一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记及其筛选方法和应用与流程

1.本发明属于水产动物繁殖育种技术领域，具体涉及一种用于鉴别克氏原螯虾雌雄性别的分子标记及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.克氏原螯虾(procambarus clarkii)俗称小龙虾，隶属于十足目(decapoda)、螯虾亚目(astacidea)、蝲蛄科(cambaridae)、原螯虾属(procambarus)。克氏原螯虾原产地为美国南部与墨西哥北部，现广泛分布于世界各地，成为了有名的外来入侵物种。克氏原螯虾在中国广泛分布于江苏、安徽、浙江、江西、湖北、台湾等多个省、市、自治区，由于其味道鲜美，营养丰富，深受人们的喜爱，现已成为我国重要的水产经济动物。克氏原螯虾雌雄形态之间具有较大的差异，相同体重的雌虾的含肉率比雄虾的高。全雌养殖的养殖密度和养殖产量以及全雄养殖的养殖产量要比混合养殖的高。因此，实现克氏原螯虾的性别控制，进行克氏原螯虾单性养殖在生产实践中具有巨大的市场前景，对控制该虾的进一步入侵亦具有重要的意义。
3.目前，克氏原螯虾的性别决定机制尚不清楚。探析克氏原螯虾的性别决定机制，进一步实现该虾的性别控制，往往离不开性逆转虾的诱导。而性逆转虾的诱导一般需要从胚胎或幼体开始进行性逆转诱导处理效率较高，则对该虾的遗传性别进行识别的分子标记是辅助验证性逆转是否成功的重要工具，也是制约克氏原螯虾性别控制的瓶颈之一。但目前有关克氏原螯虾雌雄特异的分子标记尚未见报道。
4.因此，本发明基于重测序技术，鉴定开发出了具有雌雄差异的indel标记，可有效用于克氏原螯虾遗传性别的鉴别。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于：提供一种低成本且高效的鉴别克氏原螯虾遗传性别的分子标记及其筛选方法和应用。该分子标记及其筛选方法，和采用该分子标记进行克氏原螯虾遗传性别鉴定的方法操作简便，实验步骤少、成本低，能广泛应用在生产实践中。经检测，该筛选及鉴定方法能有效鉴别克氏原螯虾遗传性别，为目前唯一的一种基于dna序列能有效鉴别克氏原螯虾遗传性别的分子标记及筛选方法和鉴定方法。
6.本发明通过以下技术方案实现：一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记，其特征在于，所述分子标记序列为seq id:1、seq id:2，具体为：
7.seq id:1，cgagtatgacactggttcaccaat；
8.seq id:2，catatacatcgtcaccgtccctg。
9.以上所述克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
10.s1、引物设计：
11.a)选取克氏原螯虾雌雄dna序列存在indel位点差异的序列区，其中indel位点前后各保留约500bp的序列，总长1000bp左右，序列为seq id:3；
12.b)利用primer3web，基于该1000bp左右的序列区进行引物设计，使一对引物中的一条引物跨越indel位点的序列区；
13.s2、利用s1中设计的引物进行pcr扩增；
14.s3、采用琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，选出符合要求的引物，筛选标准如下：
15.雄性小龙虾pcr产物中出现明亮条带，且片段大小一致，无非特异扩增情况；
16.雌性小龙虾pcr产物中无条带；
17.s4、性别分子标记判别率计算：
18.通过对初步筛选的雌雄分子标记进行扩大群体验证，计算各个标记判别的准确性；
19.选取标记准确性最高的引物作为遗传性别标记的引物，用于鉴定克氏原螯虾的遗传性别。
20.优选的，s1中步骤a)的序列seq id:3，具体为：
21.aaaaaaagttcgggcttcagtgttaaatctaaaaggttctaaacccctaaatcaggatatcaaaatattttgcctatgtaagtaaaacaaacaaatcgtggaacatgcaagggaaatagtgtgtattcgagtacgagtatgacactggttcaccaatagtgagaagggcataatgtgccattgcaacacagagggaaagcatcgcataagggggccagattcacgaagcaattacgcaagtacttgccaatgtgtacatctttcctcactctttgatggctttggttacatttattaaacagtttacaagcatgaaaactttccagtcaactgttgttattgttataaacaacctcctggtgctttgcagctcataactgtttaataattgtaaacaaagctaccaaagattgagaaaagatgtacaggttcataagtgcttgagtaacttccttgtgaatctggccccaggtgaggagtcggtcaccgccagggacggtgacgatgtatatgccatacaaatggtaggggtagggtgaggatcagaagggtaagccaaggacagatatagtcagtttaaatacttggacttgtgtcagaggaatctatgcattttctagtaattattgaactatgaatgcttaccttaagcaatttgcactcccgggaatcttggaatgctggatacatttcttcatatttctccactgcaatcttagcattagttaaatcaatgcacaaatgacacagcgcagctcggaacatgtattccttagcactgtatttgagtaaagagctttcaagggaacttgttgccacctgaaaaatataaaaaatcatagacttctcagaaatgtttgcagcatacaacaatcatacaaactttatcatcatattttattagcatttatacgagagtattgtactaaattattacgggtatatttgttattaattttgatgcaaaatttgacaaatattgacatcattttgacac。
22.优选的，s2中pcr扩增具体为：
23.pcr扩增体系为10μl，各组分为：premix pcr buffer，5μl；引物(seq id:1/2)各0.5μl；dna模板，0.5μl；灭菌水，3.5μl；
24.pcr扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min。冷却至4℃。
25.以上所述克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记在克氏原螯虾性别鉴定中的应用。
26.优选的，所述克氏原螯虾性别鉴定采用以下步骤：
27.(1)挑选克氏原螯虾雌雄个体，构建雌雄两个群体，剪取各个体附肢作为待测样本；
28.(2)采用常规醋酸铵法提取dna样本，使用thermo nanodrop 2000分光光度计和1.2％琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度，选取质量合格的雌雄虾dna样本；将雌虾dna样品等量
混合，将雄虾dna样品等量混合，构建重测序文库；使用华大bgi测序仪进行测序，通过数据分析，筛选雌雄差异位点；
29.(3)采用seq id:1/2引物对克氏原螯虾雌雄个体dna进行扩增检测，雄性个体dna可以扩增出一条400bp左右的条带，而雌虾个体dna没有此条带。
30.本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
31.(1)本发明所得分子标记为显性标记，操作简便，成本低，实验周期短，可应用于克氏原螯虾遗传性别的规模化鉴别，在胚胎期和幼虾期均可高效应用。
32.(2)本发明基于克氏原螯虾重测序数据，在基因组结构层面上，对克氏原螯虾遗传性别鉴定提供了一个鉴别方法，有效的解决了克氏原螯虾早期生长阶段和性逆转个体遗传性别鉴别的问题，为目前唯一的一种基于dna序列能有效鉴别克氏原螯虾遗传性别的分子标记。
33.(3)本发明的一对分子标记引物，基于雄虾特有的dna分子片段，在pcr扩增过程中，引物具有特异性强、扩增效率高等特点，pcr产物只需琼脂糖凝胶电泳检测便可直观的进行区分，具有简便、快速、高效、准确和低成本的特点。
附图说明
34.图1：准确性最高的引物扩增克氏原螯虾雌雄dna样本电泳图(marker为d2000 dna ladder)；
35.图2：遗传性别分子标记引物扩增克氏原螯虾雌雄dna样本电泳图(marker为d2000 dna ladder)；
36.图3：利用分子标记扩大检测克氏原螯虾雌雄个体电泳图(marker为d2000 dna ladder)。
具体实施方式
37.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样在本技术所列权利要求书限定范围之内。
38.实施例1
39.1)挑选健康的克氏原螯虾雌雄个体作为待测样本，构建雌雄两个群体。
40.2)待测群体样本的dna提取(醋酸铵法)：
41.a)取每只虾的附肢组织，放入装有100％乙醇的2ml ep管中，并放入﹣80℃冰箱中保存。
42.b)取0.01g脱酒精后的附肢组织，置于2ml eppendof管中，加入600μl组织裂解液，将样品剪碎处理并加入15μl 10mg/ml蛋白酶k混匀，65℃水浴2-4h，置于冰上冷却，每管加200μl醋酸铵(7.5mol/l)混匀，冰上放置5min。4℃12000r/m离心10min后，取上清至ep管(1.5ml)中，重复该过程一次，加入600μl异丙醇，冰上静置1-2min，4℃12000r/m离心10min，弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤dna，4℃12000r/m离心2min，弃上清，加入1ml无水乙醇洗涤dna，4℃12000r/m离心2min，弃上清。自然干燥15min，加入适量ddh2o溶解dna。
43.c)检测dna纯度：使用thermo nanodrop 2000分光光度计对1μl dna上样样品进行
浓度、a260/a280及a260/a230测量。
44.d)琼脂糖凝胶电泳：取2μldna样品与2μl上样缓冲液混匀，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测dna(120v,15min)。在照胶仪下观察dna条带。选取质量合格的dna样本进行后续的分析。
