螺环异恶唑酮色满衍生物在制备用于治疗JAK1介导的疾病药物中的用途

螺环异恶唑酮色满衍生物在制备用于治疗jak1介导的疾病药物中的用途
技术领域
1.本发明提供了三种螺环异恶唑酮色满衍生物和使用方法，它们选择性抑制janus激酶1(jak1)的活性并且可用于制备治疗与jak1活性相关的疾病，包括例如炎症性病症、自身免疫性病症、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病或与白介素6(il-6)或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它疾病的药物。


背景技术：

2.蛋白激酶(pk)调节生命的各种生物过程,包括细胞生长、分化、存活、器官形成、组织修复和再生等。蛋白激酶还在包括癌症在内的人类疾病的发生发展中起着特殊的作用。细胞因子影响细胞分化、增殖和激活，并且可调节促炎症反应和抗炎症反应。
3.janus激酶(jak)是将来自膜受体的细胞因子信号传导给转录激活因子(stat)的细胞质蛋白酪氨酸激酶。有四种已知的哺乳动物jak：jak1、jak2、jak3和tyk2。多种细胞因子的信号传导涉及jak和转录激活因子(stat)。当细胞因子与其受体结合时， jak家族成员自身磷酸化和/或彼此转磷酸化，接着启动下游转录因子stat磷酸化，然后迁移到细胞核以调节转录过程。干扰素、大多数白细胞介素以及多种细胞因子和内分泌因子，例如epo、tpo、gh、gm-csf和prl均通过jak-stat进行细胞内信号转导(vainchenkerw.et al.(2008))。
4.已有的基因敲除实验模型和小分子jak抑制剂的研究揭示了一些jak的治疗潜力。 jak3是免疫抑制靶标(o’shea j.et al.(2004))已在实验中证实。目前jak3抑制剂已进入临床实验，适应症包括器官移植排斥、类风湿性关节炎(ra)、银屑病和克罗恩病。
5.tyk2是另一种已证实的免疫-炎性疾病的潜在靶标(levy d.and loomis c.(2007))。
6.jak1与其它jak进行杂二聚化，以传导细胞因子驱动的促炎症信号传导。jak1是免疫-炎性疾病区域中的新靶标。因此，选择性抑制jak1对于大量炎性疾病以及由jak1介导的信号转导驱动的其它疾病具有治疗益处。
7.细胞因子刺激的免疫和炎症反应促成疾病的发病机理：过度性或不适当的免疫/炎症反应促成急性肺损伤、自身免疫性疾病(例如类风湿关节炎、哮喘、全身性红斑狼疮、甲状腺炎、心肌炎)和移植排斥、骨关节炎等疾患(ortmann,r.a.et al.(2000)arthritis res 2(1)：16-32)
8.癌症中jak/stat的激活可通过细胞因子刺激(例如il-6或gm-csf)或通过jak 信号传导的内源性抑制剂例如socs或pias的减少而发生(boudny,v.et al.neoplasm.49： 349-355,2002)。
9.急性肺损伤及其更严重的急性呼吸窘迫综合征是由各种肺部损伤引起的一系列肺部组织病变。急性肺损伤是一种死亡率高达30-40％的严重临床疾病。肺部的有害刺激致使体内炎症系统被激活，多种炎症细胞在肺部募集并激活，进而释放大量炎症介质、细胞因子，导致肺组织遭受二次打击，进而炎症反应加重，出现弥漫性肺泡损伤，肺血管通透性增
高，中性粒细胞浸润、肺水肿等病理性损伤。在炎症反应加重的进程中细胞因子大量释放扮演了重要的角色，而细胞因子尤其il-6、γ干扰素通过jak信号通路使炎症反应放大、恶化，最终出现呼吸急性呼吸窘迫综合征。
10.研究显示银屑病的发生发展也依赖于多种炎症性细胞因子(jci，113∶1664-1675)，这些炎症因子中多数都通过jak进行信号传导(adv pharmacol.2000；47:113-74)。
11.因此，抑制jak激酶能有效预防和治疗炎症性疾病(例如，急性肺损伤、骨性关节炎)、自身免疫性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、或与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它疾病的药物。
12.目前的疗法，并不令人满意，本文所述的本发明的化合物及其组合物和方法针对这些需要,用于制备预防和治疗炎症性疾病(例如，急性肺损伤、骨性关节炎)、自身免疫性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、或与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它疾病的药物。


技术实现要素：

13.本发明提供了三种选择性jak1的抑制剂及其应用，具体地，本发明提供了三种式(i) 所示化合物，即螺环异恶唑酮色满衍生物，所述的化合物相较于现有技术的选择性jak1的抑制剂，活性有明显提升，因此可以用于制备治疗炎症性疾病(例如，急性肺损伤、骨性关节炎)、自身免疫性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、或与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它等jak1介导的相关疾病的药物。
14.在一个方面，本发明的任一化合物可以抑制jak激酶家族成员，更特别地是jak1。
15.本发明提供了一种治疗患有选自本文列出的那些病症并且特别是炎症性疾病(例如，急性肺损伤、骨性关节炎)、自身免疫性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、或与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它与jak1相关的疾病的哺乳动物、特别是人类的方法，所述方法包括施用有效量的如本文所述的本发明的化合物或含自式(ⅰ) 所示的任一化合物的药物组合物。
16.在另一个方面，本发明还提供用于医学的药物组合物，其包含本发明的化合物和药用载体、赋形剂或稀释剂，在一个特别的方面，药物组合物可以另外包含适合与本发明的化合物组合使用的其它治疗活性成分，在一个更特别的方面，其它治疗活性成分为用于治疗炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、变应性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病的试剂。
