一种具有免疫调节活性的鳕鱼肽及其应用

1.本发明涉及一种具有免疫调节活性的鳕鱼肽及其应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.免疫力与机体健康息息相关，免疫稳态对人类健康非常重要。在正常生理条件下，免疫系统负责维持免疫稳态平衡。免疫系统失衡可导致免疫缺陷疾病、感染性疾病、超敏性疾病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤。适应性免疫对潜在危险的外来抗原具有高度特异性，分为细胞介导免疫和抗体介导免疫两种类型。目前，用于治疗免疫缺陷疾病的药物，如左旋咪唑，有很多副作用，因此寻找一种无副作用的增强免疫力的产品非常重要。raw264.7细胞是构成机体免疫系统中免疫细胞的重要成员之一，它在免疫防卫、免疫维稳和免疫监察中都有不可忽视的作用，是最先做出免疫应答的细胞种类之一。被激活的巨噬细胞具有吞噬能力，并通过分泌具有各种功能的免疫活性物质，在免疫应答中占据不可忽视的地位。小鼠脾淋巴细胞分离自脾脏组织；脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25％，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。成熟淋巴细胞需依赖抗原刺激而分化增殖，继而发挥其免疫功能。
3.鳕鱼是当今世界产量最高的鱼种之一，主要生产于加拿大、冰岛、挪威、俄罗斯、日本、朝鲜等国。而在我国，鳕鱼的主要产地则分布于黄海北部、山东东南部以及东南沿海的相关地带。鳕鱼是一种深海鱼。其高蛋白、低脂肪的营养价值，在看重饮食质量的西方人眼中，被誉为“餐桌上的营养师”、“液体黄金”，是比黄金珍贵的宝藏。研究表明，鱼蛋白水解物具有多种生物活性，如抗氧化活性、抗高血压、抗糖尿病和抗菌活性。活性肽可通过酶解工艺从蛋白质序列中释放出来，发挥多种生物功能或生理效应。近年来，研究者从太子参蛋白、玉米醇溶蛋白、牛初乳乳清蛋白、厚壳贻贝蛋白等的水解物中发现了具有免疫调节活性的肽，但由于技术的限制以及工艺成本高等因素，限制了其进行工业化生产和利用。
4.因此，开发一种提取工艺简便，且具有潜在免疫调节活性的多肽对于增强免疫的保健食品和药品的开发具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术的缺点，提供一种具有免疫调节活性的醇溶性鳕鱼肽的制备方法，以促进raw264.7细胞释放no含量、促进小鼠脾细胞增殖，增强免疫调节功能。
6.本发明提供了一种鳕鱼肽粉，所述鳕鱼肽粉是按照下述方法制备得到的：
7.s1、鳕鱼磨碎：将鳕鱼加水磨碎，得到鳕鱼混合液；
8.s2、酶解：将步骤s1得到的鳕鱼混合液加碱后调ph值至8.0～8.5，升温使温度达到55～58℃，按照0.19～0.21％比例加入碱性蛋白酶，搅拌均匀，酶解1.8～2.2h，再升温灭酶10～15min，冷却至65℃以下后，首先进行压滤，然后通过振动筛网离心、膜过滤分离，最后浓缩得到鳕鱼酶解液；
9.s3、喷雾干燥：将步骤s2得到的鳕鱼酶解液进行喷雾干燥，得到鳕鱼肽粉；
10.s4、分离制备：将步骤s3得到的鳕鱼肽粉按照质量比为(1：18)～(1：22)的比例加到质量分数为75～85％的乙醇中，20～30℃搅拌1～2h，在7500～8500g转速下离心20～30min，取上清液，得到醇溶性鳕鱼肽；
11.s5、脱醇：将步骤s4中所述的醇溶性鳕鱼肽用旋转蒸发仪除去乙醇至原体积的3～5％，得脱醇的醇溶性鳕鱼肽；
12.s6、脱盐：将步骤s5中所述的脱醇的醇溶性鳕鱼肽按照体积比为1:(5～7)的比例加去离子水，分别进行渗透脱盐处理，待盐分除去后，即得到鳕鱼肽，将其冷冻干燥后保存。
13.在本发明的一种实施方式中，步骤s1为：将鳕鱼按照质量比为1:(1.5～2.0)的比例加水磨碎，得到鳕鱼混合液；
14.在本发明的一种实施方式中，步骤s2中，灭酶温度为85℃以上。
15.在本发明的一种实施方式中，步骤s2中，振动筛网的规格为120目。
16.在本发明的一种实施方式中，所述醇溶性鳕鱼肽分子量分布于200～3000da之间，含氮量为80～90％。
