靶向迷路蛋白或其部分的构建体以及所述构建体的用途的制作方法

靶向迷路蛋白或其部分的构建体以及所述构建体的用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年1月8日提交的美国临时专利申请号62/789,871的优先权，将其公开内容通过引用以其整体特此并入本文。ascii文本文件序列表的提交
2.将以下提交的ascii文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(crf)(文件名称：185722000240seqlist.txt，记录日期：2020年1月7日，大小：9kb)。
技术领域
3.本技术涉及构建体，所述构建体包含与迷路蛋白(labyrinthin)或其部分特异性结合的抗体部分和效应结构域。还提供了制造和使用这些构建体及其组合物的方法。


背景技术：

4.在历史上，癌症的表征在很大程度上一直基于癌症起源的组织类型或器官，例如肺癌、乳腺癌和结肠癌。许多癌症治疗也基于以组织或器官为基础的癌症分类。众所周知，这样的以组织或器官为基础的癌症分类可能无法为选择有效的治疗提供足够的指导。这部分地由于发现源自单个组织类型或器官的癌症可能是高度异质性的，并且此类差异可能需要个性化的癌症治疗方法。例如，与起源的组织类型或器官相比，通过生物标记物来定义癌症可以允许改善癌症治疗，例如三阴性乳腺癌(其缺乏雌激素受体、孕激素受体和her2/neu的表达)对靶向任何一种或多种已鉴定的受体的传统基于激素的疗法无反应并且需要替代治疗。在基于生物标记物鉴定出癌症亚型之后，需要进行大量研究以开发用于有效治疗这样的癌症亚型的新型药剂。
5.一种这样鉴定出的癌症亚型是表达迷路蛋白的癌症。迷路蛋白是在一些癌症(诸如腺癌)的质膜的细胞外表面上表达的细胞表面蛋白。迷路蛋白的细胞表面表达不是细胞周期特异性的。此外，在正常或荷瘤患者的血清中未发现迷路蛋白，并且迷路蛋白阳性细胞系未将其脱落到培养基中。
6.免疫疗法在人类中一直受到限制，部分地由于对非人单克隆抗体的不良反应。使用啮齿动物抗体的早期临床试验揭示了人抗小鼠抗体(hama)和人抗大鼠抗体(hara)反应，这导致了抗体的快速清除。此后已经开发出免疫原性较低的抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体、抗体和使用转基因小鼠或噬菌体展示文库制备的人抗体。参见例如，morrison等人,proc natl acad sci usa,81,1984；和queen等人,proc natl acad sci usa,86,1989。避免hama反应允许高剂量和重复剂量施用以实现治疗反应。
7.使用噬菌体展示产生mab的最新进展使从大型抗体库中选择具有针对定义的表位的精巧特异性的药剂成为可能。在hla-a01和hla-a02的背景下，许多对实体瘤抗原具有特异性的此类mab已经成功地从噬菌体展示文库中选出(noy等人,expert rev anticancer ther,5,2005；chames等人,proc natl acad sci usa,97,2000；held等人,eur j immunol,
34,2004；lev等人,cancer res,62,2002；klechevsky等人,cancer res,68,2008)。最近，在细胞测定和体内模型中，已经显示对人wt1/hla-a02复合物(详细描述的t细胞表位)具有特异性的人mab经由fc介导的效应细胞功能抑制多种癌细胞系和原代癌细胞(dao等人,sci transl med,5,2013；veomett等人,clin cancer res,2014)。
8.将本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)都通过引用以其整体并入。


技术实现要素：

9.在一方面，本技术提供了分离的抗迷路蛋白构建体，所述构建体包含与迷路蛋白或其部分特异性结合的抗体部分和效应结构域。
10.在一些实施方案中，所述抗体部分与所述效应结构域缀合。在一些实施方案中，所述效应结构域包含效应分子。在一些实施方案中，所述效应分子包含治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂选自药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽和核酸。在一些实施方案中，所述分离的抗迷路蛋白构建体是抗体药物缀合物(adc)。
11.在一些实施方案中，所述效应结构域包含诊断剂。在一些实施方案中，所述诊断剂是标记。
12.在一些实施方案中，所述抗体部分与效应结构域融合。
13.在一些实施方案中，所述分离的抗迷路蛋白构建体是嵌合抗原受体(car)，其包含含有与所述效应结构域融合的所述抗体部分的细胞外结构域，其中所述效应结构域包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
14.在一些实施方案中，所述分离的抗迷路蛋白构建体是双特异性t细胞衔接器(bite)，其包含含有与抗cd3抗体或所述抗体的片段融合的所述抗体部分的细胞外结构域。
15.在一些实施方案中，所述分离的抗迷路蛋白构建体是t细胞受体(tcr)，其包含含有与所述效应结构域融合的所述抗体部分的细胞外结构域，其中所述效应结构域包含tcr亚基的跨膜结构域和/或细胞内信号传导结构域。
16.在一些实施方案中，所述抗体部分是全长抗体、fab、fab'、(fab')2、fv或单链fv(scfv)。在一些实施方案中，所述抗体部分以从约0.1pm至约500nm的kd结合迷路蛋白或其部分。
17.在一些实施方案中，所述抗体部分与包含选自seq id no:2-32的氨基酸序列的迷路蛋白衍生的肽特异性结合。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽包含b细胞和t细胞表位。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽包含b细胞表位。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽包含t细胞表位。
18.在一些实施方案中，所述抗体部分是多特异性的。在一些实施方案中，所述多特异性抗体部分是串联scfv、双抗体(diabody，db)、单链双抗体(scdb)、双亲和重定向(dual-affinity retargeting，dart)抗体、双可变结构域(dual variable domain，dvd)抗体、杵臼结构(knob-into-hole，kih)抗体、对接