针对间皮素的抗体及其用途的制作方法

1.本发明涉及针对间皮素的抗体，以及这种抗体的用途，特别是它们在癌症治疗中的用途。
2.发明背景
3.间皮素(msln)被编码为71kda的前体蛋白，该前体蛋白随后被内切蛋白酶弗林蛋白酶处理以产生称为巨核细胞增强因子(mpf)的31kda的脱落蛋白和40kda的片段，即间皮素，间皮素通过糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚连接至细胞膜。
4.间皮素是肿瘤分化抗原，在胸膜、腹膜和心包内层的间皮细胞中正常表达，但在许多人类癌症中高度表达，所述癌症包括几乎所有的间皮瘤和胰腺癌，以及约70％的卵巢癌和50％的肺腺癌。
5.研究表明，间皮素的异常表达通过激活pi3k、erk和mapk信号传导通路在癌细胞增殖、侵袭和转移中发挥核心作用。在肿瘤环境中，已知间皮素与卵巢癌抗原muc16/ca125结合，muc16/ca125是脱落到血清中的非常大的细胞表面粘蛋白，并用于监测对卵巢癌治疗的反应。这两种蛋白质经常共表达，并且间皮素和muc16的结合已显示出诱导细胞间粘附并促进卵巢癌的腹膜扩散。此外，据报道，由msln和muc16的结合所介导的信号传导增加细胞对失巢凋亡的抵抗力，上调对细胞侵袭和转移具有重要作用的基质金属蛋白酶，并通过组成型激活核因子kappa b(nf-κb)诱导自分泌生长因子的分泌。
6.鉴于间皮素在正常组织和肿瘤中的表达模式，其已成为癌症治疗的有吸引力的靶标。
7.发明概述
8.本公开提供了结合间皮素的新型抗体或其抗原结合片段，其可以是单克隆抗体或双特异性抗体的形式，例如双特异性t细胞衔接器(bite)。本发明公开的抗体能够结合间皮素并介导效应细胞对表达间皮素的靶细胞(例如各种癌细胞)的杀伤。
9.在一个方面，本公开提供了特异性结合间皮素的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，其中vl包含分别具有如seq id no：1-3所示的氨基酸序列的lcdr 1-3，并且vh包含分别具有如seq id no：6-8所示的氨基酸序列的hcdr 1-3。
10.在本发明公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，vl包含与seq id no：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且vh包含与seq id no：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl包含如seq id no：4所示的氨基酸序列，并且vh包含如seq id no：9所示的氨基酸序列。
11.在一些实施方案中，抗体是选自igg、iga、igm、ige和igd的同种型。在一些实施方案中，抗体是选自igg1、igg2、igg3和igg4的亚型。
12.在一些实施方案中，抗原结合片段可选自fab、fab’、f(ab')2、fv、scfv和ds-scfv。
13.在一些实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与seq id no：5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述重链包含与seq id no：11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
14.在其他实施方案中，抗体可以是双特异性或多特异性抗体。在一些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体，其进一步包含与第二抗原结合的第二抗原结合区。在一些实施方案中，第二抗原可以是肿瘤相关抗原或免疫细胞抗原。在一些实施方案中，第二抗原可以是t细胞抗原。在一些实施方案中，t细胞抗原可以选自t细胞受体(tcr)、cd3、cd4、cd8、cd16、cd25、cd28、cd44、cd62l、cd69、icos、41-bb(cd137)和nkg2d。
15.在一些实施方案中，第二抗原是cd3，并且第二抗原结合区包含vl和vh，其中vl包含分别具有如seq id no：12-14所示的氨基酸序列的lcdr1-3，并且vh包含分别具有如seq id no：17-19所示的氨基酸序列的hcdr1-3。
16.在一些实施方案中，第二抗原结合区包含vl和vh，所述vl包含与seq id no：15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述vh包含与seq id no：20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原结合区包含vl和vh，所述vl包含如seq id no：15所示的氨基酸序列，并且所述vh包含如seq id no：20所示的氨基酸序列。
17.在一些实施方案中，第二抗原结合区的vl任选地通过第一接头与特异性结合间皮素的抗体的vl的c端连接，并且第二抗原结合区的vh任选地通过第二接头与特异性结合间皮素的抗体的vh的c端连接，其中第一接头和第二接头相同或不同。
18.在一些实施方案中，第一接头包含如seq id no：22(ggggsggggsggggs)所示的氨基酸序列，第二接头包含如seq id no：23(gssggggsggggs)所示的氨基酸序列。
19.在一些实施方案中，双特异性抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与seq id no：16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述重链包含与seq id no：21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
20.在一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性t细胞衔接器(bite)。
21.在另一方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含含有vl和vh的结合间皮素的第一抗原结合区，和含有vl和vh的结合cd3的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区的vl包含分别具有如seq id no：1-3所示的氨基酸序列的lcdr 1-3，并且第一抗原结合区的vh包含分别具有如seq id no：6-8所示的氨基酸序列的hcdr 1-3；并且第二抗原结合区的vl包含分别具有如seq id no：12-14所示的氨基酸序列的lcdr 1-3，并且第二抗原结合区的vh包含分别具有如seq id no：17-19所示的氨基酸序列的hcdr 1-3。
22.在本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第一抗原结合区的vl包含与seq id no：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且第一抗原结合区的vh包含与seq id no：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且第二抗原结合区的vl包含与seq id no：15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且第二抗原结合
区的vh包含与seq id no：20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
23.在一些实施方案中，第一抗原结合区的vl包含如seq id no：4所示的氨基酸序列，且第一抗原结合区的vh包含如seq id no：9所示的氨基酸序列；并且第二抗原结合区域的vl包含如seq id no：15所示的氨基酸序列，且第二抗原结合区的vh包含如seq id no：20所示的氨基酸序列。
24.在一些实施方案中，第二抗原结合区的vl任选地通过第一接头与第一抗原结合区vl的c端连接，并且第二抗原结合区的vh任选地通过第二接头与第一抗原结合区vh的c端连接，其中第一接头和第二接头相同或不同。在一些实施方案中，第一接头包含如seq id no：22(ggggsggggsggggs)所示的氨基酸序列，第二接头包含如seq id no：23(gssggggsggggs)所示的氨基酸序列。
25.在一些实施方案中，双特异性抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与seq id no：16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述重链包含与seq id no：21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
26.在一些实施方案中，双特异性抗体可以是双特异性t细胞衔接器(bite)。
27.在又一方面，本公开提供了核酸，其包含编码本发明公开的抗体或其抗原结合片段或本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
28.在另一方面，本公开提供了包含本发明公开的核酸的载体。
29.在另一方面，本公开提供了包含本发明公开的核酸或本发明公开的载体的宿主细胞。
30.在又一方面，本公开提供了药物组合物，其包含(i)本发明公开的抗体或其抗原结合片段，或本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。
31.在本发明公开的药物组合物的一些实施方案中，药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、lag3抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂和糖皮质激素。
32.在又一方面，本公开提供了缀合物，其包含本发明公开的抗体或其抗原结合片段或者本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。
33.在本发明公开的缀合物的一些实施方案中，化学部分可以选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。
34.在另一方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物。
35.在本发明公开的方法的一些实施方案中，癌症是间皮素阳性癌症。在一些实施方案中，癌症可以选自间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌和卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(tnbc)。
36.在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、lag3抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂和糖皮质激素。
37.在另一方面，本公开提供了本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，癌症是间皮素阳性癌症。在一些实施方案中，癌症可以选自间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌和卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(tnbc)。
38.在另一方面，本公开提供了本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物，其用于治疗受试者中的癌症。在一些实施方案中，癌症是间皮素阳性癌症。在一些实施方案中，癌症可以选自间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌和卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(tnbc)。
附图说明
39.可通过参考描述了利用本发明原理的示例性实施方案的以下详细描述和附图来获得对本发明的特征和优点的理解，在附图中：
40.图1显示了通过elisa测量的m8 fab、m10 fab和m38 fab对重组人间皮素的结合。bsa用作阴性对照。
41.图2显示了通过流式细胞术测量的m8 fab、m10 fab和m38 fab对间皮素瞬时转染的hek293细胞的结合。商用抗间皮素抗体用作阳性对照(ctrl)。颜色代码，黑色：阴性对照(不含一抗)；粉红色：ctrl或m8 fab；绿色：m10 fab；青色：m38 fab。
42.图3显示了通过流式细胞术测量的m10 fab对癌细胞系h226和n87的结合。颜色代码，紫色：阴性对照(不含一抗)；绿色：m10 fab。
43.图4显示了通过elisa测量的m10 mab对重组人间皮素的结合。
44.图5显示了通过流式细胞术测量的m10 mab对癌细胞系h226的结合。颜色代码，紫色：阴性对照(不含一抗)；绿色：m10 mab。
45.图6显示了在nk细胞存在下，m10 mab对h226细胞的adcc杀伤。igg4同种型抗体用作阴性对照。
