一株降低血浆氧化三甲胺和盲肠三甲胺水平的长双歧杆菌及其应用

1.本发明涉及一株降低血浆氧化三甲胺和盲肠三甲胺水平的长双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.心血管疾病是世界范围内致病率和致死率主要的原因，动脉粥样硬化(as)是心血管的病理基础。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，公认的as的始动因素为动脉壁内皮损伤及脂质的沉积；危险因子为高血压，血脂升高，炎症，氧化高胆碱，肥胖，抽烟等。
3.肠道微生物基因组与人体基因组一起，通过与环境因素的相互作用，影响宿主的食物消化和新陈代谢、免疫反应和炎症、神经活动等多种重要的生理功能。肠道菌群及其代谢产物与宿主之间的相互作用，对于维持宿主的健康是必要的。肠道微生态的紊乱与许多疾病相关，包括糖尿病、肥胖症、炎性肠病、神经退行性疾病和肿瘤等。
4.有研究表明，肠道微生物主要通过细菌感染、调节胆固醇和脂质代谢、食物及微生物代谢产物三种途径对动脉粥样硬化产生影响。经膳食-肠道微生物-肝脏-氧化三甲胺(tmao)途径产生的tmao可以促进心血管疾病的发生发展。依赖微生物的三甲胺(tma)/tmao途径被证明与心血管疾病的发病机制相关，是心血管疾病的重要诊断和治疗靶点。益生菌作为膳食补充剂，已被消费者广泛接受。干预肠道菌群代谢，或许可以成为预防和治疗心血管疾病的方法之一。


技术实现要素：

5.本发明提供了一株长双歧杆菌(bifidobacterium longum)ccfm1218，其于2022年1月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmcc no：62194。
6.本发明还提供了一种发酵食品，所述发酵食品为使用长双歧杆菌ccfm1218发酵生产制得，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。
7.在一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
8.本发明还提供长双歧杆菌ccfm1218在制备哺乳动物体内定植益生菌制剂中的应用。
9.在一种实施方式中，所述益生菌制剂中长双歧杆菌ccfm1218的含量≥1
×
109cfu/ml或≥1
×
109cfu/g。
10.本发明还提供长双歧杆菌ccfm1218在制备减少肠应激综合征、肥胖、过敏、神经性疾病、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压的发病风险的药物或缓解肠应激综合征、肥胖、过敏、神经性疾病、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病中至少一种疾病症状的保健品中的应用；所述心血管疾病包括但不限于动脉粥样硬化。
11.在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。
12.在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
13.在一种实施方式中，所述应用包括如下至少一种作用：
14.(1)降低血浆tmao水平；
15.(2)降低盲肠tma的水平；
16.(3)改善高胆碱造成的肠道菌群紊乱。
17.在一种实施方式中，所述改善高胆碱造成的肠道菌群紊乱包括提高有益菌roseburia属的丰度和/或降低有害菌ruminococcaceae ucg-009属的丰度。
18.本发明还提供长双歧杆菌ccfm1218在与药物联合使用时促进药物增效方面的应用。
19.在一种实施方式中，所述药物包括但不限于他汀类药物。
20.本发明的有益效果：本发明提供的长双歧杆菌ccfm1218具有缓解动脉粥样硬化、肠应激综合征、肥胖、过敏、神经性疾病、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压的发病风险等作用，可用于制备食品、保健品或药品，具有非常广泛的应用前景。在高胆碱模型小鼠实验中，服用本发明筛选的长双歧杆菌ccfm1218能够显著降低高胆碱模型小鼠血浆tmao和盲肠tma的水平，能够改善肠道菌群的结构，恢复高胆碱造成的肠道菌群紊乱，提高有益菌roseburia属的丰度，降低有害菌ruminococcaceae ucg-009属的丰度，减少动脉粥样硬化、肠应激综合征、肥胖、过敏、神经性疾病、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压发生的风险。
21.生物材料保藏
22.长双歧杆菌(bifidobacterium longum)ccfm1218，分类命名为bifidobacterium longum，已于2022年1月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmcc no：62194。
附图说明
23.图1是发酵用乳酸菌长双歧杆菌ccfm1218的菌落形态；
