小麦谷蛋白大聚体含量主效基因位点TaIGC-7B的分子标记引物及其应用

小麦谷蛋白大聚体含量主效基因位点taigc-7b的分子标记引物及其应用
技术领域
1.本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及小麦谷蛋白大聚体含量主效基因位点taigc-7b的分子标记引物及其应用。


背景技术：

2.小麦(triticum aestivum l.)是我国最主要的粮食作物之一，其产量和消费量均居世界首位。小麦面粉加水后具有特殊的制面特性，面团既具有弹性又具有延展性，可以被用来加工成各种食品，如面包、面条、馒头、饼干和糕点。目前的研究已表明：小麦籽粒中蛋白的含量及其组成对品质有着非常重要的影响。小麦籽粒蛋白主要包括两部分：与代谢相关的清蛋白和球蛋白，与品质密切相关的面筋蛋白。近年来，随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对于优质食品和营养健康的需求将会越来越高，因此提高小麦品质是当前小麦遗传改良的重要目标。
3.小麦面筋蛋白根据分子量大小主要分为高分子量麦谷蛋白(high molecular weight glutenin subunits，hmw-gss)、低分子量麦谷蛋白(low molecular weight glutenin subunits，lmw-gss)和醇溶蛋白(gliadins)，它们分别占到小麦总面粉蛋白的7.5％、32.5％、40.0％。面团的形成实质上是小麦粉中的面筋蛋白吸水形成面筋网络结构的过程。在小麦成熟籽粒中，hmw-gss和lmw-gss通过分子间二硫键形成谷蛋白大聚体(glutenin macropolymer，gmp)，极少部分醇溶蛋白也参与gmp的形成。gmp是分子量很大的聚合体蛋白，在面筋网络结构的形成过程中发挥重要作用，进而影响面团的弹性和延展性。根据谷蛋白在正丙醇溶液中的溶解性，把易溶于50％正丙醇溶液而不溶于70％正丙醇溶液的这部分谷蛋白称为可溶性谷蛋白(soluble glutenin，sg)，把不溶于50％正丙醇溶液而溶于含1％二硫苏糖醇(dtt)的50％正丙醇溶液部分叫做不溶性谷蛋白(insoluble glutenin，ig)，这部分不溶性谷蛋白主要为聚合体蛋白。研究表明ig的含量(insoluble glutenin content，igc)与面筋和面团强度及面团加工品质参数显著相关，能够解释83-95％的面团流变学参数变异和74％的面包体积变异(bean s,lyne r,tilley k,et al.a rapid method for quantitation of insoluble polymeric proteins in flour.cereal chemistry,1998,75(3):374-379；sapirstein h,fu b.intercultivar variation in the quantity of monomeric proteins,soluble and insoluble glutenin,and residue protein in wheat flour and relationships to breadmaking quality.cereal chemistry,1998,75(4):500-507.)。ig提取方法简单，需要的面粉量很少(100μg)，并且能够利用分光光度计进行高通量的蛋白定量，是研究谷蛋白大聚体的合适指标，可用于小麦早代品质性状的评价。
4.igc是典型的数量性状，受基因型、环境以及基因型和环境互作的影响。当前，利用igc指标来评价面团指标的实践报道很少。hu等(2007)分析了25份中国小麦材料中不同类型蛋白含量(单体蛋白、可溶性蛋白及不溶性蛋白)对白盐面条加工特性的影响，研究发现
igc与面条加工厚度、切割硬度呈显著正相关(hu x,wei y,wang c,et al.quantitative assessment of protein fractions of chinese wheat flours and their contribution to white salted noodle quality.food research international,2007,40(1):1-6.)。jin等(2015)利用全基因组关联分析对来自黄淮麦区的90份普通小麦品种中控制igc的位点进行了遗传解析，表型变异表明，igc主要受基因型影响，其在不同环境不同基因型之间的变异能够达到3～6倍，具有较高的遗传力。关联分析发现除了与glu-d1和glu-a1紧密连锁的标记之外，wpt-2087、wpt-3342、wpt-2878为检测到的显著影响igc的新位点，分别位于2al、3bl和7bl上，并解释7.50％、5.96％和7.26％的表型变异(jin h,wang z,li d,et al.genetic analysis of chromosomal loci affecting the content of insoluble glutenin in common wheat.journal of genetics and genomics,2015,42(9):495-505.)。
5.提高和改善小麦面粉的加工品质是当前小麦遗传改良的难点和重点。面筋复合体的形成及其功能是小麦籽粒拥有加工品质的前提。尽管前人已经对影响面筋强度的qtl进行了一些研究和报道，然而主效位点主要侧重于已知构成面筋复合体的麦谷蛋白位点。虽然已知谷蛋白和醇溶蛋白是面筋复合体的主要组分，但促进面筋复合体形成与功能的基因及其分子机理还不清楚，这对于有效调控面筋复合体并改良籽粒加工品质是很不利的。与传统育种相比，分子标记辅助选择能够直接对目标基因型进行选择，不受基因表达及环境变化的影响，能够提高选择的准确性，从而加快育种进程。因此有必要开发与谷蛋白大聚体含量位点相关的分子标记，减少选择时的连锁累赘，提高对谷蛋白大聚体含量相关基因的应用效率。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定小麦谷蛋白大聚体含量和/或加快小麦选择育种进程。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
7.为解决上述技术问题，本发明首先提供了与谷蛋白大聚体(glutenin macropolymer，gmp)含量主效基因位点taigc-7b相关的indel分子标记和/或检测所述分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定小麦谷蛋白大聚体含量中的应用，所述分子标记名称为hau-taigc-7b，分子标记hau-taigc-7b的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.进一步地，所述鉴定或辅助鉴定小麦谷蛋白大聚体含量是以不溶性谷蛋白含量(insoluble glutenin content，igc)为指标。
9.上述应用中，所述物质含有扩增包含所述分子标记在内的小麦基因组dna片段的pcr引物。
10.上述应用中，所述pcr引物为引物对，所述引物对由正向引物和反向引物组成，所述正向引物(上游引物f)为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna，所述反向引物(下游引物r)为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna。所述分子标记hau-taigc-7b和/或所述引物对也在本发明的保护范围内。
11.本发明还提供了含有所述引物对的试剂或试剂盒。
12.进一步地，所述试剂可为鉴定或辅助鉴定小麦谷蛋白大聚体含量的pcr试剂。
13.进一步地，所述试剂盒还包括pcr扩增所需要的taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg
2
中的一种或多种。
14.所述试剂或试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
15.本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦谷蛋白大聚体含量的方法，所述方法包括以下步骤：
16.a1)以待鉴定小麦基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；
17.a2)根据所述pcr产物来鉴定小麦谷蛋白大聚体含量。
18.上述方法中，根据所述pcr产物来鉴定小麦谷蛋白大聚体含量为：所述pcr产物含有所述分子标记hau-taigc-7b的所述待鉴定小麦的谷蛋白大聚体含量高于所述pcr产物不含有所述分子标记hau-taigc-7b的所述待鉴定小麦。
19.上述方法中，所述pcr扩增的反应体系为15μl，其组分为1μl 100ng/μl基因组dna，0.3μl 10ng/μl上游引物f，0.3μl 10ng/μl下游引物r，7.5μl 2
