一种重组工程菌及其构建方法和其应用与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种重组工程菌及其构建方法和其应用。


背景技术：

2.d-泛解酸内酯为用于合成维生素类药d-泛醇及神经营养药d-高泛酸钙的医药中间体，并用作饲料添加剂和日化产品的合成前体，年产量超过万吨。
3.常采用化学合成法制备dl-泛解酸内酯，再将制得的dl-泛解酸内酯经拆分转化为d-泛解酸内酯。微生物酶法拆分dl-泛解酸内酯获得d-泛解酸内酯包括下述步骤：1)微生物酶选择性水解dl-泛解酸内酯中的d-泛解酸内酯或者l-泛解酸内酯，得到l-泛解酸内酯和d-泛解酸或l-泛解酸和d-泛解酸内酯；2)利用有机试剂萃取混合液，实现l-泛解酸内酯和d-泛解酸的分离；3)d-泛解酸经过内酯化处理，得到d-泛解酸内酯，l-泛解酸内酯经过化学消旋重新变成dl-泛解酸内酯，再拆分。该方法存在下述缺陷：一是拆分步骤多，分离效率低；二是化学消旋过程会产生大量色素和其它杂质，拆分制得的d-泛解酸内酯颜色较深，外观品质较差；三是化学消旋会产生大量硫酸盐，形成固体废弃物，造成环境污染。
4.cn110423717a公开了一种多酶重组细胞及多酶级联催化合成d-泛解酸内酯的方法，该方法通过重组细胞表达l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，来转化d,l-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯、并进而生成d-泛解酸内酯。该方法存在下述缺陷：l-泛解酸内酯脱氢酶对l-泛解酸内酯及其催化反应的选择性差，其既催化l-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，也催化d-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，l-泛解酸内酯和d-泛解酸内酯同时竞争结合l-泛解酸内酯脱氢酶的活性位点，d-泛解酸内酯陷入循环反应，由此导致酶活力降低；当底物中l-泛解酸内酯含量较低时，无法和l-泛解酸内酯脱氢酶有效接触，难以完全转化，由此导致制得的产物中会含有l-泛解酸内酯而增加纯化难度，且产品质量难以保证。
5.为此，如何开发高选择性且利于提高d-泛解酸内酯的纯度和质量、反应效率和资源利用率等重组载体及其工程菌成为本领域迫切需要解决的方面。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种重组载体，所述重组载体含有l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示、葡萄糖脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示和d-泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示的重组载体。
7.本发明的优选技术方案中，l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示、葡萄糖脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示和d-泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.4分别在第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体和第四重组载体上。
8.本发明的优选技术方案中，所述重组载体任选地包括第五重组载体或第六重组载体的任一种，其中，第五重组载体包含l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示和酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，第六重组载体包含l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示、葡萄糖脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示和d-泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9.本发明优选的技术方案中，所述重组载体用于dl-泛解酸内酯制备d-泛解酸内酯。
10.本发明优选的技术方案中，所述l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因源自红串红球菌、红球菌、分支杆菌、诺卡氏菌、链霉菌、放线菌中的任一种。
11.本发明优选的技术方案中，所述l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到l-泛解酸内酯脱氢酶基因序列。
12.本发明优选的技术方案中，所述酶切位点选自xhoi、ndei的任一种或其组合。
13.本发明优选的技术方案中，所述l-泛解酸内酯脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因1，所述目的基因1的核苷酸序列如seq id no.1所示。
14.本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因源自木兰假丝酵母、小单孢菌、链霉菌中的任一种。
15.本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到酮泛解酸内酯还原酶基因序列。
16.本发明优选的技术方案中，酶切位点选自saci、noti的任一种或其组合。
