备的灭活疫苗。鼠脑组织和地鼠肾原代细胞制备的疫苗，在生产中存在实验动物来源紧张、生产成本高、产量低、外源因子多、批次差异大等缺点。vero细胞制备的灭活疫苗解决了生产成本和稳定性问题，但是vero细胞为非猪源细胞，存在外源因子污染的问题，对疫苗的品质存在一定的缺陷。基于地鼠肾原代细胞和vero细胞(非洲绿猴肾细胞)对乙脑的病毒的生产应用，目前国内外尚未有猪源性肾细胞在乙脑病毒上的研究，为了克服现有技术的不足之处，寻找到一株适合乙脑病毒繁殖的猪源性肾细胞将为猪乙脑的防控带来积极的影响。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于弥补现有技术空白，建立一种自发永生化的猪原代肾小球系膜细胞系，并将其应用于猪乙型脑炎病毒的培养中，为猪乙型脑炎疫苗原代细胞生产方式提供技术储备。同时还可将该细胞系应用于猪瘟病毒和流行性腹泻病毒的培养。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
4.本发明提供的一种胎猪肾小球系膜细胞系，名称为pmc-3，分类名称为胎猪肾小球系膜细胞，已经于2021年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为cgmcc no.23099。
5.胎猪肾小球系膜细胞pmc-3cgmcc no.23099通过下述方式得到：
6.剖腹取怀孕90日龄的胎猪，取出完整的肾脏置于pbs溶液中，将肾脏浸泡于酒精中消毒2min，然后转移至pbs溶液中清洗3次。小心剥离被膜血管等多余组织，将肾脏纵向切开，去除肾脏髓质血管等中间白色组织。将剩余组织用眼科剪剪碎，加入1mlpbs后继续剪成碎块，用1ml断枪头转移至50ml离心管，然后用pbs反复清洗3次去除血细胞，至洗液澄清。将组织块少量多次转移至80目筛网，用注射器活塞塑料平端仔细研磨，边研磨边用pbs冲洗，将滤出液用100目网筛过滤。将过滤的液体转移至50ml离心管，1500r/min离心10min，弃上清，用0.05％～0.1％i型和0.05％～0.1％iv型胶原酶重悬肾小球，消化40min～1h。用100μm细胞筛网过滤消化液，然后1500r/min离心5min。弃上清，用细胞生长培养基(dmem/f12 10％fbs 1％双抗)重悬细胞，视细胞量铺t25细胞培养瓶，每瓶5ml培养液，置于培养箱中进行培养。在倒置显微镜下观察，细胞在24h即有少量贴壁，补加2ml培养液，贴壁培养48h-72h增殖明显，进行换液培养。细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，pbs洗三遍，加入
0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，使用细胞生长培养基终止消化，细胞按照1:2的比例进行传代，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
7.此时获得的胎猪肾小球系膜细胞中含有一些肾小球内皮细胞。需通过细胞差速消化法对胎猪肾小球系膜细胞进行纯化，在细胞传代时，吸去培养液，pbs洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当大部分肾小球系膜细胞变圆脱落时，大概消化时间为2min，加入细胞生长培养基终止消化，离心后使用细胞生长培养基重悬细胞，换新的细胞培养瓶进行培养，如此反复三次，以去除肾小球内皮细胞，得到纯化的肾小球系膜细胞，然后通过单克隆方法对纯化的细胞进行再次纯化并挑选细胞生长状态好的胎猪肾小球系膜细胞进行继代培养。
8.当传代细胞传代超过60代时，获得自发永生化的胎猪肾小球细胞pmc-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.23099。
9.本发明的效果：
10.本发明利用90日龄胎猪肾小球进行原代培养、纯化并连续传代，最终获得一株纯度高、能稳定传代的自发永生化胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3，该细胞系第60代的细胞仍保持原代细胞的形态特征，核型分析表明连续传代后细胞没有发生染色体变异。该细胞系对猪乙型脑炎病毒高度易感，接毒后72h，细胞病变达到70％～80％，收获的病毒液病毒含量为10
7.5
pfu/ml，比vero细胞培养的猪乙型脑炎病毒相比，具有收毒时间快、效价高的特点。同时该细胞系还可以用于猪瘟病毒和流行性腹泻病毒的培养及流行性腹泻病毒的分离等，具有广泛的应用价值。
附图说明
11.图1是本发明实施例提供的纯化的胎猪肾小球系膜细胞pmc-3照片。a:第5代；b:第30代；c:第60代。
12.图2是本发明实施例提供的胎猪肾小球系膜细胞pmc-3间接免疫荧光鉴定示意图。a:hoechst33342染核；b:抗波形蛋白抗体荧光标记；c:merger
13.图3是本发明实施例提供的胎猪肾小球系膜细胞pmc-3核型分析结果染色体配对示意图。