17.在本发明的一种实施方式中，步骤s5中所述旋转蒸发的温度设定为50～60℃，转速设定为60～80rpm。
18.在本发明的一种实施方式中，步骤s6中所述渗透脱盐方法包括脱醇的醇溶性鳕鱼肽倒入100～200da透析袋中，于2～8℃下，透析24～48h。
19.本发明提供了一种产品，所述产品中含有上述鳕鱼肽。
20.在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。
21.在本发明的一种实施方式中，所述食品为含有上述鳕鱼肽的蛋白粉、糖果、饮料。
22.在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述鳕鱼肽、药物载体和/或药用辅料。
23.本发明提供了一种上述鳕鱼肽在制备具有免疫调节活性的产品中的应用。
24.在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。
25.在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述鳕鱼肽、药物载体和/或药用辅料。
26.本发明提供了一种上述鳕鱼肽在制备促进raw264.7细胞释放no的产品中的应用。
27.在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。
28.在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述鳕鱼肽、药物载体和/或药用辅料。
29.本发明提供了一种上述鳕鱼肽在制备促进小鼠脾淋巴细胞增殖的产品中的应用。
30.在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。
31.在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述鳕鱼肽、药物载体和/或药用辅料。
32.有益效果
33.1、本发明以鳕鱼为原料开发了一种具有促进raw264.7细胞释放no、促进小鼠脾淋巴细胞增殖的醇溶性鳕鱼肽，本发明拓展了海洋生物在开发增强免疫力的保健品和药品的开发中的用途。
34.2、本发明与现有技术相比，本发明获得鳕鱼肽的方法更为简单，且获得的鳕鱼肽拥有较强的免疫调节活性。
35.3、本发明通过实验发现醇溶性鳕鱼肽在一定剂量下显示出促进raw264.7细胞释放no的能力；500μg/ml醇溶性鳕鱼肽处理细胞释放no的量比空白组高出31.41％，与空白组相比有显著性差异(p《0.05)，且本发明以鳕鱼为原材料，安全性高。
36.4、本发明首次采用醇溶提取的方法开发了一种鳕鱼免疫调节活性肽的提取工艺，且免疫调节活性效果相当，具有方法可选择性。
37.5、本发明采用鳕鱼为原料开发以生物活性肽为主的酶解物，原料丰富，来源广泛，制备工艺流程简便，可满足大规模工业化生产；其对于鳕鱼生物活性肽在功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。
附图说明
38.图1：普通鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽的分子量分布图。
39.图2：普通鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽对raw264.7细胞活力的影响图。
40.图3：普通鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽对raw264.7细胞释放no量的影响图。
41.图4：普通鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞24h增殖的影响图。
42.图5：普通鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞48h增殖的影响图。
43.图6：普通鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞72h增殖的影响图。