24.图2是长双歧杆菌ccfm1218对胆碱饲料饲养的小鼠的血浆tmao的影响；其中****p《0.0001。
25.图3是长双歧杆菌ccfm1218对胆碱饲料饲养的小鼠的盲肠tma的影响；其中***p《0.001，****p《0.0001。
26.图4是长双歧杆菌ccfm1218对胆碱饲料饲养的小鼠的盲肠roseburia属的影响；其中*p《0.05。
27.图5为是长双歧杆菌ccfm1218对胆碱饲料饲养的小鼠的盲肠ruminococcaceae ucg-009属的影响；其中*p《0.05。
28.图6是不同长双歧杆菌对胆碱饲料饲养的小鼠的血浆tmao的影响；其中****p《0.0001。
具体实施方式
29.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
30.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
31.实施例涉及的长双歧杆菌ccfm1218具有以下生物学特性：
32.(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成抱子，不运动的细菌。
33.(2)菌落特征：菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐，微凸起，不透明，表面湿润光滑；
34.(3)生长特性：该菌株的最适生长温度是35-37℃，最适生长ph为6.5，培养20h后进入稳定期；
35.(4)在高胆碱小鼠模型中能够显著降低血浆tmao的水平；
36.(5)在高胆碱小鼠模型中能够显著降低盲肠tma的水平；
37.(6)在高胆碱小鼠模型中能够显著提高roseburia属的丰度，减少肠应激综合征、肥胖、过敏、神经性疾病、ii型糖尿病的风险；
38.(7)在高胆碱小鼠模型中能够显著降低ruminococcaceae ucg-009属的丰度，减少肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压的风险。
39.所述长双歧杆菌ccfm1218的提取方法为：
40.(一)长双歧杆菌的分离筛选：
41.(l)取1g健康人的新鲜粪便。梯度稀释后涂布于mmrs固体培养基，置于厌氧环境下37℃培养72小时；
42.(2)观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化；
43.(3)在mrs液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。
44.(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。
45.(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
46.(二)长双歧杆菌的分子生物学鉴定：
47.(l)单菌基因组抽提：将步骤(二)所筛选得到的乳酸片球菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液lml于1.5ml离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；用lml无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；加入200μl sds裂解液，80℃水浴30min；加入酚-氯仿溶液200μl于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μl；加入400μl冰乙醇或冰异丙醇于200ul上清中，﹣20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；加入500μl70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；60℃烘箱烘干，或者自然晾干；50μl ddh2o重溶沉淀以备pcr；
48.(2)16s rdna pcr：
49.a.细菌16s rdna 50μlpcr反应体系：
50.10
×
taq buffer，5μl；dntp，5μl；27f，0.5μl；1492r，0.5μl；taq酶，0.5μl；模板，
0.5μl；ddh2o，38μl。
51.b.pcr条件：
52.95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30
×
；72℃5min；12℃2min；
53.c.制备1％琼脂糖凝胶，之后将pcr产物与10000
×
loading buffer混合，上样量2μl，120v跑30min，然后进行凝胶成像；
54.d.将得到pcr产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用blast在genebank中进行搜索和相似性比对，鉴定为长双歧杆菌。
55.(3)全基因组测序