46.图7a显示了通过elisa测量的cmd007对重组人cd3的结合。
47.图7b显示了通过elisa测量的cmd007对重组人间皮素的结合。
48.图8a显示了通过流式细胞术测量的cmd007对表达间皮素的癌细胞系h226的结合。
49.图8b显示了通过流式细胞术测量的cmd007对表达cd3的jurkat细胞的结合。
50.图8c显示了通过流式细胞术测量的cmd007对间皮素稳定转染的癌细胞ls174t-msln(2b6)的结合。颜色代码，紫色：阴性对照(不含一抗)；绿色：cmd007。
51.图8d显示了通过流式细胞术测量的cmd007对间皮素阴性癌细胞系ls174t的结合。颜色代码，紫色：阴性对照(不含一抗)；绿色：cmd007。
52.图9显示了在表达间皮素的细胞系h226和ls174t-msln(2b6)存在下，通过cd69表
达监测的cmd007诱导的t细胞活化。ls174t用作细胞系的阴性对照。cmd006-m2用作抗体的阴性对照。
53.图10显示了在表达间皮素的细胞系ls174t-msln(2b6)存在下，通过cd25表达监测的cmd007诱导的t细胞活化。ls174t用作细胞系的阴性对照。cmd006-m2用作抗体的阴性对照。
54.图11显示了在人pbmc存在下，cmd007对n87细胞的杀伤作用。靶细胞(n87)与效应细胞(pbmc)的比例为1:10。igg4同种型抗体用作阴性对照。
55.图12显示了在人pbmc存在下，cmd007对ls174t-msln(2b6)细胞的杀伤作用。靶细胞(ls174t-msln(2b6))与效应细胞(pbmc)的比例为1:5。
56.图13显示了在人pbmc存在下，cmd007对h226细胞的杀伤作用。靶细胞(h226)与效应细胞(pbmc)的比例为1:10。igg4同种型抗体用作阴性对照(ctrl-igg4)。
57.图14显示了在处理后0.25小时、5小时、21小时、49小时和69小时，经cmd007处理的小鼠血清中cmd007的浓度。
58.图15a显示了50μg/kg或200μg/kg cmd007在小鼠中对肿瘤生长的抑制。200μg/kg igg4同种型抗体用作阴性对照。
59.图15b显示了肿瘤生长抑制试验中小鼠的体重。200μg/kg igg4同种型抗体用作阴性对照。
60.图15c显示了50μg/kg或200μg/kg cmd007在小鼠中对肿瘤生长的抑制率。
61.发明详述
62.通过结合附图对以下实施方案的详细描述，本发明的上述特征和优点及其附加特征和优点将在下文中得到更清楚的理解。此处参照附图描述的实施方案是解释性的，说明性的，并用于普遍理解本发明。实施方案不应解释为限制本发明的范围。相同或相似的要素和具有相同或相似功能的要素在整个描述中使用相同的附图标记表示。
63.除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语都具有技术人员所熟知的本领域通常的含义。例如参考标准手册，例如leuenberger,h.g.w,nagel,b.和klbl,h.编辑，“a multilingual glossary of biotechnological terms：(iupac recommendations)”，helvetica chimica acta(1995)，瑞士巴塞尔ch-4010；sambrook等人，“molecular cloning：a laboratory manual”(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(1989)；f.ausubel等人编辑，“current protocols in molecular biology”，green publishing and wiley interscience，纽约(1987年)；roitt等人，“immunology”(第6版)，mosby/elsevier，爱丁堡(2001年)；和janeway等人，“immunobiology”(第6版)，garland science publishing/churchill livingstone，纽约(2005年)，以及上面引用的通常

背景技术：
。
64.如本发明所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种抗体”包含多种抗体，并且在一些实施方案中提及“一种抗体”包含多种抗体，等等。
65.除非另有说明或定义，否则术语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”应理解为意味着包括所述元素或步骤或者元素或步骤的组，但不排除任何其他元素或步骤或着元素或步骤的组。
66.如本发明所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的
能力。抗体通常在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分，如补体激活经典途径中的第一组分c1q。因此，大多数抗体具有重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，它们共同形成与抗原结合的抗体部分。
[0067]“轻链可变区”(vl)或“重链可变区”(vh)由间插三个“互补决定区”或“cdr”的“框架”区组成。框架区用于调整cdr，以用于特异性结合抗原表位。cdr包含抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。从氨基末端到羧基末端，vl和vh结构域都包含以下框架(fr)区和cdr区：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3和fr4。vl结构域的cdr 1、2和3在本文中也分别称为lcdr1、lcdr2和lcdr3；vh结构域的cdr 1、2和3在本文中也分别称为hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0068]
每个vl和vh结构域的氨基酸分配按照cdr的任何常规定义。常规定义包括kabat定义(kabat,sequences of proteins of immunological interest(national institutes of health,bethesda,md,1987和1991))；chothia定义(chothia&lesk,j.mol.biol.196：901-917,1987；chothia等人,nature 342：878-883,1989)；chothia kabat cdr的复合，其中cdr-h1是chothia和kabat cdr的复合；oxford molecular的抗体建模软件所使用的abm定义；以及martin等人的contact定义(万维网bioinfo.org.uk/abs)。kabat提供了广泛使用的编号惯例(kabat编号系统)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被赋予相同的编号。本公开可以使用根据这些编号系统中的任一种定义的cdr，但是优选的实施方案使用kabat定义的cdr。
[0069]
本发明所用的术语“抗体”应以其最广泛的意义来理解，并且包括单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和包含至少两个抗原结合区的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体可含有另外的修饰，例如非天然存在的氨基酸、fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出预期的生物活性即可。
[0070]
如本发明所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原(例如间皮素蛋白)能力的一种或多种抗体片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。
[0071]
包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的抗原结合片段的实例包括(i)fab片段，其为由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，其为二价片段，包含通过铰链区二硫键连接的两个fab片段；(iii)fab'片段，其基本上是fab，但具有部分铰链区(参见，fundamental immunology(paul ed.,3.sup.rd ed.1993)；(iv)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(v)具有vh和ch1结构域以及位于ch1结构域的c端的一个或多个半胱氨酸残基的fd'片段；(vi)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(vii)dab片段(ward等人(1989)nature 341：544-546)，其由vh结构域组成；(viii)单独的互补决定区(cdr)；和(ix)纳米抗体，其为包含单个可变域和两个恒定域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh通过独立的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头能够使它们形成单个蛋白质链，在该蛋白质链中，vl和vh区配对以形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如bird等人(1988)science242,423-426；以及huston等人(1988)
proc.natl.acad.sci.usa 85,5879-5883)。此类单链抗体也意在包含在术语抗体的“抗原结合片段”内。此外，该术语还包括含有一对串联fd片段(vh-ch1-vh-ch1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽以及保留抗原结合活性的任何前述片段的修饰版本共同形成抗原结合区。
[0072]
这些抗原结合片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
[0073]
如本发明所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间的非随机结合反应，例如在抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力由抗原与抗体解离的平衡常数(kd)表示，是抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的结合强度的量度：kd值越小，抗原决定簇和抗体之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(ka)，其为1/kd。
[0074]
亲合力是抗体与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间的亲和力以及抗体上存在的相关结合位点的数量。通常，抗体将以10-5
至10-12
m或更小的解离常数(kd)结合，优选以10-7
至10-12
m或更小，更优选以10-8
至10-12
m的解离常数(kd)结合，和/或以至少107m-1
，优选至少108m-1
，更优选至少109m-1
，例如至少10
12
m-1
的结合亲和力结合。通常认为任何大于10-4
m的kd值代表非特异性结合。抗体与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适的方式测定，包括例如斯卡查德分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(ria)、酶免疫测定(eia)和三明治竞争测定和本领域中本身已知的不同变型。
[0075]
术语“表位”是指抗原上抗体结合的位点。表位可以由连续氨基酸或通过一种或多种蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在变性溶剂的处理中丢失。表位通常包含处于独特空间构象的至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。表位限定了抗体的最小结合位点，因此是抗体或其抗原结合片段的特异性靶标。
[0076]
如本发明所用，术语“序列同一性”是指两条序列(氨基酸)对齐后在相同位置具有相同残基的程度。例如，“氨基酸序列与seq id no：y是x％相同的”是指该氨基酸序列与seq id no：y的同一性百分比，并被阐述为该氨基酸序列中x％的残基与seq id no：y中公开的序列残基相同。
[0077]
通常使用计算机程序进行此类计算。比较和对齐序列对的示例性程序包括align(myers和miller,1988)、fasta(pearson和lipman,1988；pearson,1990)以及gapped blast(altschul等人,1997)、blastp、blastn或者gcg(devereux等人,1984)。
