SARS-CoV-2的N抗原的单克隆抗体、检测方法及其用途与流程

sars-cov-2的n抗原的单克隆抗体、检测方法及其用途
技术领域
1.本发明涉及免疫诊断技术领域，具体涉及通过病毒抗原检测病毒感染， 特别是涉及用于新型冠状病毒(sars-cov-2)感染引起的新冠肺炎 (covid-19)的特异性诊断方法。


背景技术：

2.急性呼吸综合征冠状病毒-2(acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)是引起冠状病毒病-2019(corona virus disease 2019， covid-19)的病原体，并被世界卫生组织(world health organization， who)正式命名。covid-19发病7天内临床表现没有特异性，因此不能 通过临床症状、体征和一般检查诊断该病。而特异、早期、快速、简便、 适合基层使用的诊断方法，是实现“早发现、早隔离、早治疗”的基础，也 是疫情防控的关键、必须技术。
3.临床实践中，covid-19的实验室诊断依赖于核酸检测、抗体检测。 核酸检测总体检出率高，但需要基因扩增，假阴性、假阳性率较高，有时 需要反复检测，可重复性差，样本易被污染，需要pcr扩增仪及凝胶电 泳等专业的仪器设备，对样本处理和检测技术条件要求高，检测耗时长， 需专业技术人员操作和判断检测结果。而抗体检测因为抗体出现晚，不能 早期诊断，抗体检出率低，造成大量漏诊。
4.因此，临床亟需一种更早期、更灵敏、更快捷、更有效的检测新型冠 状病毒covid-19的诊断试剂，进行早期鉴别诊断。而病毒抗原检测，由 于抗原为病毒特有，可实现高特异性诊断；病毒抗原出现早于抗体、早于 临床症状，可实现早期诊断。因此，通过抗原检测诊断covid-19是理想 的方法。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是建立基于针对sars-cov-2的n抗原的抗 体检测sars-cov-2病毒的covid-19诊断方法。为了克服已有技术的缺 陷，本发明提供一种sars-cov-2的n抗原(nucleocapsid protein，也称 为核衣壳蛋白、n蛋白)检测方法：通过制造、筛选针对sars-cov-2的 n抗原的小鼠单克隆抗体，找到具有诊断价值的表位-抗体对，基于上述表 位-抗体对，通过胶体金、荧光素等标记，实现了灵敏度高、特异性强，快 速、简便，适合医院、基层、社区、家庭等多种场所的covid-19筛查和 诊断，高效确诊covid-19。本发明能够促进传染源的早期发现、隔离、 治疗，高效预防疫情扩散。
6.本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
7.第一步制造sars-cov-2的n抗原系列单克隆抗体抗体
8.基于发布的sars-cov-2的n抗原基因序列，克隆n抗原基因，在 大肠杆菌中表达n抗原。将表达sars-cov-2的n抗原的大肠杆菌工程 菌通过发酵技术，获得含有n抗原的原液。将n抗原的原液经过层析技术 分离纯化n抗原，获得纯度95％以上的n抗原10mg，-20摄氏度保存备 用。
9.取用上述n抗原20μg作为免疫原与完全弗氏佐剂混合皮下注射初次 免疫balb/c
小鼠，共20只；分别于7天、14天取上述等量n抗原与非完 全弗氏佐剂混合加强免疫balb/c小鼠。于初次免疫后第28天小鼠眼眶后 取血检测抗n抗原抗体滴度，滴度大于1:160的小鼠脱颈处死、取脾脏， 获得脾细胞单细胞悬液，制备杂交瘤细胞，通过无限稀释法和鉴定获得15 个单克隆抗体细胞株，冻存备用。
10.取上述15个单克隆抗体细胞株，分别注射入小鼠腹腔制备腹水，取腹 水纯化获得单克隆抗体15株。
11.第二步发现具有诊断价值的表位-抗体对
12.基于上述15株单克隆抗体，检测与其它常见冠状病毒n抗原的交叉 反应性，获得sars-cov-2的n抗原特异性(只与sars-cov-2的n抗 原结合而与其它冠状病毒不结合)的单克隆抗体4株分别命名为m1、m2、 m3和m4。
13.采用酵母展示技术，明确上述4株单克隆抗体所结合的表位，获得4 个诊断用表位-抗体对。
14.第三步标记与检测方法建立
15.基于上述发现的4个表位-抗体对，采用胶体金技术、荧光技术标记抗 体，建立sars-cov-2的n抗原检测方法。
16.胶体金标记sars-cov-2的n抗原单克隆抗体m1、m2、m3，制成 胶体金试纸，检测第一步中备用sars-cov-2的n抗原，n抗原30ng以 上均可检出阳性。
17.荧光素标记sars-cov-2的n抗原单克隆抗体m1、m2、m3，制成 荧光素试纸，检测第一步中备用sars-cov-2的n抗原，n抗原10ng以 上均可检出阳性。
18.第四步临床验证