56.将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用blast在genbank中进行搜索和相似性比对，测序结果鉴定为属于长双歧杆菌的一种新发现的菌株。菌株-80℃保藏备用。
57.实施例1：长双歧杆菌ccfm1218对模拟胃肠液具有良好的耐受性
58.将冷冻保存的长双歧杆菌ccfm1218接种于mrs培养基中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mrs培养液传代培养2～3次后，取1ml长双歧杆菌ccfm1218的培养液，与9.0ml ph 2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、ph＝2.5的mrs培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用mrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
59.存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。取1ml长双歧杆菌ccfm1218的培养液加入9ml人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、ph＝8.0的mrs培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用mrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表1和表2所示。结果表明，长双歧杆菌ccfm1218对人工胃肠液具有较好的耐受性。
60.表1长双歧杆菌ccfm1218在人工模拟胃液中的耐受性
[0061][0062]
表2长双歧杆菌ccfm1218在人工模拟肠液中的耐受性
[0063][0064]
实施例2：长双歧杆菌ccfm1218用于降低血浆tmao水平
[0065]
取体重18-20g的健康雌性c57bl/6j小鼠24只，适应环境1周，随机分为4组：空白对照组(control)、模型对照组(choline)、长双歧杆菌ccfm1218组(ccfm1218)、长双歧杆菌fjsnt53m9对照组(按照相同方法筛选自江苏省南通市人体粪便的另一株长双歧杆菌fjsnt53m9，菌株报道于：朱如意，杭锋，张灏等.双歧杆菌生物膜形成规律及其表面性质相关性研究[j].食品与发酵工业,2020)。每组小鼠6只，每天每只小鼠灌胃0.2ml菌浓。
[0066]
菌液的制备方法为：将长双歧杆菌ccfm1218和长双歧杆菌fjsnt53m9分别划线接
种至mrs固体培养基中，在37℃条件下培养72h得到单菌落，将制备得到的单菌落分别接种至mrs液体培养基中，在37℃条件下培养24h进行活化；将活化3代后的菌液分别以2％的接种量接种至1l mrs液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用无菌生理盐水(含0.05％-0.1％的l-半胱氨酸盐酸盐)进行清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用30％的甘油进行重悬，获得菌浓数量级不低于1
×
109cfu/ml的菌液。
[0067]
将菌液于-80℃冰箱冻存一周。在进行动物实验前，将冰箱中冻存的菌液取出，将菌液以6 000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用10％脱脂乳重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存一周后的活菌数量。实验结果：初始活菌数分别为2.8
×
109cfu/ml，2.6
×
109cfu/ml，1周后活菌数为2.1
×
109cfu/ml，2.0
×
109cfu/ml数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。
[0068]
实验动物分组及处理方法见表3。
[0069]
表3实验动物分组
[0070][0071]
第2-7周：正常组小鼠喂食普通饲料，其余小鼠喂食胆碱饲料。c57bl/6j小鼠(雌性，7周龄)，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。普通饲料(lad 3001m，胆碱含量为0.1％)和胆碱饲料(lad 3001m，胆碱含量为1.0％)，购自于南通特洛菲饲料科技有限公司。
[0072]
试验结束前，小鼠禁食禁水4h，通过眼眶周围毛细管取血。血液样本4000
×
g、4℃条件下离心15min，取上清，冻存于-80℃冰箱，取20μl血浆样品加入80μl(v：v，1：4)乙腈沉淀血浆样品中的蛋白质，同时加入终浓度为2.0μm的d9-tmao到血浆样品中作为内标。混匀，-80℃静置2h，在4℃条件下12000g 15分钟，吸上清至进样瓶中，保存在-80℃冰箱，通过hplc-ms/ms测定血浆tmao水平。
[0073]