[0078]
此外，在确定两条氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸残基被替换为具有类似化学结构的另一种氨基酸残基的氨基酸取代，其对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响或基本上没有影响。这种保守性氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如wo 04/037999，gb-a-2 357 768，wo 98/49185，wo 00/46383和wo 01/09300；并且(优选地)这些取代的类型和/或组合可以根据来自wo 04/037999以及wo 98/49185以及其中引用的另外的参考文献的相关教导来选择。
[0079]
这种保守性取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：asp、asn、glu和gln；(c)极性、带正电的残基：his、arg和lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：met、leu、he、val和cys；以及(e)芳香族残基：phe、tyr和trp。
[0080]
特别优选的保守性取代如下：ala到gly或到ser；arg到lys；asn到gln或到his；asp到glu；cys到ser；gln到asn；glu到asp；gly到ala或到pro；his到asn或到gln；ile到leu或到val；leu到ile或到val；lys到arg、到gln或到glu；met到leu、到tyr或到ile；phe到met、到leu或到tyr；ser到thr；thr到ser；trp到tyr；tyr到trp；和/或phe到val、到ile或到leu。
[0081]
本发明描述的应用于多肽的任何氨基酸取代也可以基于由schulz等人，principles of protein structure,springer-verlag,1978开发的不同物种的同源蛋白质之间的氨基酸变异频率的分析，基于chou和fasman，biochemistry 13：211,1974和adv.enzymol.,47：45-149,1978开发的结构形成潜能分析，以及基于eisenberg等人，proc.nat.acad sci.usa 81：140-144,1984；kyte&doolittle,j mol.biol.157：105-132,1981,以及goldman等人,ann.rev.biophys.chem.15：321-353,1986开发的蛋白质疏水性模式分析，这些文献通过全文引用并入本文。
[0082]
如本发明所用，术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群体中获得的抗体。也就是说，除了可能天然发生的少量突变之外，构成群体的每个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，并且针对单一抗原。本文中的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，也不应被解释为要求通过任何特定的方法产生的抗体。
[0083]
术语“双特异性抗体”在本发明的语境中应理解为具有由不同的抗体序列限定的两个不同抗原结合区的抗体。这可以理解为与不同的靶标结合，但也包括与一个靶标的不同表位结合。
[0084]
如本发明所用，术语“肿瘤相关抗原”是指与正常细胞相比，在癌细胞中差异表达的抗原，因此可用于靶向癌细胞。
[0085]
如本发明所用，术语“cd3”是指人cd3蛋白复合物，其具有五个肽链，γ链、δ链、ε链、ζ链和η链，并且与t细胞受体α和β链结合以形成tcr-cd3复合物。该术语包括任何cd3变体、亚型和物种同源物，它们可以由包含t细胞在内的细胞天然表达，或者由转染了编码上述链的基因或cdna的细胞表达。
[0086]
如本发明所用，术语“双特异性t细胞衔接器”或“bite”是指具有两个抗原结合域的单多肽链分子，其中一个抗原结合域与t细胞抗原结合，第二个抗原结合域与靶标表面存在的抗原结合(参见pct公开文本wo 05/061547；baeuerle等人，2008，drugs of the future 33：137-147；bargou等人，2008，science 321：974-977，其通过引用整体并入本文)。因此，本公开的bite具有与间皮素结合的抗原结合区和靶向t细胞抗原的第二抗原结合区。
[0087]
如本文所用的术语“载体”是指能够运送其所连接的另一种核酸的核酸分子。
[0088]
如本发明所用，术语“宿主细胞”是指已引入表达载体的细胞。
[0089]
术语“药学上可接受”是指载体或佐剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或这些载体或佐剂被批准或可用于包含在对人类肠胃外给药的药物组
合物中。
[0090]
如本发明所用，术语“治疗”、“处理”等，指施用药剂或进行程序，以便获得效果。这些效果可以就完全或部分地预防疾病或其症状而言是预防性的，和/或可以就影响疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈而言是治疗性的。如本发明所用，“治疗”可包括治疗哺乳动物，特别是人类的疾病或病症(例如癌症)，并且包括：(a)在对疾病易感而尚未被诊断为患病的受试者中预防该疾病或疾病症状的发生(例如，包括可能与原代疾病相关或由其引起的疾病)；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。治疗可指在治疗或改善或预防癌症方面取得成功的任何指代，包括任何客观或主观参数，例如消除；缓解；减少症状或使疾病病症对患者而言更容易忍受；减慢恶化或衰退速度；或使恶化的终点衰弱减少。症状的治疗或改善基于一个或多个客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明公开的抗体或组合物或缀合物，以预防或延迟、缓解或阻止或抑制与疾病(例如癌症)相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”是指受试者中疾病、疾病症状或疾病副作用的减少、消除或预防。
[0091]
本发明所用的术语“有效量”是指当施用至至受试者以治疗疾病时足以实现这种疾病的治疗的量。
[0092]
如本文所用，术语“受试者”是指期望诊断、医治或治疗的任何哺乳动物受试者。用于治疗目的的“哺乳动物”是指任何归类为哺乳动物的动物，包括人、家畜、以及实验室动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴子等。
[0093]
在一个方面，本公开提供了特异性结合间皮素的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，其中vl包含分别具有如seq id no：1-3所示的氨基酸序列的lcdr 1-3，并且vh包含分别具有如seq id no：6-8所示的氨基酸序列的hcdr 1-3。
[0094]
在一些实施方案中，cdr序列根据kabat编号系统定义。
[0095]
当根据kabat编号系统定义cdr序列时，本发明公开的抗体的vl包含分别具有如seq id no：1(sgdalpkqyaf)、seq id no：2(kdserps)和seq id no：3(qsadssatsvi)所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3，本发明公开的抗体的vh包含分别具有如seq id no：6(dyamh)、seq id no：7(giswnsgsigyadsvkg)和seq id no：8(dsgssgwygyfqh)所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0096]
在本发明公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，vl包含与seq id no：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且vh包含与seq id no：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0097]
在一些实施方案中，vl包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：4所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素结合的能力。在一些实施方案中，vh包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：9所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素结合的能力。
[0098]
功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列
同一性的氨基酸序列。例如，seq id no：4的功能变体包含或组成为与seq id no：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。例如，seq id no：98的功能变体包含或组成为与seq id no：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0099]
在一些实施方案中，seq id no：4的功能变体包含或组成为与seq id no：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性并且通过插入、缺失和/或取代seq id no：4中的一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列。在一些实施方案中，seq id no：9的功能变体包含或组成为与seq id no：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性并且通过插入、缺失和/或取代seq id no：9中的一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列。
[0100]
在功能变体的上下文中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是1％到33％，更优选是5％到30％，更优选是10％到25％，更优选是15％到20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1到20，优选是1到10，更优选是1到7，还更优选是1到5，最优选是1到2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6或7。
[0101]
在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(fr)区，例如fr1、fr2、fr3和/或fr4处进行。
[0102]
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守性取代。这种保守性取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：asp、asn、glu和gln；(c)极性、带正电的残基：his、arg和lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：met、leu、he、val和cys；以及(e)芳香族残基：phe、tyr和trp。
[0103]
特别优选的保守性取代如下：ala到gly或到ser；arg到lys；asn到gln或到his；asp到glu；cys到ser；gln到asn；glu到asp；gly到ala或到pro；his到asn或到gln；ile到leu或到val；leu到ile或到val；lys到arg、到gln或到glu；met到leu、到tyr或到ile；phe到met、到leu或到tyr；ser到thr；thr到ser；trp到tyr；tyr到trp；和/或phe到val、到ile或到leu。
[0104]
在优选的实施方案中，vl包含如seq id no：4所示的氨基酸序列，vh包含如seq id no：9所示的氨基酸序列。
[0105]
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五类(同种型)：iga、igd、ige、igg和igm，并可进一步分为不同的亚型，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等。根据轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为lambda(λ)链和kappa(κ)链。本发明公开的抗体可以是上述任何类别或亚型。
[0106]
在一些实施方案中，抗体可以是选自igg、iga、igm、ige和igd的同种型。在一些实施方案中，抗体可以是选自igg1、igg2、igg3和igg4的亚型。在优选的实施方案中，抗体是igg1抗体。
