一种天目地黄的遗传转化方法与流程

1.本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种天目地黄的遗传转化方法。


背景技术：

2.天目地黄(rehmannia chingii)性寒，味甘、苦，因其主要分布在浙江天目山一带，又称为浙地黄，是地黄属重要的野生种质资源之一。
3.据民间用药记载，天目地黄以全草和根入药，具有清热凉血、养阴生津和补益肝肾的功效。天目地黄富含环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、地黄苷、益母草苷及多糖类成分。已有研究表明，天目地黄的全草及根中均含有丰富的梓醇和毛蕊花糖苷，在抗菌、抗炎、降血糖及神经保护等多方面具有重要的药理活性。当前迅速发展的转录组学、代谢组学和功能基因组学为揭示天目地黄药效成分生物合成的分子机制、保障天目地黄药材的品质提供了契机。然而，目前天目地黄的遗传转化体系尚未见报道，建立高效的遗传转化体系对于研究天目地黄生长发育、逆境胁迫及次生代谢产物的合成机制意义重大。
4.八氢番茄红素脱氢酶(pds)的沉默或缺失会抑制类胡萝卜素的正常合成，从而影响类胡萝卜素对叶绿素的保护，造成富含叶绿素的绿色植物褪色而呈现白化现象。因此，利用crispr/cas9系统敲除pds基因能够非常直观的检验遗传转化体系及其转化效率。
5.本发明利用根癌农杆菌介导的叶盘法对crispr/cas9基因编辑载体进行转化，首次实现了对天目地黄的遗传转化，并成功的对天目地黄pds基因的基因组dna靶序列进行定向修饰，对于天目地黄的功能基因组学研究奠定了基础。
6.天目地黄遗传转化的方法目前未见相关报道。虽然其近缘种地黄的遗传转化已经建立，然而，由于两个物种的遗传差异较大，利用地黄遗传转化的方法进行天目地黄的遗传转化效率很低。探索一种高效的根癌农杆菌介导的天目地黄遗传转化的方法成为急需解决的技术问题。


技术实现要素：

7.发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供一种天目地黄的遗传转化方法，实现了利用crispr/cas9系统对天目地黄目标基因进行定向敲除。
8.本发明通过将携带有crispr/cas9基因编辑载体的农杆菌与天目地黄外植体进行共培养，使得外源t-dna片段插入到外植体基因组，经过抗生素筛选后，获得抗性植株，通过目标基因靶位点序列分析获，即可获得靶基因突变的天目地黄再生植株，从而实现了本发明的目的。
9.技术方案：一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：
10.(1)、天目地黄pds基因克隆
11.根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄rgpds1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的pcr引物，以天目地黄的cdna为模板，利用高保真dna聚合酶扩增天目地黄pds基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示；
12.(2)、crispr/cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌
13.克隆步骤(1)得到的天目地黄pds基因，在外显子上靠近atg的一端选取一段能够被cas9基因高效编辑的靶序列，采用混合酶切连接法将sgrna靶序列插入到crispr/cas9基因编辑载体中，所述crispr/cas9基因编辑载体中sgrna由拟南芥u6启动子驱动，zcas9基因由花椰菜病毒的35s启动子驱动，获得天目地黄pds基因的crispr/cas9表达载体，然后将成功构建的crispr/cas9表达载体转入根癌农杆菌得到含有基因编辑载体的根癌农杆菌；
14.(3)、天目地黄遗传转化