17.药物组合物用于预防和/或治疗炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、变应性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病。
18.所述的药物组合物其他活性成分，包含如下的活性物质：免疫抑制剂、糖皮质激素、非甾体抗炎药、长春碱类化合物、紫杉醇、dna损伤剂、bcl-2抑制剂、btk抑制剂、jak 抑制剂、hsp90抑制剂、alk抑制剂、flt3抑制剂、pi3k抑制剂和syk抑制剂。
19.而且，用于本文公开的药物组合物和治疗方法中的本发明的组合物在制备和使用时是可药用的。
20.本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述化合物、其立体异构体、几何异构体、互变异构体、其药学上可接受的盐、其前药、其水合物或溶剂合物或本发明第二方面所述药物组合物的用途，用于制备治疗炎性疾病、自身免疫疾病、移植排斥、癌症和增生性疾病药物，疾病选自下组：急性肺损伤、风湿性疾病、类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年关节炎、强直性脊柱炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、银屑病、银屑病关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠道应激综合症、皮肌炎、硬皮病、变应性皮炎、器官移植排斥反应、肾病综合症、干燥综合征、自身免疫性肝炎、甲状腺炎、葡萄膜炎、心肌炎、过敏性鼻炎、骨髓增生症。
21.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
22.应当理解，本发明的化合物可以被代谢，生成生物活性代谢物。
23.发明详述
24.定义
25.下列术语具有下文阐述的含义，并且可用于理解本发明的描述和预期范围。
26.当描述本发明(其可以包括化合物、含有该化合物的药物组合物和使用该化合物和组合物的方法)时，除非另有说明，否则下列术语(如果存在的话)具有下述含义。还应当理解，当在本文中描述时，任何下文列出定义的部分可以被多种取代基取代，并且各个定义旨在将这样的取代的部分包括在如下列出的它们的范围内。除非另有说明，否则术语“取代的”如下文描述进行定义。应当进一步理解，当在本文中使用时，术语“基团”和“基”被认为可互换。
27.本文中可能用到的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或多于一个(种)(即至少一个(种)) 的该冠词的语法对象。例如，“类似物”指一种类似物或多于一种类似物。
[0028]“可药用”指已经被联邦或州政府管理机构或除美国之外的国家的相应机构批准或可批准或已列在美国药典(us pharmacopeia)或其它公认药典中用于动物(并且更特别是人类)中。
[0029]“可药用盐”指可药用并且具有母体化合物的期望药理活性的本发明化合物的盐。特别地，这样的无毒性盐可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。特别地，这样的盐包括：(1) 与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸为例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸为例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、
4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)代替时或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、n-甲基葡糖胺等)配位时形成的盐。仅仅举例来说，盐进一步包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等；并且当化合物含有碱性官能团时，包括无毒的有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“可药用的阳离子”指酸性官能团的可接受的阳离子抗衡离子。这样的阳离子为例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵阳离子等。
[0030]“可药用赋形剂”指与本发明化合物一起施用的稀释剂、助剂、赋形剂或载体。
[0031]“前药”指具有可裂解基团并且可通过溶剂分解或在生理学条件下变为在体内具有药学活性的本发明化合物的化合物，包括本发明化合物的衍生物。这样的实例包括但不限于胆碱酯衍生物等、n-烷基吗啉酯等。
[0032]“溶剂化物”指通常通过溶剂分解反应与溶剂缔合(associated)的化合物形式。该物理缔合包括氢键键合。常规溶剂包括水、etoh、乙酸等。本发明的化合物可以制备为例如结晶形式，并且可以进行溶剂化或水合。合适的溶剂化物包括可药用溶剂化物，例如水合物，并且进一步包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。在某些情形中，例如，在一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时，溶剂化物能够被分离。“溶剂化物”包括溶液相和可分离溶剂化物。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。
[0033]“个体”包括人类。术语“人类”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用。
[0034]“有效量”是指当给药至个体以治疗疾病时足以实现该疾病治疗的本发明化合物的量。“有效量”可以根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗个体的年龄、体重等变化。
[0035]
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0036]“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0037]“预防”是指降低患上或发生疾病或障碍的风险(即，在疾病发作前使得该疾病的至少一种临床症状不在可能暴露于致病剂或易感染该疾病的个体中发生)。