19.以临床疑似covid-19患者为基础，以鼻咽拭子核酸检测为金标准， 用本发明的方法检测鼻咽拭子和尿液样本sars-cov-2的n抗原。
20.本发明中sars-cov-2的n抗原免疫检测方法包括抗体，其中包括标 记有检测信号分子的能特异结合sars-cov-2的n抗原的捕获抗体m1、 m2、m3，能特异结合sars-cov-2的n抗原的检测抗体m4，检测信号 分子可以是胶体金或荧光素或其他本领域常用的标记物。所述捕获抗体组 合是小鼠单克隆抗体m1、m2、m3，比例1:1:1，分别特异性结合 sars-cov-2的n抗原的氨基酸1-69、119-213、212-341的氨基酸序列； 所述检测抗体是m4，其为特异性结合sars-cov-2的n抗原的氨基酸 337-422的氨基酸序列的小鼠单克隆抗体。
21.本发明检测方法中，所述抗体组合m1、m2、m3和单抗m4均是免 疫球蛋白igg，分别由保藏号为gdmcc 61007、gdmcc 61008、gdmcc61009、gdmcc 61010的杂交瘤细胞株所分泌。
22.本发明检测方法中，所述检测信号分子可以是胶体金、荧光素等。当 所述检测信号分子为胶体金时，本检测方法所用检测装置为胶体金试纸条， 所述胶体金试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；其 特征在于，所述结合垫上包被有胶体金标记的m1、m2、m3抗体组合。 当所述检测信号分子为荧光素时，本检测方法所用检测装置为荧光免疫层 析检测试纸条，所述荧光免疫层析检测试纸条包括依次相连的样品垫、结 合垫、反应垫和吸水垫；其特征在于，所述结合垫上包被有铕微球标记的 m1、m2、m3抗体组合。
23.本发明所用的捕获抗体和检测抗体是从15种与sars-cov-2的n抗 原特异性结合的单克隆抗体中筛选出来的。其中，捕获抗体组合m1、m2、 m3和检测抗体m4分别结合n抗原
不同表位，不仅显著提高了用单个抗 体检测的敏感性、特异性、稳定性，减少临床漏检，而且适用于鼻咽拭子、 尿液、血液、痰等不同样本检测。同时，单克隆抗体的使用克服了多克隆 抗血清与其它常见病毒冠状病毒的交叉反应，重复性好、易于标准化。
24.本发明提供一种检测sars-cov-2的n抗原的免疫检测方法，其特征 是用针对n抗原的抗体检测n抗原，所述抗体包括标记有检测信号分子的 能特异结合sars-cov-2的n抗原的捕获抗体m1、m2、m3，检测抗体 m4，任选地，检测信号分子选自胶体金或荧光素。
25.本发明还提供一种捕获抗体，其特征是小鼠单克隆抗体m1、m2、 m3，分别特异性结合sars-cov-2的n抗原的氨基酸1-69、119-213、 212-341的氨基酸序列。
26.本发明还提供一种检测抗体m4，其特征是特异性结合sars-cov-2 的n抗原的氨基酸337-422的氨基酸序列的小鼠单克隆抗体。
27.本发明还提供一种检测sars-cov-2的n抗原胶体金免疫层析装置， 使用胶体金标记的m1、m2、m3单克隆抗体。
28.本发明还提供一种检测sars-cov-2的n抗原荧光免疫层析装置，使 用荧光素标记的m1、m2、m3单克隆抗体。
29.本发明还提供一种免疫检测方法，其特征是该检测方法可以特异性检 测鼻咽拭子、血清、尿液等人体样本中的sars-cov-2的n抗原。
30.本发明还提供一种免疫检测方法，其特征是该检测方法所检测到的 sars-cov-2的n抗原可用于诊断covid-19，与核酸检测诊断方法符合 率99％以上。
31.本发明具有如下有益效果：
32.本发明中，通过精选表位-抗体对，达到对sars-cov-2的n抗原的 特异性检测，实现对covid-19特异性诊断，特异性达99％。
33.本发明中，通过精选表位-抗体对，达到对sars-cov-2的n抗原的 高灵敏度检测，sars-cov-2的n抗原检测灵敏度达ng水平。
34.本发明中，通过精选表位-抗体对对sars-cov-2的n抗原的早期检 测，发热第3天即可在鼻咽拭子样本检出sars-cov-2的n抗原，实现早 期诊断。
35.本发明中，采用胶体金和荧光标记试纸的通用、简便技术，10分钟内 出结果，达到sars-cov-2的n抗原快速检测，实现快速诊断。
36.本发明中，检测方法可靠、简便、适合医疗机构、基层、家庭和个人 使用。为疑似患者、无症状感染者排查和诊断及为早期、快速预防疫情扩 散提供更优手段。
37.生物保藏信息
38.一株杂交瘤细胞m1，其分类学名称为mus musculus hybridoma 1-10： m1，该菌株于2020年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (guangdong microbial culture collection center，gdmcc)，保藏号 为gdmcc 61007，保藏地址：中国广东省广州市越秀区先烈中路100号 大院59号楼广东省微生物研究所，邮政编码：510070。