[0107]
本发明公开的抗体可以是完整抗体或其抗原结合片段。抗原结合片段可以是保留与间皮素特异性结合能力的抗体的任何片段。抗原结合片段的实例包含但不限于：fab片段；f(ab')2片段；fab'片段；fd片段；fd'片段；fv片段；scfv片段；dab片段；单独的互补决定区(cdr)；纳米抗体；包含一对串联的fd片段(vh-ch1-vh-ch1)的线性抗体，以及保留抗原结合活性的上述任何片段的修饰形式。
[0108]
在一些实施方案中，抗原结合片段可选自fab、fab’、f(ab')2、fv、scfv和ds-scfv。在优选的实施方案中，抗原结合片段是fab或scfv。在另一个优选的实施方案中，抗原结合片段是fab，所述fab包含具有如seq id no：5(syvltqppsvsvspgqtaritcsgdalpkqyafwyqqkpgqapvlviykdserpsgiperfsgsssgttvtltisgvqaedeadyycqsadssatsvifgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshksyscqvthegstvektvaptecs)所示的氨基酸序列的轻链和具有如seq id no：10(qlvetggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsgiswnsgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycardsgssgwygyfqhwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscgqaghhhhhhgdykddddkg)所示的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与seq id no：5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述重链包含与seq id no：11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0109]
在一些实施方案中，轻链包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：5所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素结合的能力。在一些实施方案中，重链包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：11所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素结合的能力。
[0110]
例如，seq id no：5的功能变体包含或组成为与seq id no：5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。例如，seq id no：11的功能变体包含或组成为与seq id no：11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0111]
在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是1％到33％，更优选是5％到30％，更优选是10％到25％，更优选是15％到20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1到50，优选是1到20，更优选是1到10，还更优选是1到5。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6或7。
[0112]
在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(fr)区，例如fr1、fr2、fr3和/或fr4；和/或恒定区，例如cl、ch1、ch2和/或ch3处进行。
[0113]
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守性取代。保守性取代的实例如上所述。
[0114]
在优选的实施方案中，轻链包含如seq id no：5所示的氨基酸序列，重链包含如seq id no：11所示的氨基酸序列。
[0115]
在其他实施方案中，抗体可以是双特异性或多特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，其进一步包含与第二抗原结合的第二抗原结合区。在一些实施方案中，第二抗原可以是肿瘤相关抗原或免疫细胞抗原。
[0116]
本领域已经鉴定了许多与特定癌症相关的肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是可潜在地激发明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以表征为通常在正常细胞中沉默(即，不表达)的抗原，仅在某些分化阶段表达的抗原，以及随时间表达的抗原，例如胚胎和胎儿抗原。其他癌症抗原由突变的细胞基因例如癌基因(例如活化的ras癌基因)、抑制基因(例如突变的p53)，以及由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其他癌症抗原可以由病毒基因编码，例如rna和dna肿瘤病毒携带的基因。许多其他肿瘤相关抗原和针对其的抗体是已知的和/或可商购获得的，也可以由本领域技术人员制造。
[0117]
肿瘤相关抗原的实例包括但不限于5t4、甲胎蛋白、ca-125、癌胚抗原、cd19、cd20、cd22、cd23、cd30、cd33、cd40、cd56、cd79、cd78、cd123、cd138、c-met、cspg4、igm、c型凝集素样分子1(cll-1)、egfr、egfrviii、上皮肿瘤抗原、erbb2、flt3、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、hiv-1包膜糖蛋白gp41、hiv-1包膜糖蛋白gpl20、黑色素瘤相关抗原、muc-1、突变的p53、突变的ras、ror1、gpc3、vegfr2及其组合。
[0118]
在一些实施方案中，第二抗原可以是t细胞抗原。在一些实施方案中，t细胞抗原可以选自t细胞受体(tcr)、cd3、cd4、cd8、cd16、cd25、cd28、cd44、cd62l、cd69、icos、41-bb(cd137)和nkg2d或其任何组合。在一些实施方案中，t细胞抗原是cd3，第二抗原结合区与cd3的γ链、δ链、ε链、ζ链和η链中的任何结合。
[0119]
在一些实施方案中，第二抗原是cd3，第二抗原结合区包含vl和vh，其中vl包含分别具有如seq id no：12-14所示的氨基酸序列的lcdr 1-3，并且vh包含分别具有如seq id no：17-19所示的氨基酸序列的hcdr1-3。
[0120]
在一些实施方案中，cdr序列根据kabat编号系统定义。当使用kabat定义的cdr序列时，本发明公开的第二抗原结合区的vl包含分别具有如seq id no：12(rsstgavttsnyan)、seq id no：13(gankrap)和seq id no：14(alwysnlwv)所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3，本发明公开的第二抗原结合区的vh包含分别具有如seq id no：17(gftfnty)、seq id no：18(rskynnya)和seq id no：19(hgnfgssyvsyfay)所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0121]
在一些实施方案中，第二抗原结合区包含vl和vh，该vl包含与seq id no：15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且该vh包含与seq id no：20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0122]
在一些实施方案中，vl包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：15所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与cd3结合的能力。在一些实施方案中，vh包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：20所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与cd3结合的能力。
[0123]
例如，seq id no：15的功能变体包含或组成为与seq id no：15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。例如，seq id no：20的功能变体包含或组成为与seq id no：20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0124]
在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是1％到33％，更优选是5％到30％，更优选是10％到25％，更优选是15％到20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1到20，优选是1到10，更优选是1到7，还更优选是1到5，最优选是1到2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6或7。
[0125]
在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(fr)区，例如fr1、fr2、fr3和/或fr4处进行。
[0126]
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守性取代。保守性取代的实例如上所述。
[0127]
在优选的实施方案中，第二抗原结合区包含vl和vh，该vl包含如seq id no：15所示的氨基酸序列，该vh包含如seq id no：20所示的氨基酸序列。
[0128]
在一些实施方案中，第二抗原结合区的vl任选地通过第一接头与特异性结合间皮素的抗体的vl的c端连接，第二抗原结合区的vh任选地通过第二接头与特异性结合间皮素的抗体的vh的c端连接，其中第一接头和第二接头相同或不同。在一些实施方案中，第一接头包含如seq id no：22(ggggsggggsggggs)所示的氨基酸序列，第二接头包含如seq id no：23(gssggggsggggs)所示的氨基酸序列。
[0129]
在一些实施方案中，双特异性抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与seq id no：16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述重链包含与seq id no：21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0130]
在一些实施方案中，轻链包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：16所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素和cd3结合的能力。在一些实施方案中，重链包含通过插入、缺失和/或取代一种或多种氨基酸而形成的如seq id no：21所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素和cd3结合的能力。
[0131]
例如，seq id no：16的功能变体包含或组成为与seq id no：16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至
少99.9％序列同一性的氨基酸序列。例如，seq id no：21的功能变体包含或组成为与seq id no：21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的氨基酸序列。
[0132]
在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是1％到33％，更优选是5％到30％，更优选是10％到25％，更优选是15％到20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1到50，优选是1到20，更优选是1到10，还更优选是1到5。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6或7。
[0133]
在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(fr)区，例如fr1、fr2、fr3和/或fr4；和/或恒定区，例如cl、ch1、ch2和/或ch3处进行。