17.本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶基因序列经人工合成制得目的基因2，所述目的基因2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
18.本发明优选的技术方案，所述葡萄糖脱氢酶编码基因源自伯克霍尔德菌、大肠杆菌、气单胞菌中的任一种。
19.本发明优选的技术方案中，所述葡萄糖脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到葡萄糖脱氢酶基因序列。
20.本发明优选的技术方案中，酶切位点选自xhoi、ndei的任一种或其组合。
21.本发明优选的技术方案中，所述葡萄糖脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因3，所述目的基因3的核苷酸序列如seq id no.3所示。
22.本发明优选的技术方案中，所述d-泛解酸内酯水解酶编码基因源自串珠镰孢霉菌、腐皮镰孢菌、镰刀霉菌中的任一种。
23.本发明优选的技术方案中，所述d-泛解酸内酯水解酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到d-泛解酸内酯基因序列。
24.本发明优选的技术方案中，酶切位点选自xhoi、ndei的任一种或其组合。
25.本发明优选的技术方案中，所述d-泛解酸内酯水解酶基因序列经人工合成制得目的基因4，所述目的基因4的核苷酸序列如seq id no.4所示。
26.本发明的优选技术方案中，所述密码子优化根据大肠杆菌的密码子偏好性进行。
27.本发明优选的技术方案中，用于重组的载体选自pet-21a质粒、pet-28a质粒、prsfduet-i质粒的任一种或其组合。
28.本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体的获得方法包括下述步骤：将l-泛
解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列克隆到第一载体中，得到第一重组载体。
29.本发明优选的技术方案中，所述第二重组载体的获得方法包括下述步骤：将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列克隆到第二载体中，得到第二重组载体。
30.本发明优选的技术方案中，所述第三重组载体的获得方法包括下述步骤：将葡萄糖脱氢酶编码基因或目的基因3或如seq id no：3所示的核苷酸序列克隆到第三载体中，得到第三重组载体。
31.本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：将d-泛解酸内酯水解酶编码基因或目的基因4或如seq id no：4所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
32.本发明优选的技术方案中，所述第五重组载体的获得方法包括下述步骤：将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列和酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，得到第五重组载体。
33.本发明优选的技术方案中，所述第五重组载体的获得方法包括下述步骤：先将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，再将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，得到第五重组载体。
34.本发明优选的技术方案中，所述第五重组载体的获得方法包括下述步骤：先将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，再将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，得到第五重组载体。
35.本发明优选的技术方案中，所述第六重组载体的获得方法包括下述步骤：将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列、酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列、葡萄糖脱氢酶编码基因或目的基因3或如seq id no：3所示的核苷酸序列、d-泛解酸内酯水解酶编码基因或目的基因4或如seq id no：4所示的核苷酸序列克隆到第六载体中，得到第六重组载体，其中，4种基因或核苷酸序列的克隆顺序并无先后之分。
36.本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包括能够表达l-泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、表达酮泛解酸内酯还原酶的第二重组载体、表达葡萄糖脱氢酶的第三重组载体和表达d-泛解酸内酯水解酶的第四重组载体的任一种或其组合；
37.和/或，所述重组工程菌包括能够共表达l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶的第五重组载体；
38.和/或，所述重组工程菌包括能够共表达l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶编码基因和d-泛解酸内酯水解酶的第六重组载体。
39.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌包含能够共表达l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶的第五重组载体和表达葡萄糖脱氢酶的第三重组载体。