[0038]
术语“防治”与“预防”有关，并且是指目的为预防而非治疗或治愈疾病的措施或程序。防治措施的非限制性实例可以包括给药疫苗如注射新冠疫苗；向将访问感染疟疾的风险较高地理区域人员提前给抗疟疾剂例如乙胺嘧啶。
[0039]
在一个实施方案中，任何疾病或病症的“治疗”是指改善该疾病或病症(即阻止该
疾病或减轻其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，“治疗”是指改善个体不能辨别的至少一个身体参数。在另一个实施方案中，“治疗”是指在物理方面调节疾病或病症(例如稳定可感受到的症状)或在生理学方面调节疾病或病症(例如稳定物理参数)或二者。在一个进一步的实施方案中，“治疗”是指减缓疾病的进程。
[0040]
如本文使用的术语“炎性疾病”是指包括以下的病症：急性肺损伤、风湿性疾病(例如，心肌炎、关节炎)、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型特发性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、变态反应性气道疾病(例如，哮喘、鼻炎)、慢性阻塞性肺病 (copd)、炎性肠病(ibd，例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)、结节病、内毒素引发的疾病状态(例如，心脏搭桥手术后并发症或促成例如慢性心脏衰竭的慢性内毒素状态)和涉及软骨的相关疾病，例如关节的相关疾病，多发性硬化症、特别地，该术语是指类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、变态反应性气道疾病(例如，哮喘)、结节病、慢性阻塞性肺病(copd)和炎性肠病。更特别地，该术语指类风湿性关节炎、结节病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和炎性肠病、器官移植排斥反应。
[0041]
如本文使用的术语“自身免疫疾病”是指包括以下的疾病：阻塞性气道疾病，包括病症例如copd、哮喘(例如，内源性哮喘、外源性哮喘、尘埃性哮喘、小儿哮喘)，特别是慢性或顽固性哮喘(例如，迟发性哮喘和气道高反应性)、支气管炎，包括支气管性哮喘、系统性红斑狼疮(sle)、皮肤红斑狼疮、膜性狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合征、多发性硬化、银屑病、干眼病、肾病综合症、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、i型糖尿病及其相关性并发症、特应性湿疹(特应性皮炎)、甲状腺炎(桥本甲状腺炎和自身免疫甲状腺炎)、接触性皮炎以及其它湿疹性皮炎、炎性肠病(例如，克罗恩病和溃疡性结肠炎)、动脉粥样硬化和肌萎缩性侧索硬化、斑秃、白癫风。特别地，该术语指copd、哮喘、皮肤红斑狼疮、膜性狼疮性肾炎、斑秃、白癫风、i型糖尿病和炎性肠病。
[0042]
如本文使用的术语“增殖性疾病”是指病症例如癌症(例如，子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、骨髓增生性障碍(例如，真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓纤维变性)、白血病(例如，急性骨髓样白血病、急性和慢性淋巴母细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、银屑病、再狭窄、硬皮病或纤维变性。特别地，该术语指癌症、白血病、多发性骨髓瘤和银屑病。
[0043]
如本文使用的术语“癌症”是指皮肤或身体器官例如但不限于乳房、前列腺、肺、肾、胰脏、胃或肠中细胞的恶性或良性生长。癌症易于浸润至相邻组织中，并且扩散(转移)至远端器官，例如骨、肝脏、肺或脑。
[0044]
如本文使用的术语“变态反应性疾病”是指特征在于免疫系统的超敏障碍的病症，包括变态反应性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、鼻窦炎、湿疹和荨麻疹，以及食物变态反应或对昆虫毒液的变态反应。
[0045]
如本文使用的术语“哮喘”是指特征在于与无论何种原因(内源性、外源性或二者；变态反应或非变态反应)的气道收缩相关的肺气流变化的任何肺病症。术语哮喘可以与一个或多个用以指示原因的形容词一起使用。
[0046]
如本文使用的术语“移植排斥”是指例如胰岛、干细胞、骨髓、皮肤、肌肉、角膜组织、神经元组织、心脏、肺、联合心-肺、肾脏、肝、肠、胰腺、气管或食道的细胞、组织或实体器官的同种异体移植或异种移植物的急性或慢性排斥，或移植物抗宿主疾病。
[0047]
如本文使用的术语“涉及软骨更新损伤的疾病”包括下述病症，例如骨关节炎、银屑病关节炎、幼年型类风湿性关节炎、痛风性关节炎、脓毒性或感染性关节炎、反应性关节炎、反射交感性营养不良、痛性营养不良、tietze综合征或肋软骨炎、纤维肌痛、骨软骨炎、神经源性或神经病性关节炎、关节病、地方性形式的关节炎如地方性变形性骨关节炎、mseleni 疾病和handigodu疾病；纤维肌痛引起的变性、系统性红斑狼疮、硬皮病和强直性脊柱炎。
[0048]
如本文使用的术语“与il-6分泌过多相关的疾病”包括下述病症，例如castleman病、多发性骨髓瘤、银屑病、卡波西肉瘤和/或系膜增殖性肾小球肾炎。
[0049]
如本文使用的术语“与干扰素分泌过多相关的疾病”包括下述病症，例如系统性和皮肤红斑狼疮、狼疮肾炎、皮肌炎、sjogren综合症、银屑病、类风湿性关节炎。
[0050]
前药包括本领域技术人员熟知的酸衍生物，例如通过使母体酸与适合的醇反应制备的酯，或通过使母体酸化合物与取代或未取代的胺反应制备的酰胺，或酸酐或混合酸酐。衍生自悬挂在本发明化合物上的酸性基团的简单脂族或芳族酯、酰胺和酸酐是特别有用的前药。
[0051]
还应当理解，具有相同分子式但其原子的键合性质或顺序不同或其原子空间排列不同的化合物称为“异构体”。原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。
[0052]