[0134]
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守性取代。保守性取代的实例如上所述。
[0135]
在优选的实施方案中，轻链包含如seq id no：16所示的氨基酸序列，重链包含如seq id no：21所示的氨基酸序列。
[0136]
在一些实施方案中，双特异性抗体可以是双特异性t细胞衔接器(bite)。在本发明公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，双特异性抗体是如pct申请号pct/us2018/016524(其通过引用整体并入本文)中所述的hbite的形式。在hbite中，轻链从n端到c端包含抗靶标vl结构域、抗cd3 vl-cl和单体人igg1 fc(例如，mfc7.2)；重链从n端到c端包含抗靶标vh结构域、抗cd3 vh-ch1和单体人igg1 fc(例如，mfc7.2)。单体fc7.2包含两个能够抑制fc同源二聚化的氨基酸突变(t366l和y407h)。
[0137]
在另一方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含含有vl和vh的结合间皮素的第一抗原结合区，以及含有vl和vh的结合cd3的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区的vl包含分别具有如seq id no：1-3所示的氨基酸序列的lcdr 1-3，并且第一抗原结合区的vh包含分别具有如seq id no：6-8所示的氨基酸序列的hcdr 1-3；并且第二抗原结合区的vl包含分别具有如seq id no：12-14所示的氨基酸序列的lcdr 1-3，并且第二抗原结合区的vh包含分别具有如seq id no：17-19所示的氨基酸序列的hcdr 1-3。
[0138]
在本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第一抗原结合区的vl包含与seq id no：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，第一抗原结合区的vh包含与seq id no：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的氨基酸序列；并且第二抗原结合区的vl包含与seq id no：15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，第二抗原结合区的vh包含与seq id no：20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0139]
在一些实施方案中，第一抗原结合区的vl包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：4所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素结合的能力。在一些实施方案中，第一抗原结合区的vh包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：9所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该
功能变体保留与间皮素结合的能力。在一些实施方案中，第二抗原结合区的vl包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：15所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与cd3结合的能力。在一些实施方案中，第二抗原结合区的vh包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：20所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与cd3结合的能力。
[0140]
seq id no：4，9，15和20的功能变体可以是如上所述的那些。
[0141]
在优选的实施方案中，第一抗原结合区的vl包含如seq id no：4所示的氨基酸序列，并且第一抗原结合区的vh包含如seq id no：9所示的氨基酸序列；并且第二抗原结合区的vl包含如seq id no：15所示的氨基酸序列，并且第二抗原结合区的vh包含如seq id no：20所示的氨基酸序列。
[0142]
在一些实施方案中，第二抗原结合区的vl任选地通过第一接头与第一抗原结合区的vl的c端连接，第二抗原结合区的vh任选地通过第二接头与第一抗原结合区的vh的c端连接，其中第一接头和第二接头相同或不同。在一些实施方案中，第一接头包含如seq id no：22(ggggsggggsggggs)所示的氨基酸序列，第二接头包含如seq id no：23(gssggggsggggs)所示的的氨基酸序列。
[0143]
在一些实施方案中，双特异性抗体包含单个多肽链，所述单个多肽链包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，以及任选地fc区。
[0144]
fc区可以是任何同种型，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4，并且可包含一种或多种突变或修饰。在一个实施方案中，fc区是igg1同种型或由其衍生的，任选地具有一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，fc区是人igg1 fc。
[0145]
在一个实施方案中，fc区是效应功能缺陷的。例如，fc区可以是igg1同种型，或非igg1型，例如igg2、igg3或igg4，其已发生突变，使得其介导例如adcc的效应功能的能力降低甚至消除。这样的突变在dall'acqua wf等人,j immunol.177(2)：1129-1138(2006)和hezareh m,j virol.；75(24)：12161-12168(2001)中已有描述。
[0146]
在一个实施方案中，fc区包含去除用于asn连接的糖基化的受体位点的突变或以其他方式被操纵以改变糖基化特性。例如，在igg1 fc区中，可以使用n297q突变以去除asn连接的糖基化位点。因此，在一个具体实施方案中，fc区包含具有n297q突变的igg1野生型序列。
[0147]
在进一步的实施方案中，fc区被糖工程化以减少岩藻糖并因此增强adcc，例如通过在抗体产生过程中向培养基中添加化合物，如us2009317869中所述或者如van berkel等人(2010)biotechnol.bioeng.105：350中所述，或者通过使用fut8敲除细胞,例如yamane-ohnuki等人(2004)biotechnol.bioeng 87：614中所述。或者，可以使用等人(1999)nature biotech 17：176描述的方法来优化adcc。在另一个实施方案中，fc区被改造以增强补体激活，例如在natsume等人(2009)cancer sci.100：2411中所述。
[0148]
在一些实施方案中，fc区包含可抑制fc同源二聚体化的修饰或突变。在一些实施方案中，fc区包含人igg1 fc野生型序列的变体。该变体可包含在人igg1 t366和y407(kabat编号)位点处的氨基酸取代。优选地，t366被l(亮氨酸)取代。优选地，y407被i(异亮氨酸)、f(苯丙氨酸)、l(亮氨酸)、m(甲硫氨酸)、h(组氨酸)、k(赖氨酸)、s(丝氨酸)、q(谷氨酰胺)、t(苏氨酸)、w(色氨酸)、a(丙氨酸)、g(甘氨酸)或n(天冬酰胺)取代。更优选地，y407
被组氨酸取代。在一个实施方案中，t366被亮氨酸取代，并且y407被组氨酸取代。
[0149]
在一些实施方案中，fc区可以是单体人igg1 fc(例如，mfc7.2)，如pct申请号pct/us2018/016524中所述，其通过引用整体并入本文。
[0150]
在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一多肽链，所述第一多肽链包含第一抗原结合区的vl和第二抗原结合区的vl，和任选地fc区；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含第一抗原结合区的vh和第二抗原结合区域的vh，和任选地fc区。fc区可以是如上所述的那些。
[0151]
在一些实施方案中，第一多肽链还包含轻链恒定区(cl)。在一些实施方案中，第一多肽链包含如上所述的单体人igg1 fc(例如，mfc7.2)。在一些实施方案中，第一多肽链从n端到c端包含：第一抗原结合区的vl、第二抗原结合区的vl、cl和mfc7.2。
[0152]
在一些实施方案中，第二多肽链还包含重链恒定区(ch)，例如ch1。在一些实施方案中，第二多肽链包含如上所述的单体人igg1 fc(例如，mfc7.2)。在一些实施方案中，第二多肽链从n端到c端包含：第一抗原结合区的vh、第二抗原结合区的vh、ch1和mfc7.2。
[0153]
在一些实施方案中，双特异性抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与seq id no：16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述重链包含与seq id no：21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0154]
在一些实施方案中，轻链包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：16所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素和cd3结合的能力。在一些实施方案中，重链包含通过插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸而形成的如seq id no：21所示的氨基酸序列的功能变体，前提是该功能变体保留与间皮素和cd3结合的能力。
[0155]
seq id no：16和21的功能变体可以是如上所述的那些。
[0156]
在优选的实施方案中，轻链包含如seq id no：16所示的氨基酸序列，重链包含如seq id no：21所示的氨基酸序列。
[0157]
在一些实施方案中，双特异性抗体可以是双特异性t细胞衔接器(bite)，优选地是如上所述的hbite。
[0158]
在又一方面，本公开提供了核酸，其包含编码本发明公开的抗体或其抗原结合片段或本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
[0159]
在另一方面，本公开提供了包含本发明公开的核酸的载体。
[0160]
任何载体都可以适用于本公开。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、dna载体、鼠白血病病毒载体、sfg载体、质粒、rna载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、epstein barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(aav)、慢病毒载体或其任意组合。合适的示例性载体包括例如pgar、pbabe-puro、pbabe-neo largetcdna、pbabe-hygro-htert、pmko.1gfp、mscv-ires-gfp、pmscv pig(puro ires gfp空质粒)、pmscv-loxp-dsred-loxp-egfp-puro-wpre、mscv ires萤光素酶、pmig、mdh1-pgk-gfp_2.0、ttrmpvir、pmscv-ires-mcherry fp、pretrox gfp t2a cre、prxtn、plncexp和plxin-luc。
[0161]
重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括被设计用于繁殖
和扩增或用于表达或两者的载体，例如质粒和病毒。例如，载体可以选自puc系列(fermentas life sciences,glen burnie,md.)、pbluescript系列(stratagene,lajolla,ca)、pet系列(novagen,madison,wis.)、pgex系列(pharmacia biotech，uppsala，瑞典)和pex系列(clontech，palo alto，calif.)。也可以使用噬菌体载体，例如λgt10、λgt11、λzapii(stratagene)、λembl4和λnm1149。可用于本公开的植物表达载体的实例包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。可用于本公开的动物表达载体的实例包括pcdna、peuk-cl、pmam和pmamneo(clontech)。
[0162]