15.以天目地黄叶片为外植体，将天目地黄无菌苗的叶片剪成0.5～1.0cm大小的叶盘，浸泡入活化的步骤(2)得到的含有基因编辑载体的根癌农杆菌的ms液体培养基中，5～10min后将外植体移至含有80～120μmol/l乙酰丁香酮的ms固体共培养培养基中，24～26℃下暗培养2～3d，然后用无菌水清洗外植体上的农杆菌，滤纸吸干外植体表面的无菌水后，转入含150～300mg/l特美汀、50-100mg/l卡那霉素、0.05mg/l naa和2.0mg/l 6-ba的ms固体分化培养基中，25～27℃下光培养，待抗性芽长至2～3cm时，切取抗性芽转入ms生根培养基，光培养，诱导生根得到转基因植株，其中：
16.ms共培养培养基、分化培养及和生根培养基的ph值均为5.5～6.0；
17.(4)、转基因植株的分子检测
18.利用crispr/cas9表达载体的cas9基因和载体序列设计2对特异引物对转基因植株进行pcr分子检测，进而判断检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株基因组中是否已经转入表达载体的t-dna序列，若是，则有2条目的条带，为阳性转基因植株；若否，则没有目的条带，为假阳性非转基因植株。
19.进一步地，还包括步骤(5)转基因植株靶位点dna序列分析：
20.提取步骤(4)得到的阳性转基因植株的基因组dna，在基因编辑的靶点序列前后设计特异引物进行pcr扩增，扩增产物胶回收并连接ta克隆载体，转化大肠杆菌dh5α，挑取单菌落进行测序，或回收pcr扩增产物进行高通量二代扩增序列测序，确定靶点序列是否突变以及突变的类型，若已经突变，靶点序列存在核苷酸碱基缺失、插入或替换；若未突变，靶点序列核苷酸碱基没有变化。
21.进一步地，步骤(1)中所述地黄rgpds1基因的ncbi登记号mw132596。
22.进一步地，步骤(1)中所述特异的pcr引物包括正向引物rcpds1_f和反向引物rcpds1_r，其中：
23.正向引物rcpds1_f：5
’‑
cagttgcctgagctgttgaa-3’；
24.反向引物rcpds1_r：5
’‑
gcttccctatcttctgtcttcc-3’。
25.进一步地，步骤(2)中所述crispr/cas9基因编辑载体含有卡那霉素抗性基因。
26.进一步地，步骤(3)中所述光培养为每天光照培养14h，暗培养10h。
27.进一步地，步骤(4)中所述2对特异引物包括第一特异引物和第二特异引物；
28.第一特异引物正向引物cas9_f：5
’‑
tcaacggcattcgggacaag-3’；
29.第一特异引物反向引物cas9_r：5
’‑
ccacatacatatcgcggcca-3’；
30.第二特异引物正向引物pkse401_f：5
’‑
tgtcccaggattagaatgattaggc-3’；
31.第二特异引物反向引物sgrcpds1_r：5
’‑
cccagcacatcccttgctt-3’。
32.有益效果，本发明公开的一种天目地黄的遗传转化方法具有以下有益效果：
33.1.常规的植物遗传转化以头孢霉素为农杆菌抑菌抗生素，以潮霉素为筛选抗生素，天目地黄的叶片分化的愈伤褐化率较高，而以特美汀为农杆菌抑菌抗生素，以卡那霉素为筛选抗生素，天目地黄的叶片愈伤褐化率显著降低，再生芽分化率高，再生芽的生长状态较好；
34.2.遗传转化效率的鉴定方法有改进，以往检测遗传转化的效率常用gus、gfp等报告基因结合pcr鉴定进行阳性植株的鉴定，检测方法复杂，甚至需要借助高精密的仪器。而以crispr/cas9敲除天目地黄自身的pds基因，部分纯合突变体可以在再生芽分化阶段可在自然条件下呈现明显的白化表型，表型鉴定便捷、高效；
35.3.近缘物种地黄的分化培养基中生长素naa的浓度为0.1～0.5mg/l，同样的naa浓度用于天目地黄遗传转化，再生芽分化率很低，改进naa的浓度为0.05mg/l时，天目地黄的再生分化率显著提高。
附图说明
36.图1是crispr/cas9表达载体框架图。
37.图2a和图2b是天目地黄转化crispr/cas9载体敲除pds基因的再生芽和分化苗表型。
38.图3a和图3b是转基因天目地黄的pcr阳性检测电泳图。
具体实施方式：
39.为使本发明实施目的、技术方案、优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而并非全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