45.e)将雌虾dna样品等量混合，将雄虾dna样品等量混合，构建重测序文库。使用华大bgi测序仪进行测序，通过数据分析，筛选雌雄差异位点。
46.3)分子标记引物设计及筛选
47.a)引物设计：
48.a)选取克氏原螯虾雌雄dna序列存在indel位点差异的序列区，其中indel位点前后各保留约500bp的序列，总长约1000bp左右。
49.b)利用primer3 web version 4.1.0(https://primer3.ut.ee/)，基于该1000bp左右的序列区进行引物设计，使一对引物中的一条引物跨越indel位点的序列区。
50.b)pcr扩增：pcr扩增体系为10μl，各组分为：premix pcr buffer(takara,rr901a)，5μl；引物(seq id:1/2)各0.5μl；dna模板，0.5μl；灭菌水，3.5μl。pcr扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min。冷却至4℃。
51.c)琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物：分别取2μl pcr产物与2μl上样缓冲液混匀，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物(120v,15min)。在照胶仪下观察pcr扩增的条带，筛选出符合要求的引物及其对应的分子片段。筛选标准如下：
52.a)雄性小龙虾pcr产物中出现明亮条带，且片段大小一致，无非特异扩增情况。
53.b)雌性小龙虾pcr产物中无条带。
54.4)性别分子标记判别率计算
55.a)通过对初步筛选的雌雄分子标记进行扩大群体验证，计算各个标记判别的准确性。
56.b)选取标记准确性最高的引物作为遗传性别标记的引物(seq id:1，cgagtatgacactggttcaccaat；seq id:2，catatacatcgtcaccgtccctg)，用于鉴定克氏原螯虾的遗传性别。
57.5)采用seq id:1/2引物对克氏原螯虾雌雄各30个个体进行检测，结果雄性可以扩增出一条400bp左右的条带，而雌虾不能(参见图1及图2)。
58.实施例2
59.本发明的实施例是在华中农业大学水产学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室进行，具体实施细则如下：
60.1)共挑选克氏原螯虾雌虾65尾，雄虾51尾。
61.2)采样：对每只克氏原螯虾附肢组织进行取样。使用消毒后的剪刀剪取少量附肢组织，并将其放入pbs中进行清洗，之后放入装有100％乙醇2ml ep管中，在管壁上标记编号及雌雄信息。将样品带回实验室，在﹣80℃冰箱中进行保存。
62.3)提取克氏原螯虾dna：将ep管中的附肢组织取出，用滤纸吸干酒精，采用实施例1中所述醋酸铵法来提取其dna，通过检测其dna纯度及琼脂糖凝胶电泳，取合格的dna样本进行后续的分析。
63.4)克氏原螯虾dna稀释：首先将每个克氏原螯虾dna样品稀释到100ng/μl。用于后续pcr实验。
64.5)pcr扩增体系为10μl，各组分为：premix pcr buffer(takara,rr901a)5μl；引物(seq id:1/2)各0.5μl；dna模板0.5μl；灭菌水3.5μl。pcr扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min。冷却至4℃。
65.6)琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物：分别取2μl pcr产物与2μl上样缓冲液混匀，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物(120v,15min)。结果如图3。
66.图3可以看出，雄虾能扩出一条400bp左右的条带(图3a)，雌虾未能扩增出此条带(图3b)。分子标记判别率达到100％。
67.从以上案例可以看出，本发明可准确鉴别克氏原螯虾遗传性别，为克氏原螯虾遗传性别鉴定提供一个新方法。
68.实施例3
69.选取来自不同地理区域来源的克氏原螯虾雌雄个体，采集dna样本，共计196个，其中雌虾dna样105个，雄虾dna样91个。其中克氏原螯虾具体来源如下：
[0070][0071]
采用引物(seq id:1/2)对dna样本进行pcr扩增，其中pcr扩增体系为10μl，各组分为：premix pcr buffer(takara,rr901a)5μl；引物(seq id:1/2)各0.5μl；dna模板0.5μl；灭菌水3.5μl。pcr扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min。冷却至4℃。
[0072]
使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，发现雄虾91条均能扩增出一条400bp左右的条带，雌虾105个样中有104个dna不能扩增出条带。
[0073]
因此，统计分析发现本发明开发的标记引物鉴定克氏原螯虾遗传性别的准确率至少为99.49％(195/196)。
[0074]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。