重组表达载体可以使用标准重组dna技术制备，例如sambrook等人,molecular cloning：a laboratory manual,第三版,cold spring harbor press,cold spring harbor,n.y.2001；以及ausubel等人,current protocols in molecular biology,greene publishing associates and john wiley&sons,ny,1994中所述。可以制备环形或线性的表达载体构建体以包含在原核或真核宿主细胞中具有功能的复制系统。复制系统可以衍生自例如colel、2μ质粒、λ、sv40、牛乳头瘤病毒等。
[0163]
在另一方面，本公开提供了包含本发明公开的核酸或本发明公开的载体的宿主细胞。
[0164]
任何细胞都可以用作本公开的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(enterobactehaceae)，例如埃希氏杆菌属(escherichia)，例如大肠杆菌(e.coli)；肠杆菌属(enterobacter)；欧文氏菌属(erwinia)；克雷伯氏菌属(klebsiella)；变形杆菌(proteus)；沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(serratia)，例如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans)；和志贺氏菌属(shigella)；芽孢杆菌属(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)；假单胞菌(pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)；和链霉菌(streptomyces)。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括例如cho细胞，例如chos细胞和cho-k1细胞，或hek293细胞，例如hek293a、hek293t和hek293fs。
[0165]
在又一方面，本公开提供了药物组合物，其包含(i)本发明公开的抗体或其抗原结合片段，或本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0166]
在一些实施方案中，与本发明公开的组合物一起使用的载体或赋形剂包括但不限于马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、n-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、n,n-二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚和表面活性剂聚氧乙烯-脱水山梨糖醇单油酸酯。
[0167]
在本发明公开的药物组合物的一些实施方案中，药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、lag3抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂和糖皮质激素，或其任意组合。
[0168]
在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。化学治疗剂可以包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱衍生物、蒽二酮、蒽环类、表鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如头孢菌素、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如烷基磺酸盐、亚乙基亚胺、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。
[0169]
在又一方面，本公开提供了缀合物，其包含本发明公开的抗体或其抗原结合片段或本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。
[0170]
在本发明公开的缀合物的一些实施方案中，化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。
[0171]
在一些实施方案中，治疗剂包括但不限于免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如穿孔素)、化学治疗剂(例如顺铂)或毒素。在一些实施方案中，治疗剂可以是例如美登素、格尔德霉素、微管蛋白抑制剂例如微管蛋白结合剂(例如奥瑞他汀类)或小沟结合剂例如加利车霉素(calicheamicin)。
[0172]
其他合适的治疗剂包括例如小分子细胞毒剂，即具有杀死哺乳动物细胞能力的分子量小于700道尔顿的化合物。这样的化合物还可包含能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒剂还包括药物前体，即在生理条件下分解或转化以释放细胞毒剂的化合物。此类药剂的实例包括顺铂、美登素衍生物、雷切霉素、加利车霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠ii、替莫唑胺、托泊替康、三甲双胍、奥瑞他汀e、长春生物碱和多柔比星；肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段，例如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素a、dna酶和rna酶；放射性核素，即随着α或β粒子或γ射线的一种或多种的同时发射而衰变的元素的不稳定同位素，例如碘-131、铼-186、铟-111、钇-90、铋-210、铋-213、锕-225和砹-213；螯合剂，其可用于促进这些放射性核素与分子或其多聚体的结合。
[0173]
在一些实施方案中，可检测部分可以选自生物素、链霉抗生物素蛋白、酶或其催化活性片段、放射性核素、纳米颗粒、顺磁性金属离子或荧光、磷光，或化学发光分子。用于诊断目的的可检测部分包括例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。
[0174]
在一些实施方案中，免疫刺激分子是激发免疫应答的免疫效应分子。例如，免疫刺激分子可以是细胞因子如il-2和ifn-γ、趋化因子如il-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白、补体激活剂；病毒/细菌蛋白结构域，或病毒/细菌肽。
[0175]
在另一方面，本公开提供了治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物。
[0176]
在本发明公开的方法的一些实施方案中，癌症是间皮素阳性癌症。在一些实施方案中，癌症可以选自间皮瘤、肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤和骨髓瘤。优选地，该癌症选自间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌(胰腺腺癌)、肺癌(如肺间皮瘤、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、胃癌和卵巢癌。在优选的实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(tnbc)。
[0177]
在一些实施方案中，施用于受试者的剂量可随实施方案、所用药物、给药方法以及被治疗的部位和受试者而变化。然而，剂量应足以提供治疗反应。临床医生可以确定给予人或其他受试者以治疗医学病症的有效量。治疗有效所需的精确量可取决于许多因素，例如抗体的活性和给药途径。
[0178]
本文所述的抗体、组合物或缀合物的剂量可以在合适的时间段内一次性或以一系列亚剂量的形式施用给哺乳动物，例如根据需要，每天、每半周、每周、每两周、每半月、每两月、每半年或每年施用一次。包含有效量的抗体、组合物或缀合物的剂量单位可以以单日剂量给药，或者总日剂量可以根据需要以每日给药的两个、三个、四个或更多个分剂量给药。
[0179]
合适的给药方式可由医生选择。给药途径可以是肠胃外给药，例如通过注射给药、经鼻给药、经肺给药或经皮给药。可以通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射进行全身或局部给药。在一些实施方案中，选择抗体、组合物或缀合物用于肠胃外递送、吸入或通过消化道递送，例如口服。给药剂量和方法可以根据受试者的重量、年龄、条件等而变化，并且可以适当地选择。
[0180]
在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二治疗剂。在某些实施方案中，在施用第二治疗剂之前、基本上同时或之后施用结合剂。
[0181]
在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些优选的实施方案中，第二治疗剂可以选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、lag3抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂和糖皮质激素，或其任意组合。
[0182]
在一些实施方案中，第二治疗剂是化学治疗剂。化学治疗剂可以包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱衍生物、蒽二酮、蒽环类、表鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如头孢菌素、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如烷基磺酸盐、亚乙基亚胺、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。
[0183]
在另一方面，本公开提供了检测受试者中的间皮素阳性癌症的方法，其包括(i)使从受试者获得的样品与本发明公开的抗体或其抗原结合片段、或本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、或本发明公开的缀合物接触；和(ii)检测抗体或其抗原结合片段与样品中的间皮素的结合。
[0184]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与可检测部分连接。可检测部分可以选自生物素、链霉抗生物素蛋白、酶或其催化活性片段、放射性核素、纳米颗粒、顺磁性金属离子，或荧光、磷光或化学发光分子。用于诊断目的的可检测部分包括例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。
[0185]
在一些实施方案中，癌症是间皮素阳性癌症。优选地，该癌症选自间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌(胰腺腺癌)、肺癌(如肺间皮瘤、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、胃癌和卵巢癌。在优选的实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(tnbc)。在又一方面，本公开提供了一种药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，该容器填充有本发明所述的药物组合物的一种或多种成分，例如本发明公开的抗体或抗原结合片段。任选地，与此类容器相关联的可以是由管理药品或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了由政府机构批
准制造、使用或销售以用于人类施用。
[0186]
在一个具体实施方案中，该试剂盒包含含有本发明公开的抗体或抗原结合片段的第一容器。在一个具体的实施方案中，该试剂盒包含第一容器，该容器是含有在真空下作为冻干无菌粉末的抗体或抗原结合片段的小瓶，并且该试剂盒还包含含有药学上可接受的流体的第二容器。
[0187]
在一个具体的实施方案中，本发明提供了包含本发明公开的抗体或抗原结合片段的注射装置。在一个具体实施方案中，注射装置包含无菌溶液形式的抗体。在一个具体实施方案中，注射装置是注射器。
[0188]
在又一方面，本公开提供了用于检测样品中间皮素抗原的存在的试剂盒，其包含本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、或本发明公开的缀合物。优选地，抗体或其抗原结合片段与可检测部分连接。可检测部分可以选自生物素、链霉抗生物素蛋白、酶或其催化活性片段、放射性核素、纳米颗粒、顺磁性金属离子，或荧光、磷光或化学发光分子。用于诊断目的的可检测部分包括例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。
[0189]
在另一方面，本公开提供了本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，癌症是间皮素阳性癌症。
[0190]