40.本发明中生物材料的来源
41.crispr/cas9载体由中国农业大学陈其军教授馈赠，其他常规试剂、药品及耗材均为现有技术中常规物质。
42.实施例1：
43.一种天目地黄的遗传转化方法，包括：
44.天目地黄pds基因的克隆
45.选取天目地黄幼嫩叶片提取总rna，提取方法参考rna提取试剂盒(takara，大连)说明书进行；
46.利用cdna第一链合成试剂盒进行反转录，方法参考反转录试剂盒6210a型(takara，大连)试剂盒说明书进行；
47.在天目地黄转录组中筛选编码八氢番茄红素脱氢酶(pds)的转录本序列，预测具有完整的开放阅读框(orf)，并命名为rcpds，其核苷酸序列如seq id no.1所述；
48.根据rcpds的序列，设计一对特异性引物rcpds_f和rcpds_r，以反转录合成的cdna为模板，采用takara公司的primestar高保真dna聚合酶进行pcr扩增目的基因，其具体反应体系按照说明书进行，其中：
49.一对特异性引物包括正向引物rcpds1_f和反向引物rcpds1_r，其中：
50.正向引物rcpds1_f：5
’‑
cagttgcctgagctgttgaa-3’；
51.反向引物rcpds1_r：5
’‑
gcttccctatcttctgtcttcc-3’。
52.含天目地黄rcpds基因的crispr/cas9载体构建
53.在天目地黄rcpds基因的第4个外显子上设计了长度为19bp且3’段含有tgg的靶序列，根据靶序列信息合成一对反向互补且包含bsali粘性末端的引物。取上述引物上下游各15μl，加入5μl neb buffer，去离子水15μl，在沸水中冷却至室温以形成双链。进一步通过混合酶切连接构建含目标基因rcpds靶位点序列的crispr/cas9载体，取引物退火产物2μl，crispr/cas9载体约200ng，10
×
neb t4 buffer 1.5μl，10
×
bsa 1.5μl，bsal i-hf 1μl，t4连接酶1μl，去离子水补足15μl体系；pcr反应条件为37℃，5h；50℃，10min；80℃，10min。
54.重组质粒载体含有靶序列的grna、cas9及卡那霉素抗性基因，其中grna由拟南芥u6启动子驱动，zcas9基因由花椰菜病毒的35s启动子驱动，卡那霉素抗性基因由35s启动子驱动(如图1所示)。将上述重组质粒转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取单克隆菌落进行pcr扩增和测序验证，测序由上海生工生物有限公司完成。根据测序结果提取含有正确靶序列的crispr/cas9质粒转化根癌农杆菌lba4404。
55.根癌农杆菌介导的天目地黄遗传转化
56.取上述含有目标载体的农杆菌菌株涂布于含卡那霉素的lb固体培养基(ph＝7.0)上进行2次活化，挑取已活化的单克隆菌落在lb固体培养基上划线暗培养2d，培养温度为28℃。生长良好的农杆菌用ms液体培养基冲洗，至菌体的od
600
为0.6-0.8，加入乙酰丁香酮用于遗传转化。取天目地黄无菌组培苗的叶片剪成0.5-1.0cm大小的叶盘，放入含上述菌体和乙酰丁香酮(100μmol/l)的ms液体培养基中室温悬浮震荡培养7min后取出，叶盘表面的液体用无菌滤纸吸干后放置于含有100μmol/l乙酰丁香酮的ms固体培养基上，25℃暗培养2d。然后将上述共培养的天目地黄叶盘用无菌水漂洗5-6次，用无菌滤纸吸干叶盘表面的水后放置于ms固体分化培养基上，培养基中含有0.05mg
·
l-1
naa和2.0mg
·
l-1
6-ba，而且含特美汀(200mg/l)和卡那霉素(50mg/l)；在光照培养箱中培养，温度25℃，光照强度2000～4000lx，14h/d。每2周更换一次分化培养基，直至分化出抗性再生芽(图2a所示)。待再生芽长至2-3cm后剪下放置于含ms固体培养基的培养瓶中使之生根(图2b所示)。
57.转基因植株的鉴定与分析
