一种检测支原体的LAMP引物和试剂盒的制作方法

一种检测支原体的lamp引物和试剂盒
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种检测支原体的lamp引物和试剂盒。


背景技术：

2.动物细胞的培养，支原体污染是个严重的问题。支原体(mycoplasma)是细胞外生存的最小微生物。是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。细胞培养过程中容易污染的支原体主要是猪鼻支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、人型支原体、口腔支原体、唾液支原体、梨支原体、无胆甾支原体等，约占污染细胞的支原体99％左右。
3.支原体缺乏细胞壁，对青霉素类抗生素不敏感，但有具有革兰氏阳性细菌的部分特点，因而对链霉素敏感性也十分有限。支原体在人工培养过程中，培养液除了ph发生变化外，基本上能保持澄清透明，只在培养后期活菌滴度达到峰值时才会出现轻度混浊。这些特点也为支原体污染细胞和病毒培养物而不容被发现提供了良好支持。在细胞培养和病毒的细胞繁殖中，最为常见的污染就是支原体污染，细胞培养液中常用加入双抗(青霉素和链霉素)抑制细菌污染，但对支原体的作用十分有限。
4.目前支原体检测方法主要包括微生物培养、生化检测、elisa、直接或间接荧光染色、免疫荧光和核酸扩增技术[直接或巢式聚合酶链反应(pcr)]。不幸的是，常规的诊断程序通常很耗时(即需要几个星期才能得到结果)，需要高水平的技术技能和专家人员。因此，需要快速和敏感的检测方法来评估假定被污染的细胞培养物。在这方面，基于分子生物学方法开发的较新的测试系统，特别是pcr，可以在4.5-24小时内得到结果，被细胞培养实验室普遍采用。然而，pcr和电泳过程所需的复杂程序和相对昂贵的机器限制了其使用。因此，开发简单、敏感、特异、快速和低成本的检测方法是至关重要的。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测支原体的lamp引物和试剂盒，采用本发明提供的lamp引物50min得到检测结果，灵敏度达到10-2
ng/ul。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007]
本发明提供了一种检测支原体的lamp引物，所述lamp引物包括内引物、外引物和环引物；
[0008]
所述内引物包括1-fip和1-bip，所述1-fip的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述1-bip的核苷酸序列如seq id no.2所示；
[0009]
所述外引物包括1-f3和1-b3，所述1-f3的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述1-b3的核苷酸序列如seq id no.4所示；
[0010]
所述环引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0011]
优选的，所述支原体包括猪鼻支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、人型支原体、口腔支原体、唾液支原体、梨支原体、无胆甾支原体、无乳支原体、牛支原体、上颌支原体、关节炎支原体和肺支原体中的一种或多种。
[0012]
优选的，所述lamp引物检测支原体时，反应的条件包括：反应温度为62min，反应时间为50min。
[0013]
优选的，所述述lamp引物检测支原体时，反应的体系包括：2.5ul 10
×
thermopol buffer、1.5ul 100mm的mgso4、3.5ul浓度为10mm的dntp、4ul 1-fip、4ul 1-bip、0.5ul 1-f3、0.5ul 1-b3、2ul环引物、1ul bst dna polymerase large fragment、1.5ul羟基萘酚蓝溶液、2ul模板dna和2ul超纯水。
[0014]
优选的，所述反应的体系中1-fip和1-bip的终浓度分别为1.6um，所述1-f3和1-b3的终浓度分别为0.2um，所述环引物的终浓度为0.8um。
[0015]
优选的，所述羟基萘酚蓝溶液的终浓度为12mm。
[0016]
优选的，所述mgso4的终浓度为6mm，所述bst dnapolymerase large fragment的终浓度为320u/ml，所述dntp mix的终浓度为1.4mm，所述模板dna的终浓度为1ng/ul。
[0017]
优选的，使用lamp引物扩增后的产物为淡蓝色，扩增出200～250bp的条带，结果为阳性。
[0018]
本发明还提供了一种检测支原体的试剂盒，包括：上述技术方案所述的lamp引物、羟基萘酚蓝溶液、mgso4、bst dna polymerase large fragment、dntp mix和阳性对照。
[0019]
优选的，所述阳性对照包括人型支原体。
[0020]
本发明的有益效果：
[0021]
将支原体稀释到10-2
ng/ul能扩增出梯形条带，50min即可得到结果。
附图说明
[0022]
图1-1为检测验证1号引物对的电泳结果图中：泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0023]
图1-2为检测验证1号引物对的电泳结果图中：泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0024]
图1-3为检测验证1号引物对的电泳结果图中：泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0025]
图2为实施例2特异性检测结果；
[0026]
图3-1为反应温度优化中60℃扩增结果，泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、