×
taq mix(诺唯赞，南京)和5.9μl ddh2o。
20.上述方法中，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，循环35次；72℃延伸10min。
21.本发明还提供了所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定小麦谷蛋白大聚体含量中的应用。
22.本发明还提供了所述分子标记hau-taigc-7b，和/或，所述引物对，和/或，所述试剂或试剂盒在小麦种质资源分析和鉴定和/或分子辅助遗传育种中的应用。
23.本发明中，所述待鉴定小麦可为纯合自交系。
24.本发明中，所述分子辅助遗传育种包括：以待鉴定小麦基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；选择所述pcr产物含有所述分子标记的所述待鉴定小麦作为亲本进行育种。所述分子辅助遗传育种的目的可包括培育谷蛋白大聚体含量高的小麦。扩增所述分子标记hau-taigc-7b的引物对也在本发明的保护范围内。
25.本发明在前期初定位的基础上，利用周麦24和郑麦366重组自交系和近等基因系材料对影响小麦不溶性谷蛋白含量(igc)的位点taigc-7b进行了精细定位。将taigc-7b定位于0.3cm的遗传区间，对应于中国春参考基因组约500kb的物理范围。
26.根据该位点在双亲周麦24和郑麦366中序列的indel开发了共显性标记，通过近等基因系(nil)验证显示其与目标区间共分离。通过对90份am2和120份am3自然群体进行基因型检测发现，含有周麦24(hap1)等位变异的小麦材料，其ig含量显著地高于含有郑麦366(hap2)等位变异的材料，该位点的变异与小麦籽粒谷蛋白大聚体的含量显著关联。本发明所述分子标记为indel分子标记。
27.实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
28.(1)本发明的indel分子标记准确性高、稳定性好，检测简单便捷，经济高效，不需要酶切等复杂步骤；本发明的indel分子标记的多态性直接以dna的形式表现，在小麦的各个组织及各个发育阶段均可检测到，可以在小麦的苗期筛选，加快了小麦选择育种进程。
29.(2)本发明的indel分子标记引物对，具有特异性强、扩增dna片段单一的特点，检测方便，扩增产物可用琼脂糖凝胶进行鉴定，减少小麦品质早期表型品质指标测试鉴定的
工作量，在苗期就可鉴定出谷蛋白大聚体含量高的单株以淘汰非目标植株，节约育种成本，提高品种品质改良的选择效率。
30.(3)本发明分子标记是根据indel开发的共显性标记，可以减少分子标记辅助选择时的连锁累赘，具有重大的应用价值。
附图说明
31.图1为taigc-7b位点的精细定位及不同基因型近等基因系的籽粒igc表现。
32.图2为分子标记hau-taigc-7b引物对pcr扩增后的电泳结果。
33.图3为基于taigc-7b位点分子标记hau-taigc-7b的自然群体关联分析。其中图3中a为在am2群体中的关联分析，图3中b为在am3群体中的关联分析。
34.图4自然群体单倍型分析的差异显著性分析。其中图4中a为在am2群体中的差异显著性分析，图4中b为在am3群体中的差异显著性分析。
具体实施方式
35.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
37.采用spss 22统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准差表示，采用one-way anova检验，p＜0.05表示与对照相比具有显著性差异。
38.下述实施例中，不溶性谷蛋白(ig)的提取参照前人的方法(sapirstein h,fu b.intercultivar variation in the quantity of monomeric proteins,soluble and insoluble glutenin,and residue protein in wheat flour and relationships to breadmaking quality.cereal chemistry.1998,75:500-507.)有一定的改进，具体步骤如下：
39.1)称取100mg面粉于2ml离心管中，记录其质量，加入1.5ml 50％正丙醇(v/v)，于室温振荡提取1h.