14.图4是本发明实施例提供的胎猪肾小球系膜细胞pmc-3第60代细胞周期分布示意图。
15.图5是本发明实施例提供的乙型脑炎病毒(sa14-14-2株)在vero细胞和胎猪肾小球系膜细胞pmc-3上的病变情况。a1:正常vero细胞培养48h对照；a2:vero细胞接乙型脑炎病毒后24h病变情况；a3:vero细胞接乙型脑炎病毒后48h病变情况；a4:ver细胞接乙型脑炎病毒后72h病变情况；a5:vero细胞接乙型脑炎病毒后96h病变情况。b1:正常胎猪肾小球系膜细胞pmc-3培养48h对照；b2:胎猪肾小球系膜细胞pmc-3接乙型脑炎病毒后24h病变情况；b3:胎猪肾小球系膜细胞pmc-3接乙型脑炎病毒后48h病变情况；b4:胎猪肾小球系膜细胞pmc-3接乙型脑炎病毒后72h病变情况；b5:胎猪肾小球系膜细胞pmc-3接乙型脑炎病毒后96h病变情况。
16.图6是本发明实施例提供的猪瘟ns3多克隆抗体间接免疫荧光照片。a:猪瘟ns3多克隆抗体间接免疫荧光；b:正常细胞对照。
17.图7是本发明实施例提供的猪流行性腹泻病毒在vero细胞和胎猪肾小球系膜细胞pmc-3上的病变情况。a1:正常vero细胞培养48h对照；a2:vero细胞接猪流行性腹泻病毒后48h病变情况；a3:vero细胞接猪流行性腹泻病毒后72h病变情况；b1:正常胎猪肾小球系膜细胞pmc-3细胞培养48h对照；b2:胎猪肾小球系膜细胞pmc-3细胞接猪流行性腹泻病毒后48h病变情况；b3:胎猪肾小球系膜细胞pmc-3细胞接猪流行性腹泻病毒后96h病变情况。
具体实施方式
18.实施例1、胎猪肾小球系膜细胞系的获得方法
19.1.胎猪肾小球系膜细胞的分离及培养：剖腹取未分免的胎猪，取出胎猪完整的肾脏置于pbs溶液中，将肾脏浸泡于酒精中消毒2min，然后转移至pbs溶液中清洗3次。小心剥离被膜血管等多余组织，将肾脏纵向切开，去除肾脏髓质血管等中间白色组织。将剩余组织用眼科剪剪碎，加入1mlpbs后继续剪成碎块，用1ml断枪头转移至50ml离心管，然后用pbs反复清洗3次去除血细胞，至洗液澄清。将组织块少量多次转移至80目筛网，用注射器活塞塑料平端仔细研磨，边研磨边用pbs冲洗，将滤出液用100目网筛过滤。将过滤的液体转移至50ml离心管，1500r/min离心10min，弃上清，用0.05％～0.1％i型和0.05％～0.1％iv型胶原酶重悬肾小球，消化40min～1h。用100μm细胞筛网过滤消化液，然后1500r/min离心5min。弃上清，用细胞生长培养基(dmem/f12 10％fbs 1％双抗)重悬细胞，视细胞量铺t25细胞培养瓶，每瓶5ml培养液，置于培养箱中进行培养。在倒置显微镜下观察，细胞在24h即有少量贴壁，补加2ml培养液，贴壁培养48h-72h增殖明显，进行换液培养。细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，pbs洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，使用细胞生长培养基终止消化，细胞按照1:2的比例进行传代，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
20.2.胎猪肾小球系膜细胞的纯化：获得的胎猪肾小球系膜细胞中含有一些肾小球内皮细胞。利用系膜细胞和内皮细胞对胰蛋白酶敏感性不同的特点，通过细胞差速消化法对胎猪肾小球系膜细胞进行纯化，在细胞传代时，吸去培养液，pbs洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当大部分肾小球系膜细胞变圆脱落时，大概消化时间为2min，加入细胞生长培养基终止消化，离心后使用细胞生长培养基重悬细胞，换新的细胞培养瓶进行培养，未消化的内皮细胞仍然留着细胞瓶上，如此反复三次，以去除肾小球内皮细胞，得到纯化的肾小球系膜细胞。
21.3.单克隆细胞的筛选及培养：采用有限稀释法在96孔板里进行，对消化的细胞悬液进行细胞计数后，使用细胞生长培养基10倍梯度稀释细胞悬液，稀释到10个细胞/ml，将稀释好的细胞加入到96孔板里，0.1ml/孔，挑选仅含有单个细胞的细胞孔，进行标记，共标记4株细胞，分别标记为mesc-1、mesc-2、pmc-3、mesc-4。在37℃、5％co2培养箱内培养，待细胞生长至80％～90％融合时，扩大培养。扩大培养的顺序为96孔板、48孔、24孔板、12孔板、6孔板、25cm2细胞瓶、75cm2细胞瓶。在传代扩大培养期间淘汰生长不良和不能稳定传代的细胞株，最终获得了一株纯度高、能稳定传代的自发永生化胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3，该细胞系第60代的细胞仍保存原代细胞的形态特征(图1)。
22.该自发永生化胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3已经于2021年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保