40.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌中还包含表达d-泛解酸内酯水解酶的
第四重组载体，或者与表达d-泛解酸内酯水解酶的第四重组载体的第二重组工程菌联合使用。
41.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌用于dl-泛解酸内酯制备d-泛解酸内酯。
42.本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体包括l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因，优选的，所述l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因源自红串红球菌、红球菌、分支杆菌、诺卡氏菌、链霉菌、放线菌中的任一种。
43.本发明优选的技术方案中，所述l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到l-泛解酸内酯脱氢酶基因序列。
44.本发明优选的技术方案中，酶切位点选自xhoi、ndei的任一种或其组合。
45.本发明优选的技术方案中，所述l-泛解酸内酯脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因1，所述目的基因1的核苷酸序列如seq id no.1所示。
46.本发明优选的技术方案中，所述第二重组载体包括酮泛解酸内酯还原酶编码基因，优选的，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因源自木兰假丝酵母、小单孢菌、链霉菌中的任一种。
47.本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到酮泛解酸内酯还原酶基因序列。
48.本发明优选的技术方案中，酶切位点选自saci、noti的任一种或其组合。
49.本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶基因序列经人工合成制得目的基因2，所述目的基因2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
50.本发明优选的技术方案中，所述第三重组载体包括葡萄糖脱氢酶编码基因，优选的，所述葡萄糖脱氢酶编码基因源自伯克霍尔德菌、大肠杆菌、气单胞菌中的任一种。
51.本发明优选的技术方案中，所述葡萄糖脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到葡萄糖脱氢酶基因序列。
52.本发明优选的技术方案中，酶切位点选自xhoi、ndei的任一种或其组合。
53.本发明优选的技术方案中，所述葡萄糖脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因3，所述目的基因3的核苷酸序列如seq id no.3所示。
54.本发明优选的技术方案中，所述第三重组载体包括d-泛解酸内酯还原酶编码基因，优选的，所述d-泛解酸内酯水解酶编码基因源自串珠镰孢霉菌、腐皮镰孢菌、镰刀霉菌中的任一种。
55.本发明优选的技术方案中，所述d-泛解酸内酯水解酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到d-泛解酸内酯基因序列。
56.本发明优选的技术方案中，酶切位点选自xhoi、ndei的任一种或其组合。
57.本发明优选的技术方案中，所述d-泛解酸内酯水解酶基因序列经人工合成制得目的基因4，所述目的基因4的核苷酸序列如seq id no.4所示。
58.本发明的优选技术方案中，所述密码子优化根据大肠杆菌的密码子偏好性进行。
59.本发明优选的技术方案中，用于重组的载体选自pet-21a质粒、pet-28a质粒、prsfduet-i质粒的任一种或其组合。
60.本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体的获得方法包括下述步骤：将l-泛
解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列克隆到第一载体中，得到第一重组载体。
61.本发明优选的技术方案中，所述第二重组载体的获得方法包括下述步骤：将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列克隆到第二载体中，得到第二重组载体。
62.本发明优选的技术方案中，所述第三重组载体的获得方法包括下述步骤：将葡萄糖脱氢酶编码基因或目的基因3或如seq id no：3所示的核苷酸序列克隆到第三载体中，得到第三重组载体。
63.本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：将d-泛解酸内酯水解酶编码基因或目的基因4或如seq id no：4所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
64.本发明优选的技术方案中，所述第五重组载体的获得方法包括下述步骤：将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列和酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，得到第五重组载体，其中2种基因或核酸序列的克隆顺序并无先后之分。
65.本发明优选的技术方案中，所述第六重组载体的获得方法包括下述步骤：将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列、酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列、葡萄糖脱氢酶编码基因或目的基因3或如seq id no：3所示的核苷酸序列、d-泛解酸内酯水解酶编码基因或目的基因4或如seq id no：4所示的核苷酸序列克隆到第六载体中，得到第六重组载体，其中4种基因或核酸序列的克隆顺序并无先后之分。
66.本发明优选的技术方案中，将第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体、第四重组载体、第五重组载体或第六重组载体的任一种或其组合顺序或同步导入到宿主细胞中，得到重组工程菌。
67.本发明优选的技术方案中，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种。
68.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌的诱导方法包括下述步骤：
69.s-1，将重组工程菌按照1-5％接种量接种于lb培养基中，将其置于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-16h，获得一级种子液；
70.s-2，将一级种子液按照1-5％接种量接种于tb培养基中，将其置于25-40℃、50-500rpm条件下培养6-20h，离心，磷酸缓冲液洗涤，收集菌体。
71.本发明优选的技术方案中，s-1步骤的发酵温度为35-38℃，转速100-300rpm。
72.本发明优选的技术方案中，s-2步骤中，先在35-38℃、100-300rpm条件下培养0.5-3h，再在28-30℃、100-300rpm条件下培养10-15h。
73.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括抗生素、酵母粉、胰蛋白胨和氯化钠。
74.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括抗生素50-200mg/l、酵母粉4g/l-6g/l、胰蛋白胨8g/l-12g/l和氯化钠8g/l-12g/l。
75.本发明优选的技术方案中，所述抗生素选自青霉素、两性霉素b、制霉素、多粘菌素
b、链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、氨苄霉素、卡那霉素的任一种或其组合。
76.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括卡那霉素100mg/l、酵母粉5g/l、胰蛋白胨10g/l和氯化钠10g/l。
77.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括氨苄霉素50mg/l、卡那霉素100mg/l、酵母粉5g/l、胰蛋白胨10g/l和氯化钠10g/l。
78.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括抗生素、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、乳糖。
79.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括抗生素50-200mg/l、胰蛋白胨18-22g/l、酵母粉4-6g/l、氯化钠4-6g/l、葡萄糖1-3g/l、乳糖0.1-3.0g/l。
80.本发明优选的技术方案中，所述抗生素选自青霉素、两性霉素b、制霉素、多粘菌素b、链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、氨苄霉素、卡那霉素的任一种或其组合。
81.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括卡那霉素100mg/l、胰蛋白胨20g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、葡萄糖2g/l、乳糖0.1-2.0g/l。
82.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括氨苄霉素50mg/l、卡那霉素100mg/l、胰蛋白胨20g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、葡萄糖2g/l、乳糖0.1-2.0g/l。
83.本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌的构建方法，包括下述步骤：
84.(1)将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因、酮泛解酸内酯还原酶编码基因、葡萄糖脱氢酶编码基因、d-泛解酸内酯水解酶编码基因的任一种或其组合顺序或同步导入载体，得到重组载体；
85.(2)将所得重组载体导入宿主细胞，得到重组工程菌。
86.本发明的优选技术方案中，所述重组载体选自第五重组载体包含l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示和酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，第三重组载体葡萄糖脱氢酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，第四重组载体包含d-泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示的任一种。
87.本发明优选的技术方案中，所述第三重组载体的获得方法包括下述步骤：将葡萄糖脱氢酶编码基因或目的基因3或如seq id no：3所示的核苷酸序列克隆到第三载体中，得到第三重组载体。