44.图7：醇溶性鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞48h增殖的影响图。
45.图8：醇溶性鳕鱼肽小鼠t/b淋巴细胞48h增殖的影响图。
具体实施方式
46.本发明下面结合细胞实验数据结果对本发明进行阐述，实施例中使用的试剂，如无特殊说明，均为常规市售产品或按常规方法配制的试剂，实施例中方法如无特殊说明，均为常规实验方法。
47.下述实施例中所涉及的碱性蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。下述实施例高糖dmem完全培养基、rpmi-1640培养基购自gibco公司。
48.下述实施例中所涉及的小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司；raw264.7细胞购自中国科学院上海细胞库。
49.下述实施例中所涉及的培养基如下：
50.高糖dmem完全培养基：高糖dmem培养基加10％胎牛血清(fbs)和1％双抗(青链霉素混合液)。
51.rpmi-1640完全培养液：rpmi-1640培养基加10％胎牛血清(fbs)和1％双抗(青链霉素混合液)。
52.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
53.蛋白含量测定：凯氏定氮法
54.参考国标gb 5009.5-2016稍加修改进行测定。将0.2g普通鳕鱼肽粉(空白组不加样品)、0.2g五水硫酸铜、6g硫酸钾和15ml浓硫酸加入消化管内，使用石墨消化炉进行梯度消化(220℃30min，320℃30min，420℃60min)。使用skd-1000全自动凯氏定氮仪进行自动加碱、稀释、蒸馏、滴定。根据下式计算得出蛋白含量：
[0055][0056]
式中：
[0057]
x——试样中蛋白质的含量，单位％；
[0058]v1
——试液消耗标准盐酸的体积，单位ml；
[0059]v2
——空白组消耗标准盐酸的体积，单位ml；
[0060]
c——标准盐酸浓度，单位mol/l；
[0061]
m——试样的质量，单位g。
[0062]
总糖含量测定：苯酚硫酸法
[0063]
制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入1.0ml 6％的苯酚及5.0ml浓硫酸，摇匀冷却，室温避光放置20min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。样品总糖含量测定：准确称取0.1g普通鳕鱼肽粉于50ml容量瓶中，加水至刻度，待完全溶解后，取2.0ml普通鳕鱼肽粉溶液于试管中，然后加入1.0ml 6％的苯酚及5.0ml浓硫酸，摇匀冷却，室温避光放置20min以后于490nm测光密度，以6.0ml水替代苯酚和浓硫酸加入2.0ml普通鳕鱼肽粉溶液作为对照组，以2.0ml水按同样显色操作为空白。普通鳕鱼肽粉总糖含量计算：以实验组的光密度值分别减去对照组和空白组的光密度值后，所得的光密度值带入标准曲线，得到普通鳕鱼肽粉溶液的总糖含量。
[0064]
粗脂肪含量测定：索氏提取法
[0065]
参考gb 5009.6-2016稍有修改进行测定。将脂肪接收瓶洗净后于105℃烘箱烘干至恒重(前后相差不超过2mg)，准确取约2g普通鳕鱼肽粉放入上下塞入棉花的滤纸筒中，滤纸筒上下口需封好，防止样品漏出。将放有样品的滤纸筒放入洁净的索氏抽提器中，与恒重后的脂肪接收瓶连接好，加入无水乙醚，约为脂肪接收瓶体积的三分之二，然后置于粗脂肪测定仪上，调节水浴为65℃，打开冷凝水开关，加热使其不断回流抽提约6h。抽提结束后，取下脂肪接收瓶，在65℃水浴上挥发剩余乙醚，等乙醚基本挥发完全以后，放与105℃烘箱中不断烘干至恒重(前后相差不超过2mg)。根据下式计算得出粗脂肪含量：
[0066][0067]
式中：
[0068]
x——试样中脂肪的含量，单位％；
[0069]
m1——恒重后脂肪接收瓶和脂肪的总质量，单位g；
[0070]
m0——恒重后脂肪接收瓶的质量，单位g；
[0071]
m2——试样的质量，单位g。