藏编号为cgmcc no.23099。
23.实施例2、间接免疫荧光法鉴定细胞类型
24.1.细胞爬片：在24孔细胞培养板孔内放置无菌的盖玻片，将胎猪肾小球系膜细胞pmc-3用胰酶消化成单个细胞，细胞计数后调整细胞浓度为2
×
105个/ml，每孔加入1ml细胞悬液。置于37℃5％co2培养箱中培养过夜。
25.2.固定：细胞爬片后，吸去培养基，用pbs(0.01mol/l，ph7.2)洗3次，每次3～5min，加入4％多聚甲醛磷酸缓冲液，4℃固定30min。弃去固定液，自然风干。用pbs洗3次，每次3～5min。
26.3.破膜封闭：取50μl破膜封闭液(0.5％trition x-100与pbs1:1混合，再加10％血清)滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。pbs洗3次，每次3～5min。
27.4.一抗孵育：破膜封闭后，加入1:100倍稀释的anti-vimentin antibody[v9]-cytoskeleton marker(abcam，货号8089)50μl于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上，放入湿盒内，4℃过夜。pbs洗3次，每次3～5min。
[0028]
5.二抗孵育：弃去pbs，室温避光孵育1:1000倍稀释的fitc goat anti-mouse lgg h&l(abcam，货号6785)2h后，pbs洗3次，每次3～5min。
[0029]
6.染核：用终浓度为5μg/l的hoechst33342，室温染色3～5min。pbs洗3次，每次3～5min。荧光显微镜下观察，照相。
[0030]
波形蛋白在系膜细胞细胞质中表达量高，系膜细胞可与波形蛋白抗体产生特异性免疫反应，本案例选用波形蛋白9(v9)单抗来鉴定该细胞，用hoechst33342染核。结果如图2所示，经过纯化，细胞形态单一，且细胞均可与v9抗体产生特异性免疫反应，细胞纯净。
[0031]
实施例3、染色体核型分析
[0032]
1.将胎猪肾小球系膜细胞pmc-3置于37℃、5％co2培养箱中培养，培养68h时，加入秋水仙素，使秋水仙最终浓度达到0.25μg/ml，温箱中继续培养5～6h使细胞分裂停止在中期相；
[0033]
2.制备染色体玻片：
[0034]
2.1收集细胞：倒掉细胞瓶中的培养基，pbs洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当大部分中期细胞变圆脱落时，终止消化，收集细胞移入15ml的离心管内，1000r/min离心10min，弃上清液，留细胞沉淀物；
[0035]
2.2低渗处理：加入经37℃预热的0.075m kcl低渗液5ml。用吸管吹匀，使细胞悬浮于低渗液中，置37℃水浴中处理20min；
[0036]
2.3预固定：加入新配制的1ml甲醇：乙酸(3∶1)固定液，轻轻吹匀，1000r/min离心10min，弃上清液；
[0037]
2.4第一次固定：沿管壁加入固定液5ml，用吸管轻轻吹匀，在室温下静置15min，以1000r/min离心10min，弃上清液；
[0038]
2.5第二次固定：加固定液5ml，室温下再固定15min，1000r/min离心10min，弃上清液；
[0039]
2.6制片：加固定液0.4ml，重悬细胞。在预先经冰冻冷却的载玻片上，每片滴加2～3滴细胞悬液，火焰固定。
[0040]
2.7染色：取1张制备好的染色体标本片子，将1ml giemsa(用ph7.4磷酸缓冲稀释
10倍)注入，染色15～20min，水冲洗，室温空气干燥。
[0041]
3.染色体核型分析：
[0042]
在分裂相区域滴加pbs后，镜检，照相，使用video test.karyo染色体核型分析系统进行核型分析。
[0043]
正常猪体细胞有19对染色体。染色体核型分析结果显示，本发明获得的自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞含有19对38条染色体(图3)，没有发生染色体条数变异。
[0044]
实施例4、细胞周期分析
[0045]
应用流式细胞术分析自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞pmc-3第60代的生长周期，具体步骤如下：
[0046]
1.将培养的细胞用0.25％的胰酶消化下来，终止后用1000r/min离心5min，用pbs洗一遍，1000r/min离心5min，弃上清。
[0047]
2.-20℃预冷的70％乙醇逐滴加入细胞中，边加边漩涡混匀。-20℃冷冻细胞过夜。
[0048]
3.离心去除乙醇，再用pbs洗2遍，1000r/min离心5min，弃上清。
[0049]
4.加入500μlpi(终浓度为50μg/ml)染液37℃孵育15min，进行流式细胞仪分析。
[0050]