88.本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：将d-泛解酸内酯水解酶编码基因或目的基因4或如seq id no：4所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
89.本发明优选的技术方案中，所述第五重组载体的获得方法包括下述步骤：将l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如seq id no：1所示的核苷酸序列和酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如seq id no：2所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，得到第五重组载体，其中，两种基因或核酸序列的克隆顺序并无先后之分。
90.本发明优选的技术方案中，用于重组的载体选自pet-21a质粒、pet-28a质粒、prsfduet-i质粒的任一种或其组合。
91.本发明优选的技术方案中，将第三重组载体、第四重组载体或第五重组载体的任一种或其组合依次或同步导入到宿主细胞中，得到重组工程菌。
92.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌包含能够共表达l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶的第五重组载体和表达葡萄糖脱氢酶的第三重组载体。
93.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌中还包含表达d-泛解酸内酯水解酶的第四重组载体，或者与表达d-泛解酸内酯水解酶的第四重组载体的第二重组工程菌联合使用。
94.本发明优选的技术方案中，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种。
95.本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌的诱导表达方法，包括下述步骤：
96.s-1，将重组工程菌按照1-5％接种量接种于lb培养基中，将其置于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-16h，获得一级种子液；
97.s-2，将一级种子液按照1-5％接种量接种于tb培养基中，将其置于25-40℃、50-500rpm条件下培养6-20h，离心，磷酸缓冲液洗涤，收集菌体。
98.本发明优选的技术方案中，s-1步骤中，发酵温度为35-38℃，转速100-300rpm。
99.本发明优选的技术方案中，所述s-2步骤，先在35-38℃、100-300rpm条件下培养0.5-3h，再在28-30℃、100-300rpm条件下培养10-15h。
100.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括抗生素、酵母粉、胰蛋白胨和氯化钠。
101.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括抗生素50-200mg/l、酵母粉4g/l-6g/l、胰蛋白胨8g/l-12g/l和氯化钠8g/l-12g/l。
102.本发明优选的技术方案中，所述抗生素选自青霉素、两性霉素b、制霉素、多粘菌素b、链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、氨苄霉素、卡那霉素的任一种或其组合。
103.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括卡那霉素100mg/l、酵母粉5g/l、胰蛋白胨10g/l和氯化钠10g/l。
104.本发明优选的技术方案中，所述lb培养基的组成包括氨苄霉素50mg/l、卡那霉素100mg/l、酵母粉5g/l、胰蛋白胨10g/l和氯化钠10g/l。
105.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括抗生素、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、乳糖。
106.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括抗生素50-200mg/l、胰蛋白胨18-22g/l、酵母粉4-6g/l、氯化钠4-6g/l、葡萄糖1-3g/l、乳糖0.1-3.0g/l。
107.本发明优选的技术方案中，所述抗生素选自青霉素、两性霉素b、制霉素、多粘菌素b、链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、氨苄霉素、卡那霉素的任一种或其组合。
108.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括卡那霉素100mg/l、胰蛋白胨20g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、葡萄糖2g/l、乳糖0.1-2.0g/l。
109.本发明优选的技术方案中，所述tb培养基的组成包括氨苄霉素50mg/l、卡那霉素100mg/l、胰蛋白胨20g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、葡萄糖2g/l、乳糖0.1-2.0g/l。
110.本发明的另一目的在于提供一种d-泛解酸内酯的制备方法，包括下述步骤：将浓度为10-300g/l的dl-泛解酸内酯置于葡萄糖、重组工程菌od值为1-5的发酵体系中，将其置于30-40℃、ph5-7条件下培养发酵20-40h，制得d-泛解酸内酯。
111.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌的od值为2-3。