12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0027]
图3-2为反应温度优化中61℃扩增结果，泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0028]
图3-3为反应温度优化中62℃扩增结果，泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0029]
图4-1为反应时间优化中50min扩增结果，泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0030]
图4-2为反应时间优化中60min扩增结果，泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0031]
图4-3为反应时间优化中70min扩增结果，泳道1～13，1号为猪鼻支原体、2号为发酵支原体、3号为精氨酸支原体、4号为人型支原体、5号为口腔支原体、6号为唾液支原体、7号为梨支原体、8号为无胆甾支原体、9号为无乳支原体、10号为牛支原体、11号为上颌支原体、12号为关节炎支原体、13号为肺支原体，阴性为阴性对照不加任何支原体；
[0032]
图5-1为指示剂浓度优化中10mm扩增结果，其中4号和7号支原体与阴性14号相似，没有变紫色，不能区分；
[0033]
图5-2为指示剂浓度优化中12mm扩增结果；
[0034]
图5-3为指示剂浓度优化中15mm扩增结果，其中5号和11号变色也不明显；
[0035]
图6-1为试剂盒验证的lamp反应电泳图；
[0036]
图6-2为试剂盒验证的lamp反应直观观察颜色变化图；
[0037]
图7为实施例4的电泳结果图，其中1-5分别为maker，阴性，10-4ng/ul，10-3ng/ul，10-2ng/u l，10-1ng/u l。
具体实施方式
[0038]
本发明提供了一种检测支原体的lamp引物，所述lamp引物包括内引物、外引物和环引物；所述内引物包括1-fip和1-bip，所述1-fip的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述1-bip的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述外引物包括1-f3和1-b3，所述1-f3的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述1-b3的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述环引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0039]
在本发明中，所述lamp引物的核苷酸序列具体如下：
[0040]
外引物1-f3(seq id no.3)：5
’‑
gctagtacggatacgcatga-3’；
[0041]
外引物1-b3(seq id no.4)：5
’‑
tcgcctttattgttcttcc-3’；
large fragment的终浓度优选为320u/ml，所述dntp mix的终浓度优选为1.4mm，所述模板dna的终浓度优选为1ng/ul。
[0051]
在本发明中，使用lamp引物扩增后的产物为淡蓝色，扩增出200～250bp的条带，结果为阳性。
[0052]
本发明还提供了一种检测支原体的试剂盒，包括：上述技术方案所述的lamp引物、羟基萘酚蓝溶液、mgso4、bst dnapolymerase large fragment、dntp mix和阳性对照。在本发明中，所述阳性对照优选包括人型支原体。在本发明中，所述试剂盒中还优选包括蒸馏水。
[0053]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0054]
实施例1
[0055]
使用ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载各种支原体(猪鼻支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、人型支原体、口腔支原体、唾液支原体、梨支原体、无胆甾支原体、无乳支原体、牛支原体、上颌支原体、关节炎支原体和肺支原体)的16s rrna序列，再使用snapgene软件对支原体的13条序列进行比对。根据序列比对结果，选取共同保守序列(seq id no.6)设计引物，共设计3对支原体检测候选引物；
[0056]
具体如下：
[0057]
1号引物、
[0058]
外引物1-f3(seq id no.3)：5
’‑
gctagtacggatacgcatga-3’；
[0059]
外引物1-b3(seq id no.4)：5
’‑
tcgcctttattgttcttcc-3’；
[0060]
内引物1-fip(seq id no.1)：
[0061]5’‑
gccgtcgacgatttacgccc-cagccgcggtaagtaatagg-3’；
[0062]
内引物1-bip(seq id no.2)：
[0063]5’‑
ctcaaccatcgcgctttgga-ttcaccgctacgggtggaat-3’；
[0064]
环引物loop(seq id no.5)：5
’‑
attccggataacgcttgcg-3’。
[0065]
2号引物、
[0066]
2-f3(seq id no.7):gcgaggctaactatgtgcc；
[0067]
2-b3(seq id no.8):tcgcctttggtgttcttcc；
[0068]
2-fip(seq id no.9):
[0069]
gcctacgacgctttacgccc-cagccgcggtaatacatagg；
[0070]
2-bip(seq id no.10):
[0071]
3-ctcaaccctggcgctttgga-ttcaccgcttcacatggaat；
[0072]
环引物：5
’‑
attccggataacgcttgcg-3’。