在另一方面，本公开提供了本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物，其用于治疗受试者的癌症。在一些实施方案中，癌症是间皮素阳性癌症。
[0191]
在又一方面，本公开提供了本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物在制备用于检测受试者中的间皮素阳性癌症的试剂盒中的用途。
[0192]
在另一方面，本公开提供了本发明公开的抗体或其抗原结合片段、本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本发明公开的药物组合物或本发明公开的缀合物，其用于检测受试者中的间皮素阳性癌症。
[0193]
在本文公开的用途的一些实施方案中，间皮素阳性癌症优选地选自间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌(胰腺腺癌)、肺癌(如肺间皮瘤、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、胃癌和卵巢癌。在优选的实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(tnbc)。
实施例
[0194]
列出以下实施例以阐述本发明的各种实施方案，并非旨在以任何形式限制本发明。本实施例以及本发明描述的方法目前代表优选实施方案，是示例性的，并非旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到包含在由权利要求的范围限定的本发明的精神内的变化和其他用途。
[0195]
包括h226(人肺鳞状细胞癌细胞系)、n87(人胃癌细胞系)和ls174t(人结直肠癌细胞系)在内的细胞系购自国家认证细胞培养物收藏中心。
[0196]
通过使用lipofectamine
tm ltx试剂、plus
tm
试剂(thermo)和转染特异性培养基opti-mem
tm i(gibco)将商用msln重组质粒pcmv-msln(sino biological)瞬时转染到
ls174t细胞中产生稳定表达间皮素的肿瘤细胞系ls174t-msln(2b6)。在细胞培养物中添加潮霉素b并选择阳性克隆。2-3周后，逐渐分离出单个阳性克隆并用流式细胞术验证。
[0197]
人间皮素(msln)蛋白和食蟹猴间皮素(msln)(296-580)蛋白购自acrobiosystems。抗人igg(γ链特异性)-r-pe抗体、抗人igg(fc特异性)-过氧化物酶抗体和单克隆抗-过氧化物酶购自sigma。m13ko7辅助噬菌体购自invitrogen。dynabeads
tm myone
tm
链霉亲和素t1购自thermofisher scientific。pe抗his标签抗体购自biolegend。
[0198]
实施例1.淘选和筛选噬菌体展示的天然人fab文库以鉴定间皮素抗体
[0199]
如前所述(zhu等人,j virol 2006,80：891-899)(对其稍加修改，分别在第一轮、第二轮和第三轮淘选中使用5、1和0.2mg的抗原)，使用具有来自约30个健康个体的外周血b细胞的两个大型(规模，10
11
)噬菌体展示的天然人fab文库来选择针对与磁珠(dynabeads
tm myone
tm
链霉亲和素t1；thermofisher scientific)缀合的重组人间皮素的抗体。在第3轮生物淘选后，通过使用多克隆噬菌体elisa观察到强阳性信号。随后测试第3轮噬菌体的特异性结合。通过基于可溶性表达的单克隆酶联免疫吸附测定(semelisa)和dna测序分析，鉴定出命名为m8、m10和m38的三种特定fab克隆。这三种fab克隆都具有λ轻链。
[0200]
将六组氨酸标记的m8 fab、m10 fab和m38 fab在大肠杆菌菌株hb2151中表达，并使用ni-nta树脂从周质的可溶性部分中纯化。然后使用标准方案进行elisa以测量对重组人间皮素(全长胞外域)的结合亲和力。简而言之，将重组人间皮素(acrobiosystems)以50ng每孔在corning eia/ria高结合的96孔板(corning公司)上，在4℃下包被过夜，并用在pbs(ph7.4)中的3％的脱脂牛奶封闭。加入五倍连续稀释的抗体并在室温下孵育2小时。使用含有0.05％吐温20的pbs洗涤板。通过hrp缀合的抗flag标签抗体(sino biological)检测结合的抗体。该测定在室温下用tmb底物(solarbio)进行显色，并用酶标仪在450nm处测量od值。结果显示m8 fab、m10 fab和m38 fab分别具有ec
50
为127nm、21nm和15.7nm的亲和力(图1)。
[0201]
为了测量m8 fab、m10 fab和m38 fab对细胞表面结合的间皮素的结合，用间皮素瞬时转染的hek293细胞进行流式细胞术。商用抗间皮素抗体(抗间皮素-fitc，miltenyi，cat#：130-118-167)用作阳性对照。结果表明，只有m10 fab具有与细胞表面结合的间皮素结合的能力(图2)。
[0202]
然后，采用包括h226和n87在内的癌细胞系进一步测试了m10 fab与细胞表面结合的间皮素的结合。每个细胞系(5x105个细胞)与fab抗体(10μg/ml)在冰上孵育60分钟。将细胞用含有0.1％牛血清白蛋白的pbs(pbsa)洗涤一次，并重悬于200ml pbsa中。然后加入2μl抗his-pe缀合物(biolegend)并孵育60分钟。细胞用pbsa洗涤一次然后用于流式细胞术分析。结果如图3所示。
[0203]
从图3可以看出，m10 fab与h226和n87细胞结合良好，表明m10fab可以与表达间皮素的癌细胞系结合良好。
[0204]
实施例2.抗间皮素单克隆抗体的构建和初步表征
[0205]
使用fab克隆m10构建完整形式的抗人间皮素单克隆抗体igg1(m10mab)。简而言之，将m10 fab的重链fd片段融合到人igg1 fc片段的n端。将轻链和重链均构建到载体pdin1中，该载体由发明人从pdr12修饰而来，以包含两个分子克隆位点(mcs)。m10 mab的构
建和初步表征如下进行。
[0206]
抗间皮素单克隆抗体的克隆
[0207]
为产生抗间皮素单克隆抗体的构建体，使用以下引物：
[0208]
bnigg20l1，5’gtgtaagcttaccatgggtgtgcccactcaggtcctggggt 3’(正义)(seq id no:24)；
[0209]
msln-igg1-vl-正向,5’cttacagatgccagatgttcctatgtgctgactcag 3’(正义)(seq id no:25)；
[0210]
msln-igg1-vl-反向，5’cggaattcttatgaacattctgtaggggccac 3’(反义)(seq id no:26)；
[0211]
msln-igg1-vh-fp-xba1,5’tgttctagagccaccatggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaactacaggtgtccactcccagctggtggaga 3’(正义)(seq id no:27)；
[0212]
msln-igg1-vh-rp-ol,5’atgtgtgagttttgtcacaagatttgggctcaact 3’(反义)(seq id no:28)；
[0213]
msln-igg1-fc-fp-ol,5’gacaaaactcacacatgcccaccgt 3’(正义)(seq id no:29)；
[0214]
msln-igg1-fc-rp-sal1,5’ctgagtcgacttatttacccggggacagggaga 3’(反义)(seq id no:30)。
[0215]
为产生轻链，使用引物对msln-igg1-vl-正向/msln-igg1-vl-反向从抗间皮素m10 fab扩增vl基因片段。使用引物对bnigg20l1/msln-igg1-vl-反向通过重叠pcr将前导l肽融合到vl pcr片段的5’端。通过使用限制性酶ecor i/hind iii，将pcr产物克隆到含有cl和igg1轻链fc片段的pdin1载体的mcs中。
[0216]
为产生重链，使用引物对msln-igg1-vh-fp-xba1/msln-igg1-vh-rp-ol从抗间皮素m10 fab扩增vh-ch1基因片段。使用引物对msln-igg1-fc-fp-ol/msln-igg1-fc-rp-sal1从不相关的igg1扩增fc结构域。为获得全长重链，使用引物对msln-igg1-vh-fp-xba1/msln-igg1-fc-rp-sal1通过重叠pcr将这两个基因片段融合在一起。然后将全长重链基因片段通过xbai和sali限制性位点克隆到含有抗间皮素轻链插入物的重组质粒中。
[0217]
蛋白质表达、纯化和初步表征
[0218]
在293fs或cho-s细胞中表达抗间皮素m10 mab。将质粒和转染剂pei以1:3的比例混合，然后滴加到293fs或cho-s细胞培养物中。转染后细胞继续生长5-7天。通过8000rpm离心20分钟收获细胞培养物。将含有目标蛋白的培养上清液加载到protein a sepharose 4fast flow柱层析(ge healthcare)上，并根据制造商的说明进行纯化。
[0219]
对纯化的蛋白质进行sds-page。在非还原性sds-page上，m10 mab显示出约150kda的表观分子量(amw)。在还原性sds-page上，重链和轻链分别具有约55kda和30kda的表观分子量(数据未显示)。根据kabat编号系统的m10 mab cdr序列如表1所示。轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的氨基酸序列如表2所示。m10 mab的完整轻链和重链序列如表3所示。
[0220]
表1.m10 mab的cdr序列
[0221]
lcdr1sgdalpkqyaf(seq id no:1)lcdr2kdserps(seq id no:2)lcdr3qsadssatsvi(seq id no:3)
hcdr1dyamh(seq id no:6)hcdr2giswnsgsigyadsvkg(seq id no:7)hcdr3dsgssgwygyfqh(seq id no:8)
[0222]
表2.m10 mab的vl和vh序列
[0223][0224]
表3.m10 mab的轻链和重链序列
[0225][0226]
实施例3.抗间皮素单克隆抗体与间皮素的结合
[0227]
根据标准方案进行elisa，以确定抗间皮素m10 mab对重组人间皮素(acrobiosystems)的结合亲和力。简而言之，将重组人间皮素以每孔50ng在corning eia/ria高结合96孔板(corning公司)上，在4℃下包被过夜并用pbs(ph7.4)中的3％脱脂牛奶封闭。加入五倍连续稀释的抗体并在室温下孵育2小时。用含有0.05％tween 20的pbs洗涤板。通过hrp缀合的链霉亲和素(sino biological)检测结合的抗体。该测定室温下用tmb底物(solarbio)进行显色，并用酶标仪在450nm处监测。通过将数据拟合到langmuir吸附等温线
来计算半数最大结合(ec
50
)。结果如图4所示。
[0228]
结果表明m10 mab可以以0.2nm的ec
50
结合重组人间皮素，表明m10mab对人间皮素具有高结合亲和力。
[0229]
实施例4.抗间皮素单克隆抗体与癌细胞系的结合
[0230]
为测量抗间皮素m10 mab与细胞表面结合的间皮素的结合能力，用间皮素阳性癌细胞系h226进行流式细胞术。将约5
×
105个细胞与抗体(10μg/ml)在冰上孵育1小时。将细胞用含有0.1％牛血清白蛋白的pbs(pbsa)洗涤一次，并重悬于100μl pbsa中。然后加入1μl抗人igg(fc-特异性)-fitc缀合物(sigma)并孵育30分钟。细胞用pbsa洗涤一次，然后用于流式细胞术分析。结果如图5所示。
[0231]
结果表明m10 mab与h226结合良好，表明m10 mab对间皮素阳性肿瘤细胞系具有良好的结合能力。
[0232]
实施例5.抗间皮素单克隆抗体介导的对人癌细胞系的adcc杀伤
[0233]
为评估m10 mab的adcc杀伤，使用h226细胞作为靶细胞，nk细胞作为效应细胞。复苏冷冻的nk细胞(biotechnologies，cat#:pb56-n-1cw)，并在含有20％fbs、1％青霉素/链霉素和50iu il-2的rpmi1640完全培养基中，在5％co2培养箱中37℃培养过夜。用完全培养基将h226细胞制备成1
×
105个细胞/ml的浓度，以100μl/孔加入96孔板，并在含有5％co2的37℃培养箱中培养过夜。第二天，用完全培养基制备一系列浓度(400μg/ml、40μg/ml和0μg/ml)的m10 mab，以igg4同种型抗体作为阴性对照。将50μl抗体溶液加入含有h226细胞的96孔板中。收获nk细胞并稀释至3
×
105个细胞/ml，然后以50μl/孔加入96孔板。将板在5％co2培养箱中37℃培养72小时。抗体的最终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml和0μg/ml。孵育72h后，去除培养基并更换为100μl/孔的含有10％cck8的新鲜完全培养基，并将板在37℃下孵育30分钟。使用elisa读数器测量450nm处的od值。杀伤效率按下式计算：
