一种检测miRNA的CDA探针引物组、试剂盒及其应用

一种检测mirna的cda探针引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测mirna的cda探针引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.微小核糖核酸(micrornas或mirnas)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小rna，其在细胞内具有多种重要的调节作用。其复杂的调节网络系统表现在既可以通过一个microrna来调控多个基因的表达，也可以通过几个micrornas的组合来精细调控某个基因的表达。学术研究已经证明，人类已知癌症的发生发展与microrna的表达失调有着直接联系。
3.最常用的microrna检测方法是northernblot，也被认为是microrna检测和确认的金标准。该方法是经典的探针杂交检测法，特异性和灵敏度不高。现有基于rt-pcr的microrna商业检测试剂盒主要为基于polya加尾和颈环结构介导等的信号转换技术，这些试剂盒在目前的应用中操作繁琐、通量较低。
4.现在，对microrna检测新技术的研究主要基于恒温扩增、核酸酶、纳米技术、量子点的等信号放大方法。其中，环介导恒温扩增(lamp)反应作为特异性和灵敏度均非常高的恒温扩增反应，研究者亦探索了其在microrna检测方面的应用。基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(closed dumbbell mediated isothermal amplification of nucleic acids，cda)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法，可替代日本lamp核酸扩增方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如pcr等)相比，cda反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。