58.本发明基于根癌农杆菌介导的叶盘法遗传转化技术共获得57个转基因分化株系，其中有明显完全白化表型的株系有20个(占35.09％)，介于完全白化与绿色苗之间的嵌合表型有14个(24.56％)，与对照表型无差别的绿苗株系有23个(40.35％)。利用crispr/cas9表达载体的cas9基因设计特异引物cas9_f和cas9_r，同时利用载体序列和sgrna引导序列设计特异引物pkse401_f和sgrcpds_r，进行pcr分子扩增，检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株是否已经转入表达载体t-dna序列。随机选取的23个转基因株系进行pcr阳性鉴定，其中：
59.特异引物正向引物cas9_f：5
’‑
tcaacggcattcgggacaag-3’；
60.特异引物反向引物cas9_r：5
’‑
ccacatacatatcgcggcca-3’；
61.特异引物正向引物pkse401_f：5
’‑
tgtcccaggattagaatgattaggc-3’；
62.特异引物反向引物sgrcpds1_r：5
’‑
cccagcacatcccttgctt-3’。
63.结果显示，82.6％的转基因株系在281bp和474bp处同时扩增出两条清晰的条带，
其中具有白化表型的转基因株系绝大多数(94.4％)扩增出两个条带，仅有株系44扩增出较弱的1个条带(如图3a和图3b所示)。而以野生型天目地黄的dna和去离子水作为pcr反应模板时，在281bp和474bp目标条带处均未获得pcr产物。鉴定结果表明crispr/cas9重组质粒被成功整合至天目地黄基因组中。
64.转基因植株的靶位点碱基突变类型分析
65.本发明在天目地黄rcpds基因靶位点上下游分别设计特异性引物rcpds_tf和rcpds_tr，以转基因植株的dna为模板，采用extaq酶进行pcr扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物；对能够在1387bp处扩增出特异性目标条带的pcr产物，采用胶回收试剂盒回收目标产物，连接takara公司的ta克隆载体，转化大肠杆菌dh5α后挑取单菌落测序，其中：
66.rcpds_tf：5
’‑
cttctcctcgtccaaacaag-3’；
67.rcpds_tr：5
’‑
agctctccaaacaggttctg-3’。
68.靶位点突变类型分析结果如下：
[0069][0070]
从其中可以看出，完全白化表型的株系其靶位点序列的编辑方式主要为缺失(57.89％)，个别发生碱基插入(36.84％)和替换(5.26％)；而嵌合植株的靶序列编辑方式包括缺失和插入，其碱基缺失的突变类型发生概率高达100.00％。所有转基因植株靶位点序列的突变类型统计结果显示，碱基缺失的突变类型最多，其碱基缺失数目包括1bp(16.67％)、2bp(13.89％)、3bp(19.44％)、5bp(27.78％)、6bp(8.33％)、7bp(5.56％)和8bp(8.33％)。由此可见，天目地黄rcpds基因经crispr/cas9编辑后产生的完全白化或嵌合白化表型，主要是碱基缺失的突变引起的。该结果表明转化crispr/cas9载体实现了对天目地黄rcpds基因的靶向编辑，获得了明显的基因突变类型。
[0071]
实施例2
[0072]
一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0073]
(1)、天目地黄pds基因克隆
[0074]
根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄rgpds1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的pcr引物，以天目地黄的cdna为模板，利用高保真dna聚合酶扩增天目地黄pds基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0075]
(2)、crispr/cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌
[0076]