彼此不是镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，并且那些彼此为不能重叠镜像的称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心，例如其与4个不同基团键合时，可能存在一对对映异构体。对映异构体可以通过其不对称中心的绝对构型进行表征并且通过cahn和 prelog的r-和s-排序规则来描述，或通过分子旋转偏振光平面的方式来描述并且指定为右旋或左旋(即，分别为( )或(-)-异构体)。手性化合物可以以单个对映异构体或其混合物的形式存在。包含等比例的对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
[0053]“互变异构体”指具有特定化合物结构的可相互转换形式并且在氢原子和电子置换方面不同的化合物。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常为h)运动达到平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们可以通过用酸或碱处理快速地相互转化。互变异构现象的另一个实例是苯基硝基甲烷的酸形式和硝基形式，其同样是通过用酸或碱处理形成的。
[0054]
互变异构形式可能与达到感兴趣的化合物的最佳化学反应性和生物活性相关。
[0055]
本发明化合物可以具有一个或多个不对称中心；因此，这样的化合物可以以单个(r)
‑ꢀ
或(s)-立体异构体或以其混合物的形式制备。
[0056]
除非另有说明，否则说明书和权利要求书中对特定化合物的描述或命名意味着包括其单独的对映异构体及其混合物、外消旋物等。用于确立其立体化学和对立体异构体进行分离的方法是本领域众所周知的。
[0057]
应当理解，本发明的化合物可以被代谢，生成生物活性代谢物。
[0058]
本发明是基于发现了可用于制备预防和/或治疗炎症性疾病(例如，急性肺损伤、骨性关节炎)、自身免疫性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、或与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它与jak1相关的疾病的药物的选择性jak1抑制化合物。
[0059]
本发明还提供包含本发明化合物的药物组合物，以及通过施用本发明的组合物预防和/或治疗疾病的方法，所述疾病包括炎症性疾病(例如，急性肺损伤、骨性关节炎)、自身
免疫性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、或与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它与jak1相关的疾病。
[0060]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含式i的任一化合物具有jak1抑制活性。该化合物为tetrahedron 75(2019)682-687中公开的化合物。
[0061]
当用作药物时，本发明的化合物典型地以药物组合物形式给药,这样的组合物可以以药物领域熟知的方式制备并且包含至少一种式i的本发明的活性化合物。
[0062]
通常，本发明的化合物以药学有效量给药,本发明的化合物的实际给药量通常由医师根据相关情况确定，所述情况包括待治疗的病症、所选的给药途径、实际给药的本发明的化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度等。
[0063]
本发明的药物组合物可以通过多种途径给药，所述途径包括口服、直肠、透皮、皮下、关节内、静脉内、肌内和鼻内,取决于预期递送途径，将本发明的化合物优选配制为可注射或口服组合物或配制为用于透皮给药的膏剂、洗剂或贴剂。
[0064]
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
[0065]
本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的选自式(i)所示化合物、其药用盐、其前药及其水合物和溶剂合物中的一种或多种以及任选地，药学上可接受的载体，其可用于治疗jak1活性或表达量相关的疾病,所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。
[0066]
治疗方法
[0067]
在另外的治疗方法方面，本发明提供用于预防和/或治疗患有下述疾病的哺乳动物的方法：炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、变应性疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、与il-6或干扰素分泌过多相关的疾病，其中该方法包括施用有效量的本发明的化合物或一种或多种本文所述用于治疗或预防所述病症的药物组合物。
[0068]
在另一种治疗方法方面，本发明提供预防和/或治疗患有炎性疾病的哺乳动物的方法，其中所述方法包括施用有效量的本发明的组合物或一种或多种本文所述用于治疗或预防所述病症的药物组合物。在一个特定的实施方案中，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、变态反应性气道疾病、结节病、慢性阻塞性肺病 (copd)和炎性肠病。在一个更特定的实施方案中，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、结节病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和炎性肠病。
[0069]
在另一种治疗方法方面，本发明提供预防和/或治疗患有自身免疫疾病的哺乳动物的方法，其中所述方法包括施用有效量的本发明的化合物或一种或多种本文所述用于治疗或预防所述病症的药物组合物。在一个特定的实施方案中，所述自身免疫疾病选自哮喘、皮肤红斑狼疮、膜性狼疮性肾炎、斑秃、白癫风、i型糖尿病和炎性肠病。
[0070]
在另一种治疗方法方面，本发明提供预防和/或治疗患有增殖性疾病的哺乳动物的方法，其中所述方法包括施用有效量的本发明的化合物或一种或多种本文所述用于治疗或预防所述病症的药物组合物。在一个特定的实施方案中，所述增殖性疾病选自癌症、白血病、多发性骨髓瘤和银屑病。
[0071]
在另一种治疗方法方面，本发明提供预防和/或治疗患有涉及软骨更新损伤的疾