39.一株杂交瘤细胞m2，其分类学名称为mus musculus hybridoma 11-20： m2，该菌株于2020年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (guangdong microbial culture collection center，gdmcc)，保藏号 为gdmcc 61008，保藏地址：中国广东省广州市越秀区先烈中路100号 大院59号楼广东省微生物研究所，邮政编码：510070。
40.一株杂交瘤细胞m3，其分类学名称为mus musculus hybridoma 21-30： m3，该菌
株于2020年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (guangdong microbial culture collection center，gdmcc)，保藏号 为gdmcc 61009，保藏地址：中国广东省广州市越秀区先烈中路100号 大院59号楼广东省微生物研究所，邮政编码：510070。
41.一株杂交瘤细胞m4，其分类学名称为mus musculus hybridoma 31-40：m4，该菌株于2020年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (guangdong microbial culture collection center，gdmcc)，保藏号 为gdmcc 61010，保藏地址：中国广东省广州市越秀区先烈中路100号 大院59号楼广东省微生物研究所，邮政编码：510070。
具体实施方式
42.本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。
43.免疫原制备
44.本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组sars-cov-2的n抗 原。基因重组n抗原是用一种携带n抗原基因的工程菌株制备的，其制备 方法按照常规方法进行，经用分子筛层析的方法进行纯化获得n抗原，详 细制备方法可参照制备单克隆抗体的使用手册。经蛋白质印迹对纯化n抗 原进行鉴定，与理论分子量相符。
45.免疫小鼠：取4-6周龄雌性balb/c小鼠，第一次采用完全弗氏佐剂 与等体积n抗原免疫共3次，于融合前每只小鼠腹腔注射n抗原100μg 加强免疫。
46.杂交瘤细胞的制备和鉴定：加强免疫3天后，无菌条件下取小鼠脾脏 制备单细胞悬液，与ns-1细胞按10:1融合。经96孔板培养后的上清用 sars-cov的n抗原、sars-cov-2的n抗原双筛选。上清只结合 sars-cov-2的n抗原的克隆被标记上克隆号保存。按常规鉴定杂交瘤细 胞培养上清所含抗体的亚型。其中，确定m1、m2、m3、m4均为igg， 分别为igg2a、igg1、igg3、igg1。
47.单克隆抗体的制备和纯化：通过腹腔注射向小鼠腹腔上述杂交瘤细胞， 不同克隆制备不同克隆的腹水，通过7号注射针头收集腹水。采用辛酸
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硫酸铵沉淀法获得单克隆抗体粗品，进一步用分子筛层析技术获得单克隆 抗体纯品，冻存、备用。
48.单克隆抗体-表位抗体对的优选：采用酵母展示技术在酵母表面展示 sars-cov-2的n抗原不同的氨基酸序列，基于上述制备单克隆抗体，采 用流式细胞术，确定各株单克隆抗体结合的表位序列，其中，结合良好的 m1-[n抗原的氨基酸1-69]、m2-[n抗原的氨基酸119-213]、m3-[n抗原的 氨基酸212-341]的3个表位-抗体对可作为捕获表位-抗体对；结合良好的 m4-[n抗原的氨基酸337-422]表位-抗体对可作为标记表位-抗体对。
[0049]
n抗原检测方法的建立
[0050]
本发明的检测方法，实施方式之一，通过胶体金检测试纸条实现，包 括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述样品垫、结合垫、 反应垫和吸水垫之间相互交叠连接，所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水 垫设于底板上。另提供一种用于稀释待检样品的稀释液。
[0051]
本发明的检测方法，实施方式之二，通过荧光免疫层析试纸条实现， 包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述样品垫、结合垫、 反应垫和吸水垫之间相互交叠连接，所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水 垫设于底板上。另提供一种用于稀释待检样品的稀释液。