克隆步骤(1)得到的天目地黄pds基因，在外显子上靠近atg的一端选取一段能够被cas9基因高效编辑的靶序列，采用混合酶切连接法将sgrna靶序列插入到crispr/cas9基因编辑载体中，所述crispr/cas9基因编辑载体中sgrna由拟南芥u6启动子驱动，zcas9基因由花椰菜病毒的35s启动子驱动，获得天目地黄pds基因的crispr/cas9表达载体，然后将成功构建的crispr/cas9表达载体转入根癌农杆菌得到含有基因编辑载体的根癌农杆菌；
[0077]
(3)、天目地黄遗传转化
[0078]
以天目地黄叶片为外植体，将天目地黄无菌苗的叶片剪成0.5大小的叶盘，浸泡入活化的步骤(2)得到的含有基因编辑载体的根癌农杆菌的ms液体培养基中，5min后将外植体移至含有80μmol/l乙酰丁香酮的ms固体共培养培养基中，24℃下暗培养3d，然后用无菌水清洗外植体上的农杆菌，滤纸吸干外植体表面的无菌水后，转入含150mg/l特美汀、50mg/l卡那霉素、0.05mg/l naa和2.0mg/l 6-ba的ms固体分化培养基中，25℃下光培养，待抗性芽长至2cm时，切取抗性芽转入ms生根培养基，光培养，诱导生根得到转基因植株，其中：
[0079]
ms共培养培养基、分化培养及和生根培养基的ph值均为5.5；
[0080]
(4)、转基因植株的分子检测
[0081]
利用crispr/cas9表达载体的cas9基因和载体序列设计2对特异引物对转基因植株进行pcr分子检测，进而判断检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株基因组中是否已经转入表达载体的t-dna序列，若是，则有2条目的条带，为阳性转基因植株；若否，则没有目的条带，为假阳性非转基因植株。
[0082]
进一步地，还包括步骤(5)转基因植株靶位点dna序列分析：
[0083]
提取步骤(4)得到的阳性转基因植株的基因组dna，在基因编辑的靶点序列前后设计特异引物进行pcr扩增，扩增产物胶回收并连接ta克隆载体，转化大肠杆菌dh5α，挑取单菌落进行测序，或回收pcr扩增产物进行高通量二代扩增序列测序，确定靶点序列是否突变以及突变的类型，若已经突变，靶点序列存在核苷酸碱基缺失、插入或替换；若未突变，靶点序列核苷酸碱基没有变化。
[0084]
进一步地，步骤(1)中所述地黄rgpds1基因的ncbi登记号mw132596。
[0085]
进一步地，步骤(1)中所述特异的pcr引物包括正向引物rcpds1_f和反向引物rcpds1_r，其中：
[0086]
正向引物rcpds1_f：5
’‑
cagttgcctgagctgttgaa-3’；
[0087]
反向引物rcpds1_r：5
’‑
gcttccctatcttctgtcttcc-3’。
[0088]
进一步地，步骤(2)中所述crispr/cas9基因编辑载体含有卡那霉素抗性基因。
[0089]
进一步地，步骤(3)中所述光培养为每天光照培养14h，暗培养10h。
[0090]
进一步地，步骤(4)中所述2对特异引物包括第一特异引物和第二特异引物；
[0091]
第一特异引物正向引物cas9_f：5
’‑
tcaacggcattcgggacaag-3’；
[0092]
第一特异引物反向引物cas9_r：5
’‑
ccacatacatatcgcggcca-3’；
[0093]
第二特异引物正向引物pkse401_f：5
’‑
tgtcccaggattagaatgattaggc-3’；
[0094]
第二特异引物反向引物sgrcpds1_r：5
’‑
cccagcacatcccttgctt-3’。
[0095]
实施例3
[0096]
一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0097]
(1)、天目地黄pds基因克隆
[0098]
根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄rgpds1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的pcr引物，以天目地黄的cdna为模板，利用高保真dna聚合酶扩增天目地黄pds基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0099]
(2)、crispr/cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌
[0100]
克隆步骤(1)得到的天目地黄pds基因，在外显子上靠近atg的一端选取一段能够被cas9基因高效编辑的靶序列，采用混合酶切连接法将sgrna靶序列插入到crispr/cas9基因编辑载体中，所述crispr/cas9基因编辑载体中sgrna由拟南芥u6启动子驱动，zcas9基因由花椰菜病毒的35s启动子驱动，获得天目地黄pds基因的crispr/cas9表达载体，然后将成功构建的crispr/cas9表达载体转入根癌农杆菌得到含有基因编辑载体的根癌农杆菌；
[0101]
(3)、天目地黄遗传转化
[0102]
以天目地黄叶片为外植体，将天目地黄无菌苗的叶片剪成1.0cm大小的叶盘，浸泡入活化的步骤(2)得到的含有基因编辑载体的根癌农杆菌的ms液体培养基中，10min后将外植体移至含有120μmol/l乙酰丁香酮的ms固体共培养培养基中，26℃下暗培养2d，然后用无菌水清洗外植体上的农杆菌，滤纸吸干外植体表面的无菌水后，转入含300mg/l特美汀、100mg/l卡那霉素、0.05mg/lnaa和2.0mg/l 6-ba的ms固体分化培养基中，27℃下光培养，待抗性芽长至3cm时，切取抗性芽转入ms生根培养基，光培养，诱导生根得到转基因植株，其中：
[0103]
ms共培养培养基、分化培养及和生根培养基的ph值均为6.0；
[0104]
(4)、转基因植株的分子检测
[0105]
利用crispr/cas9表达载体的cas9基因和载体序列设计2对特异引物对转基因植株进行pcr分子检测，进而判断检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株基因组中是否已经转入表达载体的t-dna序列，若是，则有2条目的条带，为阳性转基因植株；若否，则没有目的条带，为假阳性非转基因植株。
[0106]
进一步地，还包括步骤(5)转基因植株靶位点dna序列分析：
[0107]
提取步骤(4)得到的阳性转基因植株的基因组dna，在基因编辑的靶点序列前后设计特异引物进行pcr扩增，扩增产物胶回收并连接ta克隆载体，转化大肠杆菌dh5α，挑取单菌落进行测序，或回收pcr扩增产物进行高通量二代扩增序列测序，确定靶点序列是否突变以及突变的类型，若已经突变，靶点序列存在核苷酸碱基缺失、插入或替换；若未突变，靶点序列核苷酸碱基没有变化。
[0108]
进一步地，步骤(1)中所述地黄rgpds1基因的ncbi登记号mw132596。
[0109]
进一步地，步骤(1)中所述特异的pcr引物包括正向引物rcpds1_f和反向引物rcpds1_r，其中：
[0110]
正向引物rcpds1_f：5
’‑
cagttgcctgagctgttgaa-3’；
[0111]
反向引物rcpds1_r：5
’‑
gcttccctatcttctgtcttcc-3’。
[0112]
进一步地，步骤(2)中所述crispr/cas9基因编辑载体含有卡那霉素抗性基因。
[0113]
进一步地，步骤(3)中所述光培养为每天光照培养14h，暗培养10h。
[0114]
进一步地，步骤(4)中所述2对特异引物包括第一特异引物和第二特异引物；
[0115]
第一特异引物正向引物cas9_f：5
’‑
tcaacggcattcgggacaag-3’；
[0116]
第一特异引物反向引物cas9_r：5
’‑
ccacatacatatcgcggcca-3’；
[0117]
第二特异引物正向引物pkse401_f：5
’‑
tgtcccaggattagaatgattaggc-3’；
[0118]
第二特异引物反向引物sgrcpds1_r：5
’‑
cccagcacatcccttgctt-3’。
[0119]
实施例4
[0120]
一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0121]
(1)、天目地黄pds基因克隆
[0122]