病的哺乳动物的方法，其中所述方法包括施用有效量的本发明的化合物或一种或多种本文所述用于治疗或预防所述病症的药物组合物。在一个特定的实施方案中，所述涉及软骨更新损伤的疾病为强直性脊柱炎。
[0072]
本发明的化合物可以作为单一活性剂给药，或者可以与其它治疗剂组合给药，所述其它治疗剂包括显示相同或类似治疗活性并且已经确定对于所述组合给药是安全并且有效的本发明的其它化合物。在一个特定的实施方案中，两种(或多种)活性剂的共同给药使得可以显著降低待使用的每种活性剂的剂量，从而减少观察到的副作用。
[0073]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0074]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0075]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
附图说明
[0076]
图1示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对脂多糖诱导的raw264.7 巨噬细胞增殖的影响。(a)荧光显微镜下观察到的巨噬细胞。其中，被标记的细胞呈蓝色荧光，增殖细胞呈绿色荧光；(b)edu阳性增殖细胞的百分比。结果以均数
±
标准差表示。
##
p《0.01vs正常对照组，
*
p《0.05,
**
p《0.01vs lps模型组，n＝3。
[0077]
图2示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对脂多糖诱导的raw264.7 巨噬细胞凋亡的影响。(a)流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡结果；(b)检测到的凋亡细胞在巨噬细胞中的占比。结果以均数
±
标准差表示。
*
p《0.05,
**
p《0.01vs lps模型组，n＝3。
[0078]
图3示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对脂多糖诱导的raw264.7 巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-1β(il-1β)水平的影响。的影响。(a)巨噬细胞中免疫炎症因子il-6水平；(b)巨噬细胞中免疫炎症因子tnf-α水平；(c)巨噬细胞中免疫炎症因子il-1β水平。结果以均数
±
标准差表示。
##
p《0.01vs正常对照组，
*
p《0.05,
**
p《0.01vs lps模型组，n＝4。
[0079]
图4示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠生存率的影响。结果以均数
±
标准差表示。*p《0.05,**p《0.01vs模型组小鼠，n＝10。
[0080]
图5示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3明显减轻脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的肺部组织病理学损伤以及肺损伤评分。(a)各组小鼠肺组织的苏木精-伊红染色切片；(b)各组小鼠肺部损伤程度评分。结果以均数
±
标准差表示。##p《0.01vs正常组小鼠，*p《0.05,**p《0.01vs模型组小鼠，n＝3。
[0081]
图6示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的湿/干重比的影响。结果以均数
±
标准差表示。
##
p《0.01vs正常组小鼠，
*
p《0.05,
**
p《0.01vs模型组小鼠，n＝5。
[0082]
图7示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对脂多糖诱导的急性肺损伤
小鼠的肺组织中髓过氧化物酶活性的影响。结果以均数
±
标准差表示。
##
p《0.01vs正常组小鼠，
*
p《0.05,
**
p《0.01vs模型组小鼠，n＝5。
[0083]
图8示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-1β(il-1β)水平的影响。(a)小鼠血清中免疫炎症因子il-6水平；(b)小鼠血清中免疫炎症因子tnf-α水平； (c)小鼠血清中免疫炎症因子il-1β水平。结果以均数
±
标准差表示。
##
p《0.01vs正常组小鼠，
*
p《0.05,
**
p《0.01vs模型组小鼠，n＝5。
[0084]
图9示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂诱导的cia大鼠右后足爪体积的影响。##p《0.01vs正常组小鼠，*p《0.05,**p《0.01vs cia 模型组小鼠，n＝10。
[0085]
图10示出，选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，si-3对牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂诱导的cia大鼠致炎后18小时、14天、28天时血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-1β(il-1β)水平的影响。(a)cia大鼠致炎后18小时血清中免疫炎症因子(tnf-α、il-6、il-1β)水平；(b)cia大鼠致炎后14天血清中免疫炎症因子(tnf-α、 il-6、il-1β)水平；(c)cia大鼠致炎后28天血清中免疫炎症因子(tnf-α、il-6、il-1β) 水平。结果以均数
±
标准差表示。
##
p《0.01vs正常组小鼠，
*
p《0.05,
**
p《0.01vs模型组小鼠， n＝10。
具体实施方式
[0086]
实施例1体外分析
[0087]
体外jak激酶的ic
50
测定
[0088]
通过迁移率转移法测定化合物(螺环异恶唑酮色满衍生物)对jak激酶活性的抑制作用。
[0089]
为了测定化合物的ic
50
，以10个剂量(从最高浓度10μm开始，利用3倍系列稀释) 测试化合物，复孔测试。以浓度的对数值为x轴，以抑制百分率为y轴，通过拟合量效曲线推导出ic
50
值。
[0090]