血浆tmao实验结果如图2所示，胆碱饲料组小鼠血浆tmao显著高于对照饲料组，大约比对照组高出5.78倍，与胆碱组小鼠相比，灌胃长双歧杆菌ccfm1218显著降低血浆tmao的水平，与胆碱组小鼠比，灌胃长双歧杆菌ccfm1218小鼠的血浆tmao降低了30.89％，而灌胃对照菌fjsnt53m9小鼠的血浆tmao只降低了0.04％。
[0074]
实施例3：长双歧杆菌ccfm1218用于降低盲肠tma水平
[0075]
c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
[0076]
试验结束时，小鼠禁食禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，取小鼠盲肠，冻存于-80℃冰箱，称取小鼠盲肠内容物，每mg盲肠内容物加入20μl的混合溶液(乙腈：
甲醇：水以体积比40:40:20混合)，同时加入终浓度为2.5μm的d9-tma到盲肠样品中作为内标，振荡混匀，-80℃静置2h，在4℃条件下12000g15分钟，吸上清至进样瓶中，保存在-80℃冰箱，通过hplc-ms/ms测定小鼠盲肠中tma的含量。
[0077]
盲肠tma实验结果如图3所示，胆碱饲料组小鼠盲肠tma显著高于对照饲料组，大约比对照组高出3.13倍，与胆碱组小鼠相比，灌胃长双歧杆菌ccfm1218显著降低盲肠tma的水平，与胆碱组小鼠比，灌胃长双歧杆菌ccfm1218的小鼠盲肠tma降低了55.18％，而灌胃对照菌fjsnt53m9的小鼠盲肠tma只降低了11.45％。
[0078]
实施例4：长双歧杆菌ccfm1218用于提高盲肠roseburia属的丰度
[0079]
c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
[0080]
试验结束时，小鼠禁食禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，取盲肠，按照粪便dna试剂盒的方法提取盲肠dna，利用二代测序仪对盲肠的v3-v4区进行16s rdna菌群分析。
[0081]
实验结果如图4所示。胆碱饲料组小鼠盲肠roseburia属的相对丰度显著低于对照饲料组，与胆碱组小鼠相比，灌胃长双歧杆菌ccfm1218显著提高roseburia属的相对丰度，并恢复至接近于对照组的水平。
[0082]
实施例5：长双歧杆菌ccfm1218用于降低盲肠ruminococcaceae ucg-009属的丰度
[0083]
c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
[0084]
试验结束时，小鼠禁食禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，取盲肠，按照粪便dna试剂盒的方法提取盲肠dna，利用二代测序仪对盲肠的v3-v4区进行16s rdna菌群分析。
[0085]
实验结果如图5所示。胆碱饲料组小鼠盲肠ruminococcaceae ucg-009属的相对丰度显著高于对照饲料组，与胆碱组小鼠相比，灌胃长双歧杆菌ccfm1218显著降低盲肠ruminococcaceae ucg-009属的相对丰度。
[0086]
实施例6：比较不同长双歧杆菌对胆碱饲料喂养的小鼠的血浆tmao的影响
[0087]
小鼠造模及处理方法同实施例2，分别用16株不同株的长双歧杆菌灌胃胆碱饲料喂养的小鼠，检测血浆tmao，如图6所示，只有ccfm1218具有显著的降低胆碱饲料喂养的小鼠血浆tmao的能力，相比胆碱组下降了30.89％，其它长双歧杆菌均未显著降低胆碱饲料喂养的小鼠血浆的tmao。
[0088]
实施例7：利用本发明长双歧杆菌ccfm1218制造含该菌的发酵食品
[0089]
选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的长双歧杆菌ccfm1218菌剂发酵剂，使其浓度达到108cfu/ml以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明长双歧杆菌ccfm1218活菌的果蔬饮料。
[0090]
利用本发明的长双歧杆菌ccfm1218发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
[0091]
按照实施例2的方法将制备的发酵食品用于饲喂胆碱模型小鼠，结果显示，本实施例制备的发酵食品能够降低血浆tmao-和盲肠tma的水平；能够改善肠道菌群的结构，恢复高胆碱造成的肠道菌群紊乱，提高有益菌roseburia属的丰度，降低有害菌
ruminococcaceae ucg-009属的丰度，减少肠应激综合征、肥胖、过敏、神经性疾病、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、高脂血症、高血压发生的风险。
[0092]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。