根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄rgpds1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的pcr引物，以天目地黄的cdna为模板，利用高保真dna聚合酶扩增天目地黄pds基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0123]
(2)、crispr/cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌
[0124]
克隆步骤(1)得到的天目地黄pds基因，在外显子上靠近atg的一端选取一段能够被cas9基因高效编辑的靶序列，采用混合酶切连接法将sgrna靶序列插入到crispr/cas9基因编辑载体中，所述crispr/cas9基因编辑载体中sgrna由拟南芥u6启动子驱动，zcas9基因由花椰菜病毒的35s启动子驱动，获得天目地黄pds基因的crispr/cas9表达载体，然后将成功构建的crispr/cas9表达载体转入根癌农杆菌得到含有基因编辑载体的根癌农杆菌；
[0125]
(3)、天目地黄遗传转化
[0126]
以天目地黄叶片为外植体，将天目地黄无菌苗的叶片剪成0.8cm大小的叶盘，浸泡入活化的步骤(2)得到的含有基因编辑载体的根癌农杆菌的ms液体培养基中8min后将外植体移至含有100μmol/l乙酰丁香酮的ms固体共培养培养基中，25℃下暗培养2.5d，然后用无菌水清洗外植体上的农杆菌，滤纸吸干外植体表面的无菌水后，转入含200mg/l特美汀、80mg/l卡那霉素、0.05mg/lnaa和2.0mg/l 6-ba的ms固体分化培养基中，25～27℃下光培养，待抗性芽长至2.5cm时，切取抗性芽转入ms生根培养基，光培养，诱导生根得到转基因植株，其中：
[0127]
ms共培养培养基、分化培养及和生根培养基的ph值均为5.8；
[0128]
(4)、转基因植株的分子检测
[0129]
利用crispr/cas9表达载体的cas9基因和载体序列设计2对特异引物对转基因植株进行pcr分子检测，进而判断检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株基因组中是否已经转入表达载体的t-dna序列，若是，则有2条目的条带，为阳性转基因植株；若否，则没有目的条带，为假阳性非转基因植株。
[0130]
进一步地，还包括步骤(5)转基因植株靶位点dna序列分析：
[0131]
提取步骤(4)得到的阳性转基因植株的基因组dna，在基因编辑的靶点序列前后设计特异引物进行pcr扩增，扩增产物胶回收并连接ta克隆载体，转化大肠杆菌dh5α，挑取单菌落进行测序，或回收pcr扩增产物进行高通量二代扩增序列测序，确定靶点序列是否突变
以及突变的类型，若已经突变，靶点序列存在核苷酸碱基缺失、插入或替换；若未突变，靶点序列核苷酸碱基没有变化。
[0132]
进一步地，步骤(1)中所述地黄rgpds1基因的ncbi登记号mw132596。
[0133]
进一步地，步骤(1)中所述特异的pcr引物包括正向引物rcpds1_f和反向引物rcpds1_r，其中：
[0134]
正向引物rcpds1_f：5
’‑
cagttgcctgagctgttgaa-3’；
[0135]
反向引物rcpds1_r：5
’‑
gcttccctatcttctgtcttcc-3’。
[0136]
进一步地，步骤(2)中所述crispr/cas9基因编辑载体含有卡那霉素抗性基因。
[0137]
进一步地，步骤(3)中所述光培养为每天光照培养14h，暗培养10h。
[0138]
进一步地，步骤(4)中所述2对特异引物包括第一特异引物和第二特异引物；
[0139]
第一特异引物正向引物cas9_f：5
’‑
tcaacggcattcgggacaag-3’；
[0140]
第一特异引物反向引物cas9_r：5
’‑
ccacatacatatcgcggcca-3’；
[0141]
第二特异引物正向引物pkse401_f：5
’‑
tgtcccaggattagaatgattaggc-3’；
[0142]
第二特异引物反向引物sgrcpds1_r：5
’‑
cccagcacatcccttgctt-3’。
[0143]
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。