用二甲基亚砜(dmso)溶解化合物(螺环异恶唑酮色满衍生物)，按照3倍浓度梯度配置加入到384孔板中，每孔加入容积为250nl。将激酶缓冲液制备的2.5倍终浓度的 jak激酶溶液10μl分别加入含螺环异恶唑酮色满衍生物及阳性对照药(baricitinib和 cerdulatinib)的各孔中，同时也加入阳性对照孔。阴性对照孔中加入10μl激酶缓冲液。将孔板以1000rpm离心30秒，反应板振荡混匀后室温孵育10分钟。向每个孔中加入15μl的 5/3倍终浓度的atp和底物的混合溶液，起始反应。将孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育相应的时间。加入30μl终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。用caliper ez reader读取转化率(c％)。
[0091]
抑制百分率＝(c％max-c％样品)/(c％max-c％min)。最大值转化率(c％max): 阳性对照孔的平均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。样本转换率(c％样品):样本的转换率读数。最小值转化率(c％min):阴性对照孔平均值，代表没有酶活性的孔的转化率读数。
[0092]
以浓度的对数值为x轴，以抑制百分率为y轴，采用分析软件graphpad prism 5 的log(inhibitor)vs.response
–
variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活
性的 ic
50
值。
[0093][0094]
结论如表一的所示，本发明的化合物对jak1激酶有选择性抑制作用，且三种化合物的ic
50
值均在nm水平，说明对酶的抑制作用较强。
[0095]
实施例2体外分析
[0096]
细胞实验
[0097]
1.1选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，利用lps诱导的巨噬细胞raw264.7 模型，检测化合物si-3对lps诱导的巨噬细胞增殖的影响
[0098]
1.1.1材料
[0099]
细胞株raw264.7是小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，由重庆医科大学分子药理学实验室获得；dmem高糖培养基gibco公司；胎牛血清购自中国塞米克公司；脂多糖(lps) 购自sigma公司；地塞米松dex、edu-488细胞增殖检测试剂盒购自碧云天生物技术。
[0100]
1.1.2研究设计
[0101]
将细胞分为正常对照组(control group)：使用含血清培养基正常培养细胞；lps 模型组(lps model group)使用加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激细胞增殖；地塞米松治疗组(dex group)：使用加入dex(1μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激细胞增殖；si-3高剂量治疗组(si-3high dose group)：使用加入si-3(3μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激细胞增殖；si-3中剂量治疗组(si-3middle dose group)：使用加入si-3 (0.3μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激细胞增殖；si-3低剂量治疗组(si-3low dose group)：使用加入si-3(0.03μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激细胞增殖。用100μm 的edu溶液标记细胞2小时后，用beyoclick
tm
edu-488细胞增殖试剂盒检测细胞增殖情况并使用hoechst 33342进行核染色。蓝色染料用于标记所有细胞，而增殖细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光。使用荧光显微镜拍照并检测化合物si-3对对lps诱导的巨噬细胞增殖的影响。
[0102]
1.1.3研究结果
[0103]
如附图1所示，与正常对照组相比，lps模型组中增殖的巨噬细胞显著增多。与lps 模型组相比，si-3高、中、低剂量均抑制了lps诱导的巨噬细胞增殖。
[0104]
1.2选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，利用lps诱导的巨噬细胞raw264.7 模型，检测化合物si-3对lps诱导的巨噬细胞凋亡的影响
[0105]
1.2.1材料
[0106]
annexin v-egfp凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术。
[0107]
1.2.2研究设计
[0108]
将细胞分为正常对照组(control group)：使用含血清培养基正常培养细胞；lps模型组(lps model group)使用加入lps(1mg/l)含血清培养基刺激巨噬细胞；地塞米松治疗组(dex group)：使用加入dex(1μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入 lps(1mg/l)的含血清培养基刺激巨噬细胞；si-3高剂量治疗组(si-3high dose group)：使用加入si-3(3μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激巨噬细胞；si-3中剂量治疗组(si-3middle dose group)：使用加入si-3 (0.3μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激巨噬细胞；si-3低剂量治疗组(si-3low dose group)：使用加入si-3(0.03μmol/l)的含血清培养基处理细胞24小时后，加入lps(1mg/l)的含血清培养基刺激巨噬细胞。将各组细胞培养液和细胞收集到离心管中，离心1000rpm 5分钟，然后用pbs重悬以避免细胞聚集。应用膜联蛋白v-egfp检测细胞凋亡试剂盒标记凋亡细胞后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