[0052]
检测方法的临床考核
[0053]
将本发明的检测方法，在临床疑似covid-19病例，以鼻咽拭子核酸 检测为金标准，用本发明的方法检测鼻咽拭子、尿液和血清样本 sars-cov-2的n抗原，评价该检测方法临床诊断意义。
[0054]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、 设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0055]
如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解 的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
[0056]
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖 非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最 终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由
……
组成”和“基本上 由
……
组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本 文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、 组分、步骤或限制项组成。
[0057]
在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值 或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。涉及相同组分或性质的所有范 围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们 包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本技术引用的任 何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。
[0058]
所述样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液中的至少一 种，更优选地，所述样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、尿液 中的至少两种，将所述样品分别单独进行检测。
[0059]
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体的实施例对上述技术 方案进行详细的说明。以下具体的实施例仅是本发明的优选实施方式，不 是对本发明的限制。
[0060]
实施例
[0061]
实施例1—sars-cov-2的n抗原系列单克隆抗体抗体的制造
[0062]
基于发布的sars-cov-2的n抗原基因序列，克隆n抗原基因，在 大肠杆菌中表达n抗原。将表达sars-cov-2的n抗原的大肠杆菌工程 菌通过发酵技术，获得含有n抗原的原液。将n抗原的原液经过层析技术 分离纯化n抗原，获得纯度95％以上的n抗原10mg，-20℃保存备用。
[0063]
取用上述n抗原20μg作为免疫原与完全弗氏佐剂混合皮下注射初次 免疫balb/c小鼠，共20只；分别于7天、14天取上述等量n抗原与非完 全弗氏佐剂混合加强免疫balb/c小鼠。于初次免疫后第28天小鼠眼眶后 取血检测抗n抗原抗体滴度，滴度大于1:160的小鼠脱颈处死、取脾脏， 获得脾细胞单细胞悬液，制备杂交瘤细胞，通过无限稀释法和鉴定获得15 个单克隆抗体细胞株，冻存备用。
[0064]
取上述15个单克隆抗体细胞株，分别注射入小鼠腹腔制备腹水，取腹 水纯化获得单克隆抗体15株。表1所列为15种抗体单批次生产、鉴定结 果。
[0065]
表1.抗sars-cov-2的n蛋白单克隆抗体的单批次生产、鉴定结果
[0066][0067]
实施例2—抗sars-cov-2的n蛋白单克隆抗体m1-4特异性结合sars-cov-2的n蛋白
[0068]
因为常见冠状病毒n蛋白的氨基酸序列具有80％以上同源性，只有特 异性识别sars-cov-2的n蛋白的单克隆抗体才对sars-cov-2感染具有 诊断价值，而上述单克隆抗体制造方法不能避免获得与其它冠状病毒结合 的抗体。为此，将实施例1获得的15株单克隆抗体进行进一步鉴定，寻找 只特异性结合sars-cov-2的n蛋白的单克隆抗体。
[0069]