技术实现要素：

5.本发明的目的是，提供一种检测mirna的cda探针引物组、试剂盒及其应用。旨在解决现有技术中mirna检测操作复杂，灵敏度不高的技术问题。
6.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
7.一种非疾病诊断目的的检测mirna的cda探针引物组，该探针引物组包括：探针1、探针2、引物mf、引物mr；探针1从3’到5’端分别由r1c区和t1区组成，探针2从3’到5’端分别由t2区、m区和f1区组成，引物mf由f1区和m1c区组成，引物mr由r1区和m2区组成；其中t1区与待测mirna的部分序列互补，t2区与待测mirna的另一部分序列互补，t1和t2两部分与完整的待测mirna序列互补；所述m区包括m1区和m2区，m1区与m1c区互补，m2区与m2c区互补，r1区与r1c区互补，f1区与f1c区互补；所述探针1的5’端被磷酸化修饰。所述f1区、m区、r1区其具体序列可为设计的任意序列，各区长度约为20bp左右。
8.参见图1，为探针1和探针2通过mirna合成cda反应模板的示意图。
9.本发明还提供一种检测mirna的试剂盒，该试剂盒包括所述的cda探针引物组。
10.作为优选实施方案，所述试剂盒包括核酸链连接反应液和cda扩增反应液，其中核酸链连接反应液包括核酸链连接酶、反应缓冲液、探针1、探针2；所述cda扩增反应液包括引物mf和引物mr、bst聚合酶、cda反应缓冲液、超纯水。
11.作为优选实施方案，所述核酸链连接反应液的组成为：
12.3-7u t4 rna连接酶2
13.1x t4 rna连接酶2反应缓冲液
14.100-2000nm探针1
15.100-2000nm探针2。
16.作为优选实施方案，所述cda反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和triton x-100。
17.作为优选实施方案，所述cda扩增反应液还包括显色剂，所述显色剂选自sybr green i、eva green、羟基萘酚蓝、铬黑t中的一种。
18.作为优选实施方案，所述cda扩增反应液的组成为：
19.2-50mm tris-hcl ph8.8
20.2-20mm kcl
21.2-20mm(nh4)2so422.2～20mm mgso423.0.1～0.5％tritonx-100
24.0.2～1m甜菜碱
25.1～1.6mm dntp
26.5～10u bst dna聚合酶
27.100～150μmol/l显色剂
28.1～2μm引物mf
29.1～2μm引物mr；
30.反应溶剂为超纯水。
31.本发明还提供所述试剂盒非疾病诊断目的的检测mirna的方法，包括以下步骤：
32.步骤1，将核酸链连接酶和反应缓冲液、探针1、探针2混合，制得核酸链连接反应液；制得的核酸链连接反应液于35-38℃反应50-70min。
33.步骤2，将步骤1反应完毕的核酸链连接反应液与cda扩增反应液混合，于60～65℃反应20～80min，根据扩增结果判断样品中是否含有mirna。
34.参见图2，为引物mf和引物mr通过cda反应模板介导核酸扩增反应的示意图。
35.本发明还提供所述的cda探针引物组在非疾病诊断目的的mirna检测中的应用。
36.本发明还提供所述的试剂盒在非疾病诊断目的的mirna检测中的应用。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
38.1，本发明通过巧妙的构思设计了2个探针，样本中的mirna能够介导两个探针发生连接反应，连接后的探针序列可作为cda反应模板，进一步通过设计的cda引物引发核酸扩增反应。当样本中存在目标mirna时，则通过介导核酸链连接反应产生核酸扩增产物；当样本中不存在目标mirna时，则两个探针不会发生连接反应，从而无法进行核酸扩增反应。因
此，通过对核酸扩增产物进行监控，即可确定样本中是否存在目标mirna。
39.2，cda核酸扩增方法可以缩短操作时间，提高检测效率，降低样品污染的机率。cda的初始扩增模板区间小(最小约为60bp)，此利于核酸链连接和链延伸反应克服空间位阻和提高分子碰撞几率，从而实现microrna信号的高效转换。
附图说明
40.图1为探针1和探针2通过mirna合成cda反应模板的示意图。
41.图2为引物mf和引物mr通过cda反应模板介导核酸扩增反应的示意图。
42.图3为本发明实施例2中合成的cda反应模板产物的凝胶电泳图。
43.图4为本发明实施例3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
具体实施方式
44.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
45.实施例1应用核酸链连接反应提供cda反应模板
46.以let7a为目标mirna验证由mirna介导合成cda反应模板。
47.反应液组成：
48.5u t4 rna连接酶2
49.1x t4 rna连接酶2反应缓冲液
50.探针：
51.200nm探针1(序列如seq id no.l所示)
52.200nm探针2(序列如seq id no.2所示)
53.靶:let7a(序列如seq id no.3所示)
54.同时设置无靶的对照组。
55.上述反应液放置于水浴锅中，设置反应温度恒定为37℃，反应时间为60min。
56.探针1：5’磷酸化ctactacctca
‑‑
ggacaattggcatggttc-3’57.探针2：5’gttgaatgcccctaattacc-aactatacaacctactacctca
‑‑
aactatacaac-3’58.let7a：ugagguaguagguuguauaguu
59.探针1和2的划线部分分别和let7a的序列互补配对，探针1的5’端需进行磷酸化修饰。
60.实施例2通过凝胶电泳证实合成的cda反应模板
61.实施例1产物的证实：将1μl常规核酸电泳上样缓冲液(takara dna ladder附赠)加到5μl实施例1中终止反应后的反应液中，样品于90mv在gelred预染的(biotum)1％琼脂糖凝胶(tae溶解)电泳1小时。结果参见图3，方框处为得到的目标核酸，下面的两条序列为探针1和2，图3结果说明：实施例1的核酸链接反应成功合成了含mirna序列的cda反应模板。
62.实施例3应用cda验证对含mirna的cda反应模板的扩增
63.通过引物mf和引物mr进行cda扩增反应的反应溶液的组合如下面所示。
64.反应溶液组合如下，其余加入ddh2o至25μl
65.20mm tris-hcl ph8.8
66.10mm kcl
67.10mm(nh4)2so468.14mm mgso469.0.1％triton x-100
70.1m甜菜碱
71.1.25mm dntp
72.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
[0073]1×
eva green
[0074]
引物：
[0075]
1600nm c-mf(序列如seq id no.4所示)
[0076]
1600nm n1-mr(序列如seq id no.5所示)
[0077]
seq id no.4：gttgtatagtt—gttgaatgcccctaattacc
[0078]
seq id no.5：ctactacctca—gaaccatgccaattgtcc
[0079]
靶核酸：实施例1中反应液中合成的cda反应模板。
[0080]
实施例1中无靶的对照组(即探针1和2没有发生核酸链接反应的组)作为阴性对照组。
[0081]
设置abi real time pcr反应温度恒定为61℃，反应时间为70min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图4所示。图4结果说明：本发明方法能够适用于样本中目标mirna的检测，通过对核酸扩增反应产物的检测即可确定样本中是否含有目标mirna。
[0082]
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。