[0234]
(od
肿瘤 nk 0μg/ml mab-od
肿瘤 nk xμg/ml mab
)/od
肿瘤 nk 0μg/ml mab
×
100％,
[0235]
其中x代表10或100。
[0236]
m10 mab对h226细胞的adcc杀伤如图6所示。结果表明，m10 mab在10μg/ml时诱导对肿瘤细胞的低于10％的杀伤，在100μg/ml时诱导对肿瘤细胞的超过30％的杀伤，而对照抗体igg4同种型在100μg/ml的最高浓度下不诱导任何adcc，表明adcc由m10 mab与间皮素阳性肿瘤细胞h226的特异性结合以及通过mab的fc部分募集nk细胞而触发。这表明m10 mab具有诱导对间皮素阳性肿瘤细胞的adcc杀伤的强效能力。
[0237]
实施例6.抗间皮素双特异性抗体的构建和初步表征
[0238]
双特异性t细胞衔接器(bite)是一类新型双特异性抗体，其可通过同时结合肿瘤抗原和t细胞抗原如t细胞表面的cd3分子来引导细胞毒性t细胞杀死癌细胞。如pct申请号pct/us2018/016524(其通过引用整体并入本文)中所述的hbite是bite的特定形式。hbite具有形成异源二聚体的轻链和重链。轻链从n端到c端包含抗靶标(例如肿瘤抗原)vl结构域、抗cd3 vl-cl和单体人igg1 fc(例如mfc7.2)。重链从n端到c端包含抗靶标vh结构域、抗cd3 vh-ch1和单体人igg1 fc(例如mfc7.2)。单体fc7.2包含两个能够抑制fc同源二聚化的氨基酸突变(t366l和y407h)。为产生msln
×
cd3 hbite，将上述抗间皮素抗体的vl和vh结构域分别通过接头ggggsggggsggggs(seq id no:22)和gssggggsggggs(seq id no:23)与抗cd3 fab的vl和vh结构域的n端融合。抗cd3 fab进一步融合到mfc7.2的n端。将轻链和重链
构建到单个载体pdin1中，用于在哺乳动物细胞中表达。靶向间皮素和cd3的双特异性抗体(基于m10的msln
×
cd3 hbite)的构建和初步表征如下进行。
[0239]
靶向间皮素和cd3的双特异性抗体的克隆
[0240]
为了生成基于m10的msln
×
cd3 hbite的双特异性抗体的构建体，使用以下引物：
[0241]
bnigg20l1，5’gtgtaagcttaccatgggtgtgcccactcaggtcctggggt 3’(正义)(seq id no:24)；
[0242]
msln-vl-正向,5’actacaggtgtccactcctcctatgtgctgactcagc 3’(正义)(seq id no:31)；
[0243]
msln-vl-反向，5’gtaggatcctaggacggtcagcttggtc 3’(反义)(seq id no:32)；
[0244]
bnigg20h1,5’gtgttctagagccgccaccatggaatggagctgggtctttc 3’(正义)(seq id no:33)；
[0245]
msln-vh-正向，5’ggcttacagatgccagatgtcagctggtggagaccgg 3’(正义)(seq id no:34)；
[0246]
msln-vh-反向，5’gatagagctccctccacctgaggagacggtgacc 3’(反义)(seq id no:35)。
[0247]
为产生双特异性抗体，分别用引物对msln-vl-正向/msln-vl-反向和msln-vh-正向/msln-vh-反向从m10 fab扩增vl和vh结构域的基因片段。分别使用引物对bnigg20h1/msln-vl-反向和bnigg20l1/msln-vh-反向通过重叠pcr将pcr产物融合到h前导序列和l前导序列的3’末端。将h前导序列-vl基因片段用xbai和bamhi消化并克隆到hbite衍生的pdin1载体中，该载体含有抗cd3 hsp34 fab和完整的fc片段。然后通过hindiii和saci限制性位点将l前导序列-vh基因片段进一步克隆到含有h前导序列-vl插入物的重组质粒中。基于m10的msln
×
cd3 hbite被命名为cmd007。
[0248]
蛋白质表达、纯化和初步表征
[0249]
cmd007在293fs或cho-s细胞中表达。将质粒和转染剂pei以1:3的比例混合，然后加入到293fs或cho-s细胞培养物中。转染后细胞继续生长5-7天。通过8000rpm离心20分钟收获细胞培养物。将含有目标蛋白的培养上清液加载到protein a sepharose 4fast flow柱层析(ge healthcare)上，并根据制造商的说明进行纯化。
[0250]
对纯化的蛋白质进行sds-page。在非还原性sds-page上，cmd007显示出约120kda的表观分子量(amw)。在还原性sds-page上，重链和轻链彼此接近，具有约62kda的表观分子量(数据未显示)。根据kabat编号系统的cmd007的cdr序列如表4所示。轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的氨基酸序列如表5所示。cmd007的轻链和重链序列如表6所示。
[0251]
表4.cmd007的cdr序列
[0252]
[0253][0254]
表5.cmd007的vl和vh序列
[0255][0256]
表6.cmd007的轻链和重链序列
[0257]
[0258][0259]
实施例7.双特异性抗体与间皮素和cd3的结合
[0260]
为确定双特异性抗体cmd007对间皮素和cd3的结合亲和力，如实施例3中所述进行elisa实验，其中使用人间皮素或人cd3蛋白进行包被。结果如图7a到7b所示。
[0261]
结果表明，cmd007以12.1nm的ec
50
结合人cd3(图7a)，并以8.3nm的ec
50
结合人间皮素(图7b)。这些结果表明cmd007可以与间皮素和cd3蛋白结合，其亲和力适合用作bite以触发t细胞杀伤肿瘤细胞。
[0262]
实施例8.靶向间皮素和cd3的双特异性抗体与癌细胞系的结合
[0263]
为了确定双特异性抗体cmd007对细胞表面表达的间皮素和cd3的结合亲和力，使用间皮素阳性癌细胞系h226、cd3阳性jurkat细胞系、间皮素阴性癌细胞ls174t(阴性对照)和用间皮素稳定转染的ls174t-msln(2b6)进行流式细胞术。程序与实施例4中所述类似。结果如图8a到8d所示。
[0264]
结果表明，cmd007与h226、jurkat和ls174t-msln(2b6)细胞结合良好，但不与间皮素阴性ls174t细胞结合。这表明cmd007可以与表达间皮素的癌细胞和表达cd3的细胞结合。
[0265]
实施例9.双特异性抗体介导的t细胞活化
[0266]
为评估在表达间皮素的肿瘤细胞存在下，cmd007激活人t细胞的能力和特异性，将
靶细胞(一种间皮素阴性细胞ls174t和两种间皮素阳性细胞ls174t-msln(2b6)和h226)以每孔100μl rmpi1640完全培养基中1
×
104(对于h226)或2
×
104(对于ls174t和ls174t-msln(2b6))个细胞的密度接种在96孔板上。每孔加入50μl 5倍连续稀释的cmd007，双特异性抗体cmd006-m2(含抗cd3 fab、无关的taa抗体可变片段和mfc7.2)作为阴性对照。然后以每孔50μl rmpi1640完全培养基中1
×
105个细胞的密度添加效应细胞(jurkat细胞)，靶细胞：效应细胞比例为1:10(h226：jurkat)或1:5(ls174t：jurkat以及ls174t-msln(2b6):jurkat)。孵育24小时后，使用bd facs calibur，采用cd3单克隆抗体(17a2)、人cd69单克隆抗体(fn50)、抗cd25/il2ra抗体(apc)和小鼠单克隆抗体按照制造商的说明对测定进行显影。
[0267]
首先，使用h226、ls174t-msln(2b6)和ls174t细胞测定早期激活标志物cd69的表达。在间皮素阳性h226细胞存在的情况下，cmd007有效激活人jurkat细胞(63％)。对于ls174t-msln(2b6)细胞，cmd007也有效激活人t细胞(65％)。对于cmd007与jurkat细胞单独孵育、或cmd007与间皮素阴性细胞ls174t和jurkat细胞一起孵育、或对照抗体cmd006-m2与jurkat和ls174t-msln(2b6)细胞一起孵育的阴性对照组，没有检测到cd69的表达(图9)。结果表明，只有当cmd007同时与jurkat细胞的cd3抗原和肿瘤细胞的间皮素抗原结合时，t细胞才被激活。
[0268]
接下来，用ls174t-msln(2b6)和ls174t细胞测定t细胞活化标志物cd25的表达。当cmd007与间皮素阳性ls174t-msln(2b6)细胞和jurkat细胞一起孵育时，观察到约45％的jurkat细胞表达cd25。对于cmd007与间皮素阴性ls174t细胞和jurkat细胞一起孵育或对照抗体cmd006-m2与ls174t-msln(2b6)和jurkat细胞一起孵育的阴性对照组，未检测到cd25的表达(图10)。这些结果表明，只有当cmd007与表达cd3的jurkat细胞和表达间皮素的肿瘤细胞结合时，t细胞才被激活，这表明t细胞激活是特异性靶肿瘤抗原依赖性的。
[0269]
实施例10.双特异性抗体介导的人癌细胞系的杀伤
[0270]
双特异性t细胞衔接器可以同时与肿瘤抗原和t细胞抗原(例如t细胞表面的cd3分子)结合，导致t细胞聚集和活化，从而最终导致肿瘤细胞的杀伤。为了评估双特异性抗体cmd007的杀伤效率，使用三种表达间皮素的肿瘤细胞系h226、n87和ls174t-msln(2b6)作为靶细胞进行cck8测定。
[0271]
将靶细胞(h226为1
×
104，n87为3
×
104，ls174t-msln(2b6)为2
×
104)接种在100μl rpmi 1640完全培养基中过夜。同时，将冷冻的pbmc复苏并接种在30ml rpmi 1640完全培养基中过夜。在第二天，加入在50μlrpmi 1640完全培养基中的pbmc(h226和ls174t-msln(2b6)为1
×
105，n87为3
×
105)。然后，将50μl抗体(h226和n87从4μg/ml连续稀释5倍，ls174t-msln(2b6)从3.2μg/ml连续稀释5倍)添加到每个孔中，并将igg4同种型抗体用作阴性对照。孵育48小时后，去除培养基并加入100μl含有20％cck8的rpmi 1640完全培养基，并在co2培养箱中孵育30分钟。根据制造商的说明使用酶标仪测量细胞杀伤活性。结果如图11到13所示。
[0272]
结果表明，在cmd007和pbmc存在的情况下，几乎100％的肿瘤细胞n87和ls174t-msln(2b6)被杀伤。cmd007对n87杀伤的ec
50
为1.381ng/ml(图11)，cmd007对ls174t-msln(2b6)杀伤的ec
50
为1.685ng/ml(图12)。对于h226细胞，cmd007显示出中等杀伤效率，在pbmc存在下约50％的肿瘤细胞被杀伤，cmd007对h226杀伤的ec
50
为0.812ng/ml(图13)。
[0273]
总之，结果表明cmd007对表达间皮素的多种癌细胞系具有强效的杀伤能力。
[0274]
实施例11.双特异性抗体介导的小鼠肿瘤生长抑制
[0275]
药代动力学测定
[0276]
在第0天向三只nod/scid小鼠静脉内施用300μg cmd007。在处理后0.25小时、5小时、21小时、49小时和69小时的时间点收集血浆样品，用于通过elisa测量抗体血清浓度。
[0277]
结果表明，cmd007的血清浓度逐渐下降，但直到终点仍保持较高水平，计算出的血清半衰期(t
1/2
)为约57.3小时(图14)。
[0278]
体内肿瘤生长抑制
[0279]
将效应细胞pbmc(100μl，1
×
106)和表达间皮素的肿瘤细胞ls174t-msln(2b6)(100μl，1
×
106)混合在100μl基质胶中并皮下接种到b-ndg小鼠的右腹部。在实验组中，向小鼠静脉注射50μg/kg或200μg/kg的cmd007。200μg/kg的igg4同种型抗体用作阴性对照。这些小鼠每周给药两次。处理三周后，处死小鼠并测量小鼠的肿瘤体积和体重。使用以下公式计算肿瘤生长抑制率：
[0280]
(对照组平均体重-实验组平均体重)/对照组平均体重。
[0281]
结果表明，cmd007以剂量依赖性方式显示出对肿瘤生长的有效抑制(图15a)。所有组中小鼠的体重只有很小的变化(图15b)。200μg/kg的cmd007显示出95％的肿瘤生长抑制，50μg/kg的cmd007显示出61％的肿瘤生长抑制(图15c)。
[0282]
总之，结果表明cmd007具有长的血清半衰期，并且可以特异性地有效抑制表达间皮素的肿瘤细胞的生长，表明其用于治疗间皮素阳性癌症的潜力。
[0283]
虽然已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变体、变化和替换。应当理解，可以采用本文描述的实施方案的各种替代方案。旨在使以下权利要求限定本发明的范围，并且覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。