[0109]
1.2.3研究结果
[0110]
如附图2所示，与lps模型组相比，si-3高、中、低剂量均显著促进了lps诱导的巨噬细胞凋亡。
[0111]
1.3选用式
ⅰ③
化合物(si-3)为研究对象，利用lps诱导的巨噬细胞raw264.7 模型，检测化合物si-3对lps诱导的巨噬细胞中炎症细胞因子tnf-α、il-6、il-1β水平的影响
[0112]
1.3.1材料
[0113]
tnf-α、il-1β、il-6的elisa试剂盒购自江苏美标生物科技有限公司。
[0114]
1.3.2研究设计
[0115]
酶联免疫吸附测定法测定lps诱导的巨噬细胞中tnf-α、il-6、il-1β的水平。设置空白孔、标准品孔和样品孔。标准品孔加入样本稀释液40μl和不同浓度的标准液10μl，样品孔加入样本稀释液40μl和各组巨噬细胞培养基上清液10μl。标准品孔和样品孔加入 100μl辣根过氧化物酶标记的检测抗体。用封板膜包被封闭后于37℃烘箱恒温孵育一小时。封闭结束后，倒去孔中液体，加入洗涤液于各孔，静置30秒倒去，重复操作五次。每孔加入底物a、b各50μl，避光孵育15分钟。加入反应终止液50μl于各孔，在15分钟内在 450nm处测定各孔吸光度。用标准品吸光度绘制标准曲线，计算出巨噬细胞培养基上清液样品中免疫细胞因子的浓度。
[0116]
1.3.3研究结果
[0117]
如附图3所示，化合物si-3处理可抑制lps诱导的巨噬细胞中炎症因子tnf-α、 il-6、il-1β分泌。
[0118]
实施例3体内分析
[0119]
对小鼠急性肺损伤的防治作用
[0120]
2.1利用lps诱导小鼠构建急性肺损伤(ali)模型
[0121]
2.1.1材料
[0122]
髓过氧化物酶(mpo)活性检测试剂盒检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0123]
2.1.2动物
[0124]
balb/c小鼠(雄性，18-20g体重)从重庆医科大学实验动物中心获得。将小鼠置于
12 小时明/暗循环(07:00-19:00)下。将温度维持在22
±
2℃，随意获取食物和水。
[0125]
2.1.3研究设计
[0126]
2.1.3.1雄性balb/c小鼠(20-25g)随机数字法分为4组，每组10只。
①
模型组(modelgroup)：腹腔注射脂多糖(lps)6mg/kg；
②
地塞米松治疗组(dex group)：腹腔注射脂多糖(lps)6mg/kg前后两小时灌胃给药地塞米松(dex)1.5mg/kg；
③
si-3高剂量治疗组 (si-3high dose group)：腹腔注射脂多糖(lps)6mg/kg前后两小时灌胃给药si-3(0.5mg/kg)；
④
si-3低剂量治疗组(si-3low dose group)：腹腔注射脂多糖(lps)6mg/kg前后两小时灌胃给药si-3(0.25mg/kg)；观察72小时内小鼠的状态并记录死亡时间。
[0127]
3.1.3.2雄性balb/c小鼠(20-25g)随机数字法分为6组，每组10只。
①
正常对照组 (control group)：腹腔注射等体积0.9％氯化钠注射液；
②
si-3药物对照组(drug controlgroup)：灌胃给药si-3(0.5mg/kg)；
③
模型组(model group)：腹腔注射脂多糖(lps) 6mg/kg；
④
地塞米松治疗组(dex group)：腹腔注射脂多糖(lps)6mg/kg前后两小时灌胃给药地塞米松(dex)1.5mg/kg；
⑤
si-3高剂量治疗组(si-3high dose group)：腹腔注射脂多糖(lps)6mg/kg前后两小时灌胃给药si-3(0.5mg/kg)；
⑥
si-3低剂量治疗组(si-3lowdose group)：腹腔注射脂多糖(lps)6mg/kg前后两小时灌胃给药si-3(0.25mg/kg)。24 小时后，腹腔注射1％戊巴比妥50mg/kg麻醉小鼠。每组小鼠随机取5只小鼠摘眼球取血，分离血清用于elisa检测相关细胞因子水平；分离肺组织用于检测肺组织湿/干重比。每组剩余5只小鼠腹主动脉放血处死，分离肺组织，肺叶用4％多聚甲醛固定用于he染色检测肺组织病理学改变。
[0128]
3.1.4研究结果
[0129]
3.1.4.1对ali小鼠生存期和生存率的影响
[0130]
如附图4所示，si-3明显降低lps诱导的急性肺损伤小鼠死亡率并延长了ali小鼠的生存时间。
[0131]
3.1.4.2对组织病理变化的影响
[0132]
光镜下观察he染色的肺组织切片，并采用半定量评分方法对各动物的组织病理学变化进行评分。评分包含以下四个指标：1、肺泡充血；2、出血；3、肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；4、肺泡壁增厚或透明膜形成。以上四个指标按照肺组织破坏程度评分，从0(正常)到4(严重)进行分级。如附图5所示，化合物si-3明显减轻lps诱导的急性肺损伤小鼠肺组织病理学损伤。
[0133]
3.1.4.3对肺组织w/d的影响
[0134]
肺组织湿/干重比作为肺水肿程度的指标，可以反映急性肺损伤时肺水肿的程度。将小鼠处死后取出肺组织，用电子天平称重，以获得湿重(w)。随后，将肺组织置于60℃的烘箱中72小时，直到重量不再发生改变，再次称重，获得干重(d)。通过计算湿/干重比值(w/d) 来评估肺水肿。如附图6所示，化合物si-3处理可抑制脂多糖诱导的小鼠肺组织水肿，且呈剂量依赖性。
[0135]
3.1.4.4对急性肺损伤小鼠肺组织mpo活性
[0136]
将各组小鼠肺组织用电子天平称重并记录。按照组织重量：生理盐水＝1mg：10μl，加入并充分研磨组织，3000r离心10分钟，取上清液按试剂盒说明书操作，测定mpo活性。髓过氧化物酶(mpo)富含于中性粒细胞中，mpo活性是中性粒细胞聚集程度的定量指标，因此
肺组织mpo活性可以反映急性肺损伤小鼠肺组织的中性粒细胞浸润程度。如附图7所示，化合物si-3明显降低小鼠肺组织中mpo活性，可减轻lps诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中性粒细胞的浸润。
[0137]
3.1.4.5对ali小鼠血清中炎症细胞因子tnf-α、il-6、il-1β水平的影响
[0138]