40.2)15000g离心3min,弃上清。
41.3)向沉淀中加入1.5ml 50％正丙醇(v/v)，含1％dtt(v/v)，用曲别针将沉淀搅拌使其悬浮，并振荡混匀，60℃水浴2h，间歇振荡。
42.4)15000g离心5min,将上清取入一新的1.5ml离心管，混匀后，取5μl用于2-d quart kit(ge)定量。
43.不溶性谷蛋白定量用2-d quart kit(ge healthcare life science,piscataway,usa)试剂盒，具体步骤如下：
44.1)将比色剂a与比色剂b按100:1的比例混合配成工作比色剂，每次测定每个样品需加1ml工作比色剂。
45.2)用2mg/ml的bsa标准溶液制备并绘制标准曲线。
[0046][0047]
3)准备好盛有5μl样品的离心管(5ul/样品)，检测范围为0.5-50μg，设重复。
[0048]
4)加入500μl沉淀剂，简单振荡后室温放置2-3min。
[0049]
5)加入500μl辅助沉淀剂，略微振荡混匀，12000g离心7min。
[0050]
6)离心完毕后尽快取出，弃去上清，接着下一步，避免沉淀分散或再次悬浮。
[0051]
7)再次离心，12000g离心6min，弃上清，此时应没有可见的液体成分残留。
[0052]
8)每管中加入100μl铜溶液和400μl去离子水，振荡溶解沉淀的蛋白质，应彻底振荡混匀，确保沉淀完全溶解。
[0053]
9)每管中加入1ml工作比色剂，确保以最快的速度加入并混匀，室温放置(孵育)15-20min。
[0054]
10)用分光光度计(thermo electron corporation,massachusetts,usa)测定标准溶液及样品在480nm波长的吸收峰(以去离子水作对照)。
[0055]
11)用excel绘制标准曲线，计算出样品的蛋白浓度。
[0056]
实施例1谷蛋白大聚体含量主效基因位点taigc7b的精细定位
[0057]
为了对taigc-7b位点进行精细定位，本发明利用taigc-7b侧翼分子标记对f
11
重组个体进行基因型检测，最终分别获得了28种1bl.1rs背景(命名为1rs-nil11-1到1rs-nil11-28)和24种非1bl.1rs背景(命名为1bs-nil11-1到1bs-nil11-24)的纯合重组单株，并繁殖成家系。通过对f
12
代株系进行igc表型测定，获得了不同重组类型的表型值。单倍型分析结果表明，在北京和赵县两个环境中均存在含有周麦24基因型等位基因的nils其igc要显著高于含有郑麦366基因型等位基因的nils(图1)。通过对1bl.1rs背景和非1bl.1rs背景的f
12
近等基因系进行表型评价，最终将候选基因锁定到标记cas53和cas97之间(图1)，对应的遗传距离为0.3cm，对应于中国春(iwgsc refseq v1.0)约500kb(680,161,809-684,469,410)的物理范围。
[0058]
实施例2谷蛋白大聚体含量主效基因位点taigc7b分子标记的开发
[0059]
通过对双亲(周麦24和郑麦366)该位点区间内的序列进行测序比对，发现双亲间存在85bp的插入缺失(周麦24较郑麦366多85bp)，因此根据该处的indel开发了共显性标记，即与谷蛋白大聚体含量相关的分子标记hau-taigc-7b。
[0060]
本发明开发的与谷蛋白大聚体含量相关的indel分子标记hau-taigc-7b的核苷酸序列如seq id no.1所示(由85个核苷酸组成)。
[0061]
根据得到的indel分子标记(seq id no.1)设计特异性扩增所述分子标记的引物，所设计的引物序列为：
[0062]
上游引物f：5
’‑
gggaacaggagagtgaagatcg-3’；(seq id no.2)
[0063]
下游引物r：5
’‑
tcaatttaccagcacgtaggatct-3’(seq id no.3)。
[0064]
实施例3与谷蛋白大聚体含量相关的indel分子标记的应用
[0065]
本实施例利用开发的indel分子标记hau-taigc-7b(seq id no.1)进行小麦谷蛋白大聚体含量的鉴定。具体方法如下：
[0066]
1、供试材料
[0067]
本发明所用的自然群体为20世纪80年代以来黄淮及北方冬麦区主栽小麦品种、骨干育种亲本、最新育成品种及高代品系构成的am2群体(90份，表1)和am3群体(120份，表2)，这两个群体可以用于分析不同glu-d1d位点和1bl/1rs易位系对igc的影响。
[0068]
2、小麦材料基因组dna的提取
[0069]
对这两个群体(am2群体和am3群体)的小麦材料叶片进行基因组dna的提取。具体步骤如下：