[0073]
3号引物、
[0074]
3-f3(seq id no.11):gccgcggtaatacataggtt；
[0075]
3-b3(seq id no.12):ttcgtccctcagtgtcagt；
[0076]
3-fip(seq id no.13):
[0077]
tccaaagcgccagggttgag-tattgggcgtaaagcgttcg；
[0078]
4-bip(seq id no.14):
[0079]
5-agcggaattccttgtgaagcgg-gccttcgccattgatgttct；
[0080]
环引物：5
’‑
attccggataacgcttgcg-3’。
[0081]
引物设计的筛选认证
[0082]
分别取猪鼻支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、人型支原体、口腔支原体、唾液支原体、梨支原体、无胆甾支原体、无乳支原体、牛支原体、上颌支原体、关节炎支原体和肺支原体这13种培养物的dna，分别使用以上3对引物，进行lamp扩增，扩增体系如表1所示。
[0083]
表1扩增体系
[0084]
序号组分添加量终浓度110
×
thermopol buffer2.5μl1
×
2mgso4(100mm)1.5μl6mm3dntp mix(10mm)3.5μl1.4mm41-fip primers4μl1.6um51-bip primers4μl1.6um61-f3 primers0.5μl0.2um71-b3 primers0.5μl0.2um8loop2μl0.8um9bst dna polymerase large fragment1μl320u/ml10hnb1.5ul12mm10模板dna2μl1ng/ul11超纯水2ul [0085]
反应条件为61℃，1小时，再对lamp产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观察电泳结果。
[0086]
根据试验结果，阴性不出现扩增，其它都出现扩增的为特异性条带，确定1号引物作为最优引物，结果如图1-1，其它两组引物结果如图1-2和图1-3。
[0087]
实施例2
[0088]
支原体lamp检测方法的特异性
[0089]
1、特异性检测分别采用最优的引物，对常培养的一些细胞(nk细胞、cik细胞、脐带间充质干细胞、a549细胞)等4种培养物以及不加支原体的阴性对照组，同时加上人型支原体作为阳性对照进行lamp检测。直接取细胞培养的上清液，使用引物1-fip/1-bip/1-f3/1-b3/loop，进行lamp检测。反应条件为：60℃，1小时，根据颜色变化观察结果。结果发现引物1-fip/1-bip/1-f3/1-b3/loop在上述反应条件下，只有阳性对照电泳结果出现扩增条带，阴性不出现扩增。结果如图2。
[0090]
反应温度的优化
[0091]
取以上13种支原体阳性对照按照实施例1的方法进行反应，反应温度分别使用60℃、61℃、62℃反应1h。结果显示62℃lamp产物的特异性更加明显。结果如图3-1至图3-3。
[0092]
反应时间的优化
[0093]
取以上13种支原体阳性对照按照实施例1的方法进行反应，反应时间分别为50min、60min、70min。结果显示50min产物的特异性更加明显。结果如图4-1至图4-3。
[0094]
指示剂的确定
[0095]
取hnb10mm、12mm、15mm，按照25ul加入1ul该指示剂，如果发生lamp扩增，反应液的颜色将由反应前的淡紫色变成淡蓝色。结果显示hnb 12mm的变色反应更加明显。结果如图5-1至图5-3。
[0096]
实施例3
[0097]
试剂盒组装与验证
[0098]
检测试剂盒包括：lamp反应试剂、特异性引物、阳性对照、指示剂等。试剂盒组装内容包括：(1)lamp反应试剂，包括bst dna polymerase large fragment、mgso4、dntp mix、10
×
thermopol buffer等；(2)引物，由内引物1-fip/1-bip按4μl等量混合后，再一并与外引物1-f3/1-b3按0.5μl等量混合和环引物loop按2μl等量混合配制，内引物终浓度为1.6μm，外引物终浓度为0.2μm，环引物终浓度为0.8μm；(3)阳性对照(4)指示剂(5)超纯水。
[0099]
对组装好的试剂盒进行扩大范围应用，包括13种支原体(包括猪鼻支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、人型支原体、口腔支原体、唾液支原体、梨支原体、无胆甾支原体、无乳支原体、牛支原体、上颌支原体、关节炎支原体和肺支原体)，使用以上试剂盒进行支原体检测，阴性对照为不加任何支原体。
[0100]
对2种健康细胞nk细胞和脐带间充质干细胞，同时以人型支原体作为阳性对照，以纯化水作为阴性对照，使用以上试剂盒进行检测。反应体系见表1，反应条件：62℃，50min，再经1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观察电泳结果。
[0101]
阳性对照可以扩增出200bp～250bp大小特异性条带，同时变为淡蓝色，而对健康细胞检测结果为阴性，没有条带扩增，同时颜色为淡紫色，结果如图6-1至图6-2。
[0102]
实施例4
[0103]
最低检测限和引物灵敏度
[0104]
对精氨酸支原体培养物进行10倍倍比稀释4个浓度(分别为10-1
,10-2
,10-3
,10-4
)，使用1号引物进行敏感性检测。
[0105]
反应条件为：62℃、50min后，再对pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观察电泳结果(见图7)。
[0106]
结果表明将精氨酸支原体dna稀释到10-2
ng/ul也能扩增出梯形条带。由此可见，使用引物在上述反应条件下，对支原体的检测敏感性良好。
[0107]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。