[0072]
分子量分布测定
[0073]
采用agilent 1260 hplc系统，配备tskgel g2000swxl(7.8
×
300mm)色谱柱，测定鳕鱼肽的分子量分布。hplc参数设置：色谱柱温度25℃，流速0.5ml/min，等度洗脱30min(h2o:acn:tfa＝55:45:0.1,v/v/v)，上样量10μl，在紫外检测器214nm进行检测。以细胞色素c(12384da)、抑肽酶(6511da)、八肽(1072da)、维生素e(431da)、l-赖氨酸(146da)为标准品制作标准曲线。根据标准曲线将分子量范围分为5部分(≥3000da、1000-3000da、600-1000da、300-600da和≤300da)。
[0074]
氨基酸含量测定
[0075]
使用日立la8080氨基酸分析仪，采用日立高性能阳离子交换柱分析鳕鱼肽的氨基酸含量。参数设置：分离柱柱温57℃，衍生柱柱温135℃，上样量20μl。鳕鱼肽粉在6m hcl和110℃下水解22h。旋蒸后取等体积0.02m hcl复溶，样品过0.22μm水系滤膜，稀释后上样。
[0076]
实施例1：普通鳕鱼肽粉的制备及其性能的表征
[0077]
具体步骤如下：
[0078]
1、普通鳕鱼肽粉的制备
[0079]
(1)鳕鱼磨碎：将除去鱼鳞、鱼鳍、鱼头和内脏的鳕鱼肉切成5cm左右大小的小块，按照质量比为1：1.5加水磨碎，得到鳕鱼肉混合液；
[0080]
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鳕鱼肉混合液加碱后调ph值至8.0，加热至58℃后，按照质量比为0.20％的比例加入碱性蛋白酶，搅拌均匀，酶解2h，再升温至85～100℃进行灭酶15min，冷却至64℃，首先进行压滤，然后通过120目振动筛网离心、膜过滤分离，最后浓缩得到鳕鱼酶解液；
[0081]
(3)喷雾干燥：将步骤(2)中所述鳕鱼酶解液进行喷雾干燥，得到普通鳕鱼肽粉。
[0082]
2、普通鳕鱼肽粉的表征
[0083]
分别检测普通鳕鱼肽粉的蛋白含量、总糖含量及粗脂肪含量，结果如表1所示。
[0084]
表1：普通鳕鱼肽粉的基本含量
[0085][0086]
结果显示，普通鳕鱼肽粉测定得到的蛋白含量为84.92％，总糖含量为0.68％，粗脂肪含量为1.46％，由此可以证明根据步骤1制备得到的普通鳕鱼肽粉含有较高的蛋白含量。
[0087]
实施例2：鳕鱼肽的制备及其性能的表征
[0088]
具体步骤如下：
[0089]
1、鳕鱼肽的制备
[0090]
(1)分离制备：将实施例1得到的普通鳕鱼肽粉按照质量比为1：20的比例，添加到质量分数为80％的乙醇中，25℃搅拌1h，在8000g转速下离心20min，取上清液，得到醇溶性鳕鱼肽；
[0091]
取沉淀，即得到醇不溶性鳕鱼肽；
[0092]
(2)脱醇：将步骤(1)中所述的醇溶性鳕鱼肽用旋转蒸发仪除去乙醇至原体积的
3％，得脱醇的醇溶性鳕鱼肽；
[0093]
(3)脱盐：将实施例1得到的普通鳕鱼肽粉、步骤(1)中得到的醇不溶性鳕鱼肽、步骤(2)得到的脱醇的醇溶性鳕鱼肽，按照质量比为1：5的比例加去离子水，分别进行渗透脱盐处理，所述渗透脱盐方法为：将上述鳕鱼肽放入100da透析袋中，于4℃下，每6h换一次透析水，透析24h。
[0094]
待盐分除去后，得到脱盐的普通鳕鱼肽粉、脱盐的醇溶性鳕鱼肽和脱盐的醇不溶性鳕鱼肽；
[0095]
(4)冷冻干燥：将步骤(3)中得到的脱盐的普通鳕鱼肽粉、脱盐的醇溶性鳕鱼肽和脱盐的醇不溶性鳕鱼肽进行冷冻干燥，分别得三种鳕鱼肽。
[0096]
2、鳕鱼肽的表征
[0097]
分别检测步骤1得到的三种鳕鱼肽分子量分布、氨基酸含量；结果如表2～3，及图1所示。
[0098]
表2：普通鳕鱼肽粉、醇溶性鳕鱼肽和醇不溶性鳕鱼肽的分子量分布
[0099][0100]
表3：普通鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽和醇不溶性鳕鱼肽的氨基酸含量及疏水性氨基酸含量
[0101]
[0102][0103]“#”为疏水性氨基酸
[0104]
(1)分子量分布分析：