细胞周期检测结果如图4所示，细胞处于g1期、s期、g2期的比例分别是65.68％、28.19％、6.13％。本发明所制备的胎猪肾小球系膜细胞pmc-3s期所占比例为28.19％，说明其分裂增殖能力旺盛。
[0051]
实施例5、猪乙型脑炎病毒在胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3上的培养
[0052]
1.猪乙型脑炎病毒的培养
[0053]
选择细胞状态良好、生长致密、培养48h的vero细胞和胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3，弃去生长液，按1000pfu/ml接种量分别接种猪乙型脑炎病毒(sa14-14-2株)，37℃吸附90min(吸附期间每30min摇晃一次细胞瓶)，吸附后加入细胞维持液(含2％胎牛血清，ph7.5)置35℃、5％co2培养箱中继续培养，分别于接毒后24h、48h、72h、96h观察vero细胞和胎猪肾小球系膜细胞pmc-3的细胞病变并收获病毒液。
[0054]
2.病毒含量的测定
[0055]
采用病毒蚀斑测定方法测定病毒含量，具体方法如下：将毒液用培养基进行10倍系列稀释，稀释后接种于生长bhk-21细胞单层的12孔板内，每一稀释度毒液接种4孔，0.1ml/孔。病毒接种后于37℃吸附90min，加覆盖物(甲基纤维素)，5天后用结晶紫染色、固定，流水冲洗，干燥后计数各孔蚀斑数，进行病毒含量测定(logpfu/ml)。结果见表1和图5和所示。
[0056]
表1乙型脑炎病毒在vero细胞和肾小球系膜细胞上培养病毒含量测定
[0057][0058]
从以上结果可以看出，胎猪肾小球系膜细胞对猪乙型脑炎病毒高度敏感，接毒后72h细胞病变达到70％～80％，即可收毒，病变速度相比vero细胞提前了24h，同时收获的病毒液毒价可达到10
7.5
pfu/ml，与vero细胞培养的猪乙型脑炎病毒相比，具有收毒时间快，效价高的特点。
[0059]
实施例6、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒在胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3上的培养
[0060]
1.猪瘟病毒在胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3上的培养
[0061]
选择细胞状态良好的胎猪肾小球系膜胞系pmc-3，待细胞铺满80％左右时，弃去原培养液，加入细胞维持液(含1％fbs)，按培养体积的0.5％接种猪瘟病毒。37℃培养72h后，取样，更换细胞维持液，如此循环，至第6次收获。收获后的样品进行猪瘟ns3多克隆抗体间接免疫荧光。结果如表2、图6所示。
[0062]
胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3接种猪瘟病毒后，二收病毒含量已达到10
6.0
fid
50
/ml，六收时病毒含量维持在10
5.75
fid
50
/ml，胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3六收时细胞状态良好，没有出现凸起，脱离的情况。说明胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3对猪瘟病毒敏感，可以用于猪瘟病毒培养。
[0063]
表2猪瘟病毒在胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3上培养病毒含量的测定
[0064][0065][0066]
2.猪流行性腹泻病毒在胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3上的培养
[0067]
选择细胞状态良好、生长致密、培养48h的vero细胞和胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3，弃去生长液，按照5％的接毒剂量，分别接种猪流行性腹泻病毒，37℃吸附60min(吸附期间30min摇晃一次细胞瓶)，吸附后加入细胞维持液(含1％胎牛血清，6ug/ml胰酶的细胞培养液)置37℃、5％co2培养箱中继续培养，当细胞病变达到75％时，-80℃反复冻融三次后收获病毒液，离心或者过滤后收集上清即得病毒液，测定病毒含量。
[0068]
结果如图7所示，vero细胞接种pedv病变达到75％的时间为72h，毒价为10
7.2
tcid
50
/ml,胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3接种pedv病变达到75％的时间为96h，毒价为
10
8.43
tcid
50
/ml。虽然胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3接种pedv后病变时间较vero细胞延迟了24h，但是毒价有明显提高，说明胎猪肾小球系膜细胞系pmc-3对pedv敏感，可以用于猪流行性腹泻病毒的培养或分离。