以3株无关单克隆抗体(a50、b30和c31，特异结合sars-cov的s 蛋白n末端氨基酸249-667的氨基酸序列)为阴性对照抗体，通过酶联免疫 结合试验(elisa)证明15株单抗均能够结合sars-cov-2的n蛋白； 通过蛋白质印迹证明15株单抗只有11株结合能够结合sars-cov-2的n 蛋白；通过与其它常见冠状病毒的免疫荧光检测，发现只有m1、m2、 m3、m4单抗可特异结合sars-cov-2的n蛋白，其它单抗与其它常见冠 状病毒有交叉反应。结果如表2。
[0070]
表2.单抗筛选结果
[0071][0072]a15株(m1～m15)抗体为实施例1所制造。
[0073]b纯化的重组表达sars-cov-2的n抗原，5μg/ml，每孔100μl，作为包被抗原，与纯化的 抗体反应(稀释1:1000)。读取450nm光密度值(od)。-表示阴性结果； 表示od在0.2至 1； 表示od为1至2； 表示od》2。
[0074]c在pvdf膜上进行重组n抗原与纯化抗体(稀释1:1000)的蛋白质印迹反应。-表示无结合； w表示弱结合； m表示中度结合； s表示强结合。
[0075]d对sars-cov感染的vero e6细胞、人冠状病毒229e感染的mrc-5细胞、人冠状病毒oc43 感染的bs-c-1细胞、sars-cov-2感染的人肾小管上皮细胞进行间接免疫荧光检测。-表示阴 性结果； 表示阳性结果；/表示未检测。
[0076]
实施例3—筛选具有诊断价值的表位抗体对
[0077]
采用酵母展示技术在酵母表面展示sars-cov-2的n抗原不同的氨基 酸序列：氨基酸1-422、1-213、1-120、68-213、1-69、68-120、119-213、 214-422、212-341、337-422，采用基于上述制备单克隆抗体的流式细胞技 术，确定各株单克隆抗体结合的表位序列。
[0078]
结果见下表3。
[0079]
表3. 15株单抗结合的n蛋白表位描图a[0080][0081]a流式细胞仪检测酵母展示的sars-cov-2的n抗原不同氨基酸片段与不同单克隆抗体结合。 结果显示的是流式细胞仪检测到的单抗与表达抗原片段结合的荧光值与单抗与空表达空载 (eby100/pyd1)结合荧光值比值大小，比值大于2为阳性。-：阴性(即比值小于2)； ： 弱阳性(比值为2-5)； ：中度阳性(比值5-10)； ：强阳性(比值大于10)。
[0082]bn抗原氨基酸序列。在eby100酵母细胞表面展示10个覆盖n抗原全长的不同氨基酸序 列片段，以考察不同单抗结合n抗原的哪些氨基酸序列。
[0083]c实施例1所列15株单抗纳入检测。
[0084]
结合实施例2，只有m1～m4具有特异诊断sars-cov-2感染价值， 故选定结合良好的m1-[n抗原的氨基酸1-69]、m2-[n抗原的氨基酸 119-213]、m3-[n抗原的氨基酸212-341]3个表位-抗体对作为捕获表位
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抗体对；结合良好的m4-[n抗原的氨基酸337-422]表位-抗体对作为检测 表位-抗体对。
[0085]
实施例4—最佳抗体组合筛选
[0086]
为提高对sars-cov-2的n抗原的检测敏感性，通过化学发光法和荧 光层析法，检测不同抗体-表位对组合对sars-cov-2的n抗原检测敏感 性的影响。检测敏感性以所能检测到n抗原的最低含量(μg/ml)为标准， 结果见表4。
[0087]
表4.不同抗体组合检测敏感性比较
[0088][0089]
由此获得最佳捕获抗体组合是m1、m2、m3。
[0090]
实施例5—胶体金试纸在疑似患者尿液检测sars-cov-2的n抗原
[0091]
本实施例提供一种检测sars-cov-2的n抗原的胶体金免疫层析装置， n抗原30ng以上均可检出阳性，其特征在于，所述结合垫上包被有胶体 金标记的m1、m2、m3抗体组合。具体而言，所述检测sars-cov-2的 n抗原的胶体金免疫层析装置通过胶体金检测试纸条实现，所述胶体金检 测试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述样品垫、 结合垫、反应垫和吸水垫之间相互交叠连接，所述样品垫、结合垫、反应 垫和吸水垫设于底板上。所述反应垫上沿着样品流动方向依次设有检测线 和质控线，所述检测线上包被有检测抗体m4，所述质控线上包被有羊抗 鼠igg二抗。所述捕获抗体组合是小鼠单克隆抗体m1、m2、m3，比例 1:1:1，分别特异性结合sars-cov-2的n抗原的氨基酸1-69、119-213、 212-341的氨基酸序列；所述检测抗体是m4，其为特异性结合sars-cov-2 的n抗原的氨基酸337-422的氨基酸序列的小鼠单克隆抗体。捕获抗体组 合m1、m2、m3和检测抗体m4分别结合n抗原不同表位，不仅显著提 高了相对于用单个抗体检测的敏感性、特异性、稳定性，减少临床漏检， 而且适用于鼻咽拭子、尿液、血液、痰等不同样本检测。