[0105]
由图1和表2可以看出，通过醇分离后的醇溶性鳕鱼肽分子量更小，分子量在1000da以下的肽占94.28％，其中分子量在600～1000da的占12.08％，分子量在300～600da的占29.22％，分子量在300da以下的占52.97％。
[0106]
而分离前的普通鳕鱼肽粉分子量1000da以下的肽占83.42％。
[0107]
醇分离后的另一部分醇不溶性鳕鱼肽的分子量在1000da以下的肽占71.41％。
[0108]
以上结果表明，通过醇分离后得到的醇溶性鳕鱼肽含小分子量的肽更多，更容易具有生物活性。
[0109]
(2)氨基酸含量分析
[0110]
免疫调节肽最常见的残基是疏水氨基酸，如表3所示，共检测出17种氨基酸，其中：
[0111]
普通鳕鱼肽的疏水性氨基酸含量占总氨基酸含量的28.80％；
[0112]
醇溶性鳕鱼肽的疏水性氨基酸含量占总氨基酸含量的38.80％；
[0113]
醇不溶性鳕鱼肽的疏水性氨基酸含量占总氨基酸含量的20.71％。
[0114]
以上结果表明，通过醇分离后得到的醇溶性鳕鱼肽含疏水性氨基酸比例更高，并显著高于普通鳕鱼肽和醇不溶性鳕鱼肽，故可得出，醇分离的方法可有效富集含疏水性氨基酸多的肽段，而含疏水性氨基酸多的肽段更容易具有免疫调节活性。
[0115]
实施例3：醇溶性鳕鱼肽对raw264.7细胞释放no含量的影响
[0116]
具体步骤如下：
[0117]
1、raw264.7细胞的培养
[0118]
将raw264.7细胞在含10％胎牛血清(fbs)和1％双抗(青链霉素混合液)的高糖dmem完全培养基中培养，细胞保存在37℃含5％co2的潮湿培养箱中。
[0119]
2、细胞毒性试验
[0120]
raw264.7细胞毒性试验采用mtt法测定，具体步骤如下：
[0121]
(1)配置不同浓度的样品：
[0122]
采用高糖dmem完全培养基将实施例2制备得到的脱盐的普通鳕鱼肽粉、脱盐的醇
溶性鳕鱼肽和脱盐的醇不溶性鳕鱼肽，将这三种鳕鱼肽分别配制为浓度为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的鳕鱼肽溶液。
[0123]
(2)按每孔100μl raw264.7细胞(细胞密度为5
×
105个/ml)接种在96孔板上，在37℃、5％co2的环境下孵育24h，再分别用步骤(1)配制得到的不同的样品孵育24h。
[0124]
每孔加入20μl浓度为5mg/ml mtt，在相同条件下再孵育4h，弃去上清，加入150μl二甲基亚砜(dmso)，在波长490nm处测吸光值。等量培养基做空白对照，结果如图2所示。
[0125]
结果显示，用浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的三种鳕鱼肽分别处理raw264.7细胞24h，与空白组相比没有显著性差异(p《0.05)；
[0126]
其中，普通鳕鱼肽粉、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽细胞存活率在95.97～108.38％之间，故可以认为鳕鱼肽、醇溶性鳕鱼肽、醇不溶性鳕鱼肽在100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml浓度下对raw264.7细胞均没有毒性。
[0127]
3、促进raw264.7细胞释放no含量的测定
[0128]
按每孔100μl raw264.7细胞(细胞密度为5
×
105个/ml)的接种量将细胞接种在96孔板上，在37℃、5％co2的环境下孵育24h。弃去上清液再分别加入100μl上述步骤(1)配制得到的不同的样品(浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的三种鳕鱼肽)孵育24h。培养结束后收集细胞上清液。
[0129]
同时，取脂多糖(lps)，配制成终浓度为：2μg/ml的脂多糖溶液，按照上述方法，作为阳性对照，并采用等量培养基做空白对照。
[0130]
用no检测试剂盒分别测定上述上清液中的no含量，结果如表4及图3所示。