112.本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌可表达l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶。
113.本发明优选的技术方案中，还可加入表达d-泛解酸内酯水解酶的重组工程菌。
114.本发明优选的技术方案中，反应溶液过滤，收集滤液，调ph1-3，放置。
115.本发明的优选方案中，dl-泛解酸内酯：甲酸的摩尔比为1:(0.8-1.2)，优选为1:(0.9-1.1)。
116.本发明的优选方案中，dl-泛解酸内酯的浓度为50-250g/l，优选为100-200g/l。
117.本发明优选的技术方案中，反应体系温度为35-37℃。
118.本发明优选的技术方案中，发酵体系培养时间为25-35h。
119.本发明优选的技术方案中，反应体系ph5.5-6.5，优选为ph5.8-6.2。
120.本发明的优选方案中，ph调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙胺、氢氧化钾、磷酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠、磷酸盐缓冲液、tr i s缓冲液、硫酸的任一种。
121.本发明优选的技术方案中，任选地加入nadph，优选的，反应体系中nadph浓度为10-100mmol/l，优选为30-90mmol/l，更优选为50-70mmol/l。
122.本发明优选的技术方案中，所得的d-泛解酸内酯ee值≥95％，优选≥96％，更优选≥97％，还优选≥98％，再优选≥99％。
123.本发明的另一目的在于提供本发明的重组工程菌用于dl-泛解酸内酯制备d-泛解酸内酯中的应用。
124.本发明优选的技术方案中，所述d-泛解酸内酯用于制备泛化合物中的应用，优选所述泛化合物选自d-泛解酸内酯、d-泛酸、d-泛酸钙、d-泛醇、泛硫乙胺中的任一种。
125.除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
126.1、转化率
127.仪器及工作条件：岛津lc-16液相色谱仪，色谱柱ie5μm，4.6*250mm，柱温30℃，采集时间30min，波长210nm，流速1.0ml/min，流动相为0.05mol/l磷酸二氢钠水溶液∶甲醇＝60∶40。
128.实验步骤：分别在转化时间t＝0和t＝m(m为大于0的任一数值)时，取反应液稀释100倍，过滤后进样，进样量10ul，分别记录l-泛解酸内酯峰面积s0和sm。
129.转化率
(m时刻)
＝(s
0-sm)/s0。
130.2、ee值计算公式
131.ee值＝(d-泛解酸内酯含量-l-泛解酸内酯含量)/(d-泛解酸内酯含量 l-泛解酸内酯含量)
132.与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
133.1、本发明提供了一种重组工程菌及其构建方法，该重组工程菌经过诱导培养可表达l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因、酮泛解酸内酯还原酶编码基因、葡萄糖脱氢酶编码基因d-泛解酸内酯水解酶编码基因，用于高效制备光学纯度高的d-泛解酸内酯，并具有操作简便、绿色环保，适宜工业化生产等优点。
134.2、本发明还提供了一种利用所述重组工程菌诱导产生的酶高效催化dl-泛解酸内酯或l-泛解酸内酯合成d-泛解酸内酯的方法，显著提高l-泛解酸内酯脱氢酶的选择性和反应效率及产品转化率。
135.3、本发明未采用化学拆分试剂，避免了l-泛解酸内酯循环消旋化，缩短了生产周期，具有操作简便、绿色环保、成本更优、更适于大规模工业化生产等优点。
具体实施方式
136.通过以下实施例进一步详细说明本发明。这些实施例和实验例仅用于说明性目的，而并非用于限制本发明的范围。
137.实施例1 构建多酶共表达重组工程菌
138.1、目的基因的设计与合成
139.步骤一，将来源于humibacter sp.bt305(放线菌)的l-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列根据大肠杆菌(e.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上xhoi与ndei酶切位点，得到l-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
140.步骤二，将来源于木兰假丝酵母的酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列根据大肠杆菌(e.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上saci与noti酶切位点，得到d-酮泛解酸内酯改造基因序列，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
141.步骤三，将来源于伯克霍尔德菌burkholderia stabilis的葡萄糖脱氢酶编码的核苷酸序列根据大肠杆菌(e.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上xhoi与ndei酶切位点，得到葡萄糖脱氢酶改造基因序列，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