[0070]
1)在65℃预热ctab提取液。
[0071]
2)将叶片置于放有钢珠的2ml离心管中，在液氮中磨碎叶片。
[0072]
3)加入700μl预热的提取液，剧烈震荡，立即放回65℃水浴。孵育1h。
[0073]
4)加入等体积的氯仿-异戊醇，摇床上摇10min，12000rpm，离心10min。
[0074]
5)取上清至一新的1.5ml离心管中，加入0.7体积预冷的异丙醇，100μl醋酸钠(ph5.2)，混匀，-20℃放置30min。
[0075]
6)12000rpm，离心10min。弃去上清，用70％酒精清洗沉淀1次。
[0076]
7)弃去酒精，在空气中晾干沉淀，加入适量灭菌水溶解沉淀。
[0077]
3、pcr扩增
[0078]
以步骤2提取的基因组dna为模板，利用实施例2中设计的引物对(上游引物f和下游引物r)在不同的小麦材料中对分子标记hau-taigc-7b进行pcr扩增，得到pcr产物；
[0079]
pcr扩增引物如下：
[0080]
上游引物f：5
’‑
gggaacaggagagtgaagatcg-3’；(seq id no.2)
[0081]
下游引物r：5
’‑
tcaatttaccagcacgtaggatct-3’(seq id no.3)。
[0082]
pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，循环35次；72℃延伸10min。
[0083]
pcr扩增体系为15l，其组分为：1l 100ng/l基因组dna，0.3l 10ng/l上游引物f，0.3l 10ng/l下游引物r，7.5l 2
×
taq mix(诺唯赞，南京)和5.9l ddh2o。引物对hau-taigc-7b的扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行分离，电压150v，电泳15min，利用凝胶成像系统记录结果。
[0084]
4、自然群体谷蛋白大聚体含量主效基因位点taigc7b的单倍型鉴定
[0085]
通过对90份am2和120份am3自然群体进行单倍型检测发现，在am2群体中，有33个材料是周麦24(hap1)单倍型，57个为郑麦366(hap2)单倍型；在am3群体中，有37个为周麦24(hap1)单倍型，83个为郑麦366(hap2)单倍型，部分电泳图如图2所示，所有小麦的pcr产物均为一个条带，所有hap1单倍型的小麦的pcr产物均为一个大小为257bp的条带(含有本发明所述indel分子标记hau-taigc-7b)，所有hap2单倍型的小麦的pcr产物均为一个大小在171bp的条带(不含有本发明所述indel分子标记hau-taigc-7b)。通过对不同背景(glu-d1d，1bl/1rs)进行单倍型分析发现，含有周麦24(hap1)等位变异的小麦材料，其ig含量显著地高于含有郑麦366(hap2)等位变异的材料(图3)。
[0086]
5、利用本发明所述的分子标记hau-taigc-7b(seq id no.1)鉴定小麦谷蛋白大聚体含量
[0087]
根据pcr产物来鉴定小麦谷蛋白大聚体含量。鉴定方法为：pcr产物含有分子标记
hau-taigc-7b(seq id no.1的dna分子)的待鉴定小麦的谷蛋白大聚体含量高于pcr产物不含有分子标记hau-taigc-7b(seq id no.1的dna分子)的待鉴定小麦。
[0088]
鉴定结果如表1和表2所示，hap1单倍型的小麦材料均含有分子标记hau-taigc-7b(seq id no.1的dna分子)；hap2单倍型的小麦材料均不含有分子标记hau-taigc-7b(seq id no.1的dna分子)。igc表示不溶性谷蛋白(insoluble glutenin，ig)含量，是鉴定或辅助鉴定小麦谷蛋白大聚体含量的指标。差异显著性分析结果如图4所示。
[0089]
综上，本技术的indel分子标记可以准确鉴定小麦谷蛋白大聚体含量。
[0090]
表1 am2群体中分子标记hau-taigc-7b的单倍型结果
[0091]
[0092]
[0093][0094]
备注：“ ”表示存在；
“‑”
表示不存在；hap1表示周麦24单倍型，hap2表示郑麦366单倍型；
[0095]
表2 am3群体中分子标记hau-taigc-7b的单倍型结果
[0096]
[0097]
[0098]
[0099][0100]
备注：“ ”表示存在；
“‑”
表示不存在；hap1表示周麦24单倍型，hap2表示郑麦366单倍型；
[0101]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。