[0131]
表4：不同浓度的不同鳕鱼肽对raw264.7细胞释放no含量的影响
[0132][0133][0134]
结果显示，用浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的三种鳕鱼肽分别处理raw264.7细胞24h后，普通鳕鱼肽不能促进raw264.7细胞释放no，醇溶性鳕鱼肽可以促进raw264.7细胞释放no，且随着样品浓度的增加释放no的量逐渐增多，呈浓度依赖性。
[0135]
500μg/ml醇溶性鳕鱼肽处理的细胞比空白组高出31.41％，与空白组相比有显著性差异(p《0.05)。醇不溶性鳕鱼肽对raw264.7细胞释放no的影响并不明显，且没有规律性，所以可以认为醇不溶性鳕鱼肽促进raw264.7细胞释放no的能力较弱。
[0136]
因此，三种鳕鱼肽中，促进raw264.7细胞释放no的能力较好的有醇溶性鳕鱼肽。
[0137]
实施例4：鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞的影响
[0138]
具体步骤如下：
[0139]
(1)小鼠脾淋巴细胞的提取与培养：将小鼠眼球取血，处死。无菌环境下取小鼠脾脏，用注射器活塞研磨脾脏，制备单个细胞悬液，先用70目筛网过滤，再用100目筛网过滤，转速1000rpm，离心5min，去掉上清后，加5ml红细胞裂解液(购买自索莱宝)，吹散细胞，裂解3min，在转速1000rpm条件下，离心5min后去掉上清，采用pbs缓冲液冲洗两次沉淀，每次转速1000rpm离心5min。
[0140]
将上述方法得到的小鼠脾淋巴细胞培养于rpmi-1640完全培养液中。
[0141]
(2)采用rpmi-1640完全培养液将实施例2制备得到的脱盐的普通鳕鱼肽粉、脱盐的醇溶性鳕鱼肽和脱盐的醇不溶性鳕鱼肽，这三种鳕鱼肽分别配制为浓度为1.1mg/ml、2.2mg/ml、5.5mg/ml的溶液。
[0142]
将步骤(1)制备得到的小鼠脾淋巴细胞，按每孔100μl小鼠脾淋巴细胞(细胞密度为1
×
106个/ml)的接种量接种在96孔板上，分别加入10μl上述配制得到的不同浓度的样品(三种鳕鱼肽)，使样品(鳕鱼肽)终浓度为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml；然后将上述反应体系在37℃、5％co2的环境下，分别孵育24h、48h、72h。
[0143]
孵育结束后，每孔加入10μl ckk-8，在相同条件下再孵育3h；孵育结束后在450nm处检测吸光值；等量培养基做空白对照；结果如表5及图4～6所示。
[0144]
表5：不同浓度的鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
[0145][0146]
结果显示，三种鳕鱼肽分别处理24h后，普通鳕鱼肽没有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的能力，醇溶性鳕鱼肽有明显促进小鼠脾淋巴细胞增殖的能力，与空白组相比有显著性差异(p《0.05)，醇不溶性鳕鱼肽有一定的促进小鼠脾淋巴细胞增殖的能力，但是没有浓度依赖性。
[0147]
培养至48h时，普通鳕鱼肽显示出一定的促进小鼠脾淋巴细胞增殖活性的能力，醇溶性鳕鱼肽处理的细胞随时培养时间的增加，醇溶性鳕鱼肽显示出较强的促增殖活性，其增殖率逐渐升高，500μg/ml时可使小鼠脾淋巴细胞增殖活性提高34.79％，显著高于空白组，醇不溶鳕鱼肽也具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖活性的能力但是没有醇溶性鳕鱼肽的作
用强。
[0148]
而当培养时间达到72h时，细胞增殖率相较于48h来说略微减弱，这可能是因为细胞密度较大，部分发生了接触抑制，但该增殖活性与空白组相比仍有显著性差异(p《0.05)。由此说明醇溶性鳕鱼肽能促进小鼠脾淋巴细胞增殖，且呈现剂量依赖性。
[0149]