酶联免疫吸附测定法测定lps诱导的ali小鼠血清中tnf-α、il-6、il-1β的水平。设置空白孔、标准品孔和样品孔。标准品孔加入样本稀释液40μl和不同浓度的标准液10μl，样品孔加入样本稀释液40μl和各组ali小鼠血清10μl。标准品孔和样品孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的检测抗体。用封板膜包被封闭后于37℃烘箱恒温孵育一小时。封闭结束后，倒去孔中液体，加入洗涤液于各孔，静置30秒倒去，重复操作五次。每孔加入底物 a、b各50μl，避光孵育15分钟。加入反应终止液50μl于各孔，在15分钟内在450nm处测定各孔吸光度。用标准品吸光度绘制标准曲线，计算出ali血清样品中免疫细胞因子的浓度。如附图8所示，化合物si-3处理可抑制脂多糖诱导的小鼠血清中炎症因子tnf-α、il-6、il-1β分泌。
[0139]
实施例4体内分析
[0140]
对大鼠类风湿关节炎的防治作用
[0141]
4.1利用牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂诱导大鼠类风湿关节炎模型
[0142]
4.1.1材料
[0143]
牛ⅱ型胶原、不完全弗氏佐剂购自sigma公司。
[0144]
4.1.2动物
[0145]
雄性sd大鼠(220-250g)从重庆医科大学实验动物中心获得。将大鼠置于12小时明/暗循环(07:00-19:00)下。将温度维持在22
±
2℃，随意获取食物和水。
[0146]
4.1.3牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂配置
[0147]
使用匀浆器将不完全弗氏佐剂(ifa)与牛ⅱ型胶原乳化。向10ml ep管中加入3ml 的ifa，在低速(1000-3000rpm)混合的同时，缓慢地逐滴加入3ml的牛ⅱ型胶原溶液 (2mg/ml)。接下来，将ep管放在冰水中，以保持乳液在混合过程中的冷却。继续以最大速度混合乳剂(10,000-30,000rpm)2分钟。将ep管放在冰水中5分钟，冷却乳剂。重复搅拌，冷却2-3次。在装有水的烧杯中加入一滴乳剂，测试乳剂的稳定性。如果乳状液是稳定的，液滴将保持为固体团块，不会消散。在一小时内注射胶原蛋白乳液。使用前，保持乳液在4℃下冷却。
[0148]
4.1.4研究设计
[0149]
4.1.4.1雄性sd大鼠(220-250g)随机数字法分为7组，每组10只。
①
正常对照组(control group)：大鼠的右后足爪皮下注射0.9％氯化钠注射液(0.1ml/只)；
②
cia模型组(cia model group)：大鼠的右后足爪皮下注射牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂(0.1ml/只)；
③
强的松治疗组(pdn group)大鼠的右后足爪皮下注射牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂(0.1ml/ 只) 灌胃给药强的松pdn(2.5mg/kg)；
④
巴瑞克替尼治疗组(ba group)大鼠的右后足爪皮下注射牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂(0.1ml/只) 灌胃给药巴瑞克替尼ba(0.2mg/kg)；
⑤
si-3高剂量治疗组(si-3high dose group)：大鼠的右后足爪皮下注射牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂(0.1ml/只) 灌胃给药si-3(0.5mg/kg)；
⑥
si-3中剂量治疗组(si-3middle dosegroup)：大鼠的右后足爪皮下注射牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂(0.1ml/只) 灌胃给药si-3 (0.25mg/kg)；
⑦
si-3低剂量治疗组(si-3low dose group)：大鼠的右后足爪皮下注射牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂(0.1ml/只) 灌胃给药si-3(0.125mg/kg)。
[0150]
4.1.4.2按照容积测量法测定并记录每只大鼠右后足爪初始体积。测定后，每组大鼠灌胃给予相应药物，即正常对照组和cia模型组给予溶媒(0.5％羧甲基纤维素钠-生理盐水)；强的松治疗组给予强的松(2.5mg/kg)；巴瑞替尼治疗组给予巴瑞替尼(0.2mg/kg)；si-3 高、中、低剂量治疗组给予相应剂量药物(0.5mg/kg，0.25mg/kg，0.125mg/kg)。给药一小时后，除正常对照组大鼠右后足爪皮下注射0.9％氯化钠注射液(0.1ml/只)外，各组小鼠的右后足爪皮下注射牛ⅱ型胶原-不完全弗氏佐剂(0.1ml/只)构建大鼠类风湿性关节炎模型。
[0151]
4.1.4.3致炎18小时后，测定并记录每只大鼠右后足爪体积。致炎18小时后，腹腔注射1％戊巴比妥50mg/kg麻醉固定大鼠，采集大鼠眼眶外眦血，分离血清用于elisa检测 tnf-α、il-6、il-1β水平。致炎7天时测定记录各组大鼠右后足爪体积；致炎7天后开始给药，连续7天。14天时测定记录各组大鼠右后足爪体积并采集大鼠眼眶外眦血，测定炎症细胞因子水平。致炎21天后再次给药，连续7天。21天时测定记录各组大鼠右后足爪体积。致炎28天后，测定记录各组大鼠右后足爪体积并采集大鼠眼眶外眦血，测定炎症细胞因子水平。
[0152]
4.1.5研究结果
[0153]
4.1.5.1对足爪体积的影响
[0154]
如附图9所示，与正常对照组相比，cia模型组大鼠右后足爪体积明显增加。与cia 模型组相比，si-3高、中、低剂量组显著降低了大鼠右后足爪体积。
[0155]
4.1.5.2对大鼠血清中炎症因子的影响
[0156]
如附图10所示，与正常对照组相比，cia模型组大鼠血清中炎症因子水平明显增加。与cia模型组相比，si-3高、中、低剂量组显著大鼠血清中炎症因子水平。
[0157]
本发明人经过长期而深入的研究，提供了一种结构新颖的jak1抑制剂化合物，所述的化合物相较于现有技术的jak1抑制剂，选择性和活性有明显提升，因此可以用于制备预防和/或治疗炎症性疾病、自身免疫疾病、移植排斥、涉及软骨更新损伤的疾病、或与il-6 或干扰素分泌过多相关的疾病、癌症和其它jak1介导的相关疾病。基于上述发现，发明人完成了本发明。