[0092]
选择临床疑似患者22例，同时取鼻咽拭子和尿液样本，平行用国家批 准核酸检测试剂检测鼻咽拭子(金标准)，用本发明检测技术的胶体金试 纸检测尿液。在21例鼻咽拭子检测阳性患者中，同时尿液检出n抗原15 例，检出率71.4％；1例(4.5％)鼻咽拭子检测阴性患者尿液中检出了n 抗原。结果参见表5。
[0093]
表5.咽拭子核酸检测结果和尿液检测n抗原检测结果
[0094]
病人编号咽拭子核酸检测结果尿液n抗原检测结果1 (24.1) 2 (19.7) 3 (27.6) 4 (24.3) 5 (35.5)-6 (24.5) 7 (22.2) 8 (26.2) 9 (33.1) 10 (33.9) 11 (32.5) 12 (30.4) 13 (32.1) 14 (34.5)-15 (35.4)-16 (33.6)-17 (32.3)-18 (34.6) 19- 20 (31.8) 21 (29.5)
22 (17.1)
[0095]
以上结果表明，核酸检测30分钟出结果，而本发明的n抗原检测10 分钟即可出结果。因此，本发明的n抗原检测是更快速的检测方法。
[0096]
实施例6—荧光层析试纸咽拭子样本临床检测验证
[0097]
本实施例提供一种检测sars-cov-2的n抗原荧光免疫层析装置，n 抗原10ng以上均可检出阳性，其特征在于，所述结合垫上包被有铕微球 标记的m1、m2、m3抗体组合。具体而言，所述检测sars-cov-2的n 抗原荧光免疫层析装置通过荧光免疫层析试纸条实现，所述荧光免疫层析 试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述样品垫、 结合垫、反应垫和吸水垫之间相互交叠连接，所述样品垫、结合垫、反应 垫和吸水垫设于底板上。所述反应垫上沿着样品流动方向依次设有检测线 和质控线，所述检测线上包被有检测抗体m4，所述质控线上包被有兔抗 鼠二抗。所述捕获抗体组合是小鼠单克隆抗体m1、m2、m3，比例1:1:1， 分别特异性结合sars-cov-2的n抗原的氨基酸1-69、119-213、212-341 的氨基酸序列；所述检测抗体是m4，其为特异性结合sars-cov-2的n 抗原的氨基酸337-422的氨基酸序列的小鼠单克隆抗体。捕获抗体组合 m1、m2、m3和检测抗体m4分别结合n抗原不同表位，不仅显著提高 了相对于用单个抗体检测的敏感性、特异性、稳定性，减少临床漏检，而 且适用于鼻咽拭子、尿液、血液、痰等不同样本检测。
[0098]
针对临床疑似患者113例，取鼻咽拭子样本，平行用国家批准核酸检 测试剂检测sars-cov-2核酸和本发明检测技术的荧光层析试纸检测 sars-cov-2的n抗原。
[0099]
表6.大量本临床验证结果*
[0100][0101]
*敏感性98％；特异性100％；准确性99％；
[0102]
阳性预检值100％；阴性预检值49.5％
[0103]
以核酸检测为金标准，则本发明的特异性为100％，阳性预检值100％； 核酸检测90分钟出结果，而本发明的n抗原检测10分钟出结果。因此， 本发明的n抗原检测是更快速的检测方法。
[0104]
实施例7—与抗体和核酸检测对比
[0105]
针对临床疑似患者19例，取鼻咽拭子样本，平行用国家批准核酸检测 试剂检测sars-cov-2核酸和本发明检测技术的荧光层析试纸检测 sars-cov-2的n抗原，对每个患者在取样鼻咽拭子的同一天取样的血清 样本检测抗体。与核酸结果相比：n抗原阳性的样本100％来自于确诊患 者，特异性100％；有发热、肺炎表现的疑似患者，经反复检测，予以排 除的患者，n抗原100％为阴性；血清样本的n抗原检测灵敏度高于鼻咽 拭子样本：血清样本，核酸ct值32.3(低病毒载量血症)，抗原检测也同 样阳性；本批次样本中，发烧3天，鼻咽拭子即可测出n抗原。本实施例 说明本发明的血清和鼻咽拭子样本能够通过本发明的方法检测到n抗原， 本发明的方法是早期诊断方法。
[0106]
表7.荧光标记检测n抗原的样本适用性及与现有方法对比
[0107][0108]
表示阳性，-表示阴性，na表示未检测到。igm抗体阳性表示近期感染，igg抗体阳性 表示感染时间较长或既往感染。抗原结果指的是通过荧光层析试纸检测的结果。检测患者的 鼻咽拭子样本的同时检测了该患者的血清样本，检测患者的血清样本的同时检测了该患者的 鼻咽拭子样本。
[0109]
以上所述实施例仅表达了本发明的一些实施方式，其描述较为具体和 详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替 换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。