142.步骤四，将来源于fusariummoniliforme cgmcc 0536(串珠镰孢霉菌)的d-泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列根据大肠杆菌(e.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上xhoi与ndei酶切位点，得到d-泛解酸内酯水解酶改造基因序列，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
143.步骤五，合成seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列，制得目的基因1、目的基因2、目的基因3和目的基因4。
144.2、重组表达载体的构建
145.步骤一，以目的基因组1的dna分子为模板，采用引物对lpldh-for和lpldh-rev进行pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因组1的基因片段。
146.引物序列如下：(下划线为酶切位点)
147.lpldh-for：ggaattccatatgatgaacccgtggtttgaaac
148.lpldh-rev：ccgctcgagtgcgctttctgcttctgc
149.pcr体系如下：
[0150][0151]
pcr过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min30s，循化28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
[0152]
步骤二，以目的基因组2的dna分子为模板，采用引物对kpr-for与kpr-rev进行pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因组2的基因片段。
[0153]
引物序列如下：(下划线为酶切位点)
[0154]
kpr-for：
[0155]
ggaattccatatgatggctaaaaacttctctaacgttgaatacc
[0156]
kpr-rev：ccgctcgagcggcagggtgtaaccaccgtcaac
[0157]
pcr体系如下：
[0158][0159]
pcr过程如下：
[0160]
95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循化28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
[0161]
步骤三，用限制性内切酶xhoi与ndei双酶切prsfduet-i质粒和基因组1的基因片段，回收载体骨架和酶切pcr产物，用t4 dna连接酶将两者连接，连接产物(命名为prsf-lpldh)转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒进行测序鉴定，将正确的克隆命名为e-prsf-lpldh。
[0162]
步骤四，用限制性内切酶saci与noti双酶切prsf-lpldh质粒和基因组2的基因片段，回收载体骨架和酶切pcr产物，用t4 dna连接酶将两者连接，连接产物(命名为
prsfduet-lpldh-kpr)转化至e.colibl21(de3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒进行测序鉴定，将正确的克隆命名为e-lpldh-kpr，即得单质粒两酶重组表达载体，可以共表达l-泛解酸内酯脱氢酶和酮泛解酸内酯还原酶。
[0163]
步骤五，以目的基因组3的dna分子为模板，采用引物对gdh-for与gdh-rev进行pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因组3的基因片段。
[0164]
引物序列如下：(下划线为酶切位点)
[0165]
gdh-for：ggaattccatatgatggcggtaacgcaaacag
[0166]
gdh-rev：
[0167]
ccgctcgagttactcaaactcattccaggaacg
[0168]
pcr体系如下：
[0169][0170]
pcr过程如下：
[0171]
95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循化28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
[0172]
步骤六，用限制性内切酶xhoi与ndei双酶切pet-21a质粒和基因组3的基因片段，回收载体骨架和pcr产物，用t4 dna连接酶将两者连接，连接产物(命名为pet-gdh)转化至e-lpldh-kpr感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为e-lpldh-kpr-gdh，即得双质粒三酶重组表达载体，可以共表达l-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶。
[0173]
实施例2 构建d-泛解酸水解酶表达重组工程菌
[0174]
1、目的基因的设计与合成
[0175]
将来源于fusariummoniliformecgmcc0536的d-泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列根据大肠杆菌(e.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上xhoi与ndei酶切位点，得到d-泛解酸内酯水解酶改造基因序列，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
[0176]
2、重组工程菌的构建
[0177]
步骤一，以目的基因组4的dna分子为模板，采用引物对hyd-for和hyd-rev进行pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因组4的基因片段。