综上所述，醇溶性鳕鱼肽既能促进raw264.7细胞释放no，又能促进小鼠脾淋巴细胞增殖，有一定的免疫调节活性。醇溶性鳕鱼肽可应用于开发免疫调节等疾病相关的保健食品和药品中。该发明开拓了鳕鱼肽的用途，为鳕鱼活性肽在功能性食品领域的应用等奠定了一定的基础
[0150]
实施例5：醇溶性鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞的影响
[0151]
具体步骤如下：
[0152]
(1)小鼠脾淋巴细胞的提取与培养：将小鼠眼球取血，处死。无菌环境下取小鼠脾脏，用注射器活塞研磨脾脏，制备单个细胞悬液，先用70目筛网过滤，再用100目筛网过滤，转速1000rpm，离心5min，去掉上清后，加5ml红细胞裂解液(购买自索莱宝)，吹散细胞，裂解3min，在转速1000rpm条件下，离心5min后去掉上清，采用pbs缓冲液冲洗两次沉淀，每次转速1000rpm离心5min。
[0153]
将上述方法得到的小鼠脾淋巴细胞培养于rpmi-1640完全培养液中。
[0154]
(2)采用rpmi-1640完全培养液将实施例2制备得到的脱盐的醇溶性鳕鱼肽，配制为浓度为0.11mg/ml、0.55mg/ml、1.10mg/ml、2.20mg/ml、5.50mg/ml、7.70mg/ml的溶液。
[0155]
小鼠脾淋巴细胞增殖指数测定方法：将步骤(1)制备得到的小鼠脾淋巴细胞，按每孔100μl小鼠脾淋巴细胞(细胞密度为1
×
106个/ml)的接种量接种在96孔板上，分别加入10μl步骤(1)配制得到的不同浓度的样品，使终浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、700μg/ml。然后在37℃、5％co2的环境下，分别孵育48h。
[0156]
小鼠t淋巴细胞增殖指数测定方法：将步骤(1)制备得到的小鼠脾淋巴细胞，用终浓度为1μg/ml的cona诱导小鼠脾淋巴细胞，使其诱导成t淋巴细胞。按每孔100μl小鼠t脾淋巴细胞(细胞密度为1
×
106个/ml)的接种量接种在96孔板上，分别加入10μl步骤(1)配制得到的不同浓度的样品，使终浓度为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、700μg/ml。然后在37℃、5％co2的环境下，分别孵育48h。
[0157]
小鼠b淋巴细胞增殖指数测定方法：将步骤(1)制备得到的小鼠脾淋巴细胞，用终浓度为10μg/ml的lps诱导小鼠脾淋巴细胞，使其诱导成b淋巴细胞。按每孔100μl小鼠b脾淋巴细胞(细胞密度为1
×
106个/ml)的接种量接种在96孔板上，分别加入10μl步骤(1)配制得到的不同浓度的样品，使终浓度为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、700μg/ml。然后在37℃、5％co2的环境下，分别孵育48h。
[0158]
孵育结束后，每孔加入10μl ckk-8，在相同条件下再孵育3h；结束后在450nm处检测吸光值；等量培养基做空白对照；结果如表6及图7～8所示。
[0159]
表6：不同浓度的醇溶性鳕鱼肽对小鼠脾淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞增殖的影响
[0160][0161][0162]
结果显示，醇溶性鳕鱼肽可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖，随着醇溶性鳕鱼肽浓度的增加刺激指数上升，在700μg/ml培养48h时，刺激指数为1.18。
[0163]
cona可诱导t淋巴细胞有丝分裂，lps可诱导b淋巴细胞有丝分裂原，促进细胞生长和免疫球蛋白释放；从图8可以看出，醇溶性鳕鱼肽可促进cona诱导的t细胞增殖，500μg/ml的醇溶性鳕鱼肽对t细胞增殖指数为1.11，高于其他各组。
[0164]
但不同浓度的醇溶性鳕鱼肽对lps诱导的b细胞无明显增殖作用。这些结果表明，醇溶性鳕鱼肽能促进小鼠脾淋巴细胞增殖，t淋巴细胞增殖，但是不能促进b淋巴细胞增殖。
[0165]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。