[0178]
引物序列如下：(下划线为酶切位点)
[0179]
hyd-for：ggaattccatatgatggctaagcttccttctac
[0180]
hyd-rev：ccgctcgagctaatcatagagcttgggaccc
[0181]
pcr体系如下：
[0182][0183]
pcr过程如下：
[0184]
95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，循化28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
[0185]
步骤二，用限制性内切酶xhoi与ndei双酶切pet-28a质粒和基因组4的pcr产物，回收载体骨架和pcr产物，用t4 dna连接酶将两者连接，连接产物(命名为pet-hyd)转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为e-hyd。
[0186]
实施例3 重组工程菌e-lpldh
–
kpr-gdh的诱导表达
[0187]
将实施例1制得的重组工程菌e-lpldh-kpr-gdh接种于5ml lb培养基中，将其置于37℃，200rpm条件下过夜培养；
[0188]
将种子按2％接种量接种于100ml tb培养基中，将其置于37℃、200rpm条件下培养2h，之后将培养温度调节为30℃，继续培养15h；
[0189]
6600rpm离心3min，弃上清，0.2mol/l的ph6.5磷酸缓冲洗涤2次，收集菌体。
[0190]
其中，lb培养基的组成如下：氨苄霉素50ug/ml、卡那霉素100mg/l，酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l。
[0191]
tb培养基的组成如下：胰蛋白胨20g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖2g/l，乳糖0.1～2.0g/l，氨苄霉素50mg/l，卡那霉素100mg/l。
[0192]
实施例4 重组工程菌e-hyd的诱导表达
[0193]
将实施例2制得的重组工程菌e-hyd接种于5ml lb培养基中，将其置于37℃、200rpm条件下过夜培养，获得种子液；
[0194]
将种子液按2％接种量接种于100ml tb培养基中，将其置于37℃、200rpm条件下培养2h，之后将培养温度调节为30℃，继续培养15h；6600rpm离心3mi n，弃上清，0.2mol/l的ph6.5磷酸缓冲洗涤2次，收集菌体。
[0195]
其中，lb培养基的组成如下：卡那霉素100mg/l，酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l。
[0196]
tb培养基的组成如下：胰蛋白胨20g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖2g/l，乳
糖0.1～2.0g/l，卡那霉素100mg/l。
[0197]
实施例5 dl-泛解酸内酯的转化
[0198]
将dl-泛解酸内酯130g、葡萄糖180g加入到反应容器中，加水至总体积为1l，搅拌溶解后；用20-25％氨水调节溶液ph为6.2，升温至37℃，加入实施例1收集的重组工程菌体(od＝2)，将混合溶液置于37℃下，搅拌反应30h，得到反应液。对反应液进行高效液相色谱检测，d-泛解酸内酯终浓度为124.67g/l，dl-泛解酸内酯转化率为95.9％，ee值为91.8％。
[0199]
实施例6 dl-泛解酸内酯的转化
[0200]
将dl-泛解酸内酯130g、葡萄糖180g加入到反应容器中，加水至总体积为1l，搅拌溶解后；用20-25％氨水调节溶液ph为6.2，升温至37℃，然后加入实施例1收集的菌体(od＝2)和50mm nadph(反应体系浓度)，将混合溶液置于37℃下，搅拌反应30h，得到反应液。对反应液进行高效液相色谱检测，d-泛解酸内酯终浓度为124.93g/l，dl-泛解酸内酯转化率为97.8％，ee值为95.6％。
[0201]
实施例7 dl-泛解酸内酯的转化
[0202]
将dl-泛解酸内酯130g、葡萄糖180g加入到反应容器中，加水至总体积为1l，搅拌溶解后；用20-25％氨水调节溶液ph为6.2，升温至37℃，然后加入实施例1收集的重组工程菌体(od＝2)与实施例2收集的重组工程菌体(od＝3)，将混合溶液置于37℃下，搅拌反应30h，得到反应液。对反应液进行高效液相色谱检测，d-泛解酸终浓度为147.956g/l，dl-泛解酸内酯转化率为99.97％。
[0203]
将反应液过陶瓷膜，收集陶瓷膜清液过纳滤膜，收集纳滤膜清液进，用浓硫酸调节ph为1.5，放置30min，获得d-泛解酸内酯溶液，d-泛解酸内酯浓度为129.96g/l，ee值为99.94％。
[0204]
实施例8 dl-泛解酸内酯的转化
[0205]
将dl-泛解酸内酯130g、葡萄糖180g加入到反应容器中，加水至总体积为1l，搅拌溶解后；用20-25％氨水调节溶液ph6.2，升温至37℃，再加入实施例1收集的重组工程菌体(od＝2)与实施例2收集的重组工程菌体(od＝2)，将混合溶液置于37℃下，搅拌反应30h，得到反应液。对反应液进行色谱检测，d-泛解酸终浓度为146.37g/l，dl-泛解酸内酯转化率为98.9％。
[0206]
将反应液过陶瓷膜，收集陶瓷膜清液过纳滤膜，收集纳滤膜清液，调节ph1.5左右，放置30min，获得d-泛解酸内酯溶液，d-泛解酸内脂浓度为129.02g/l，ee值为98.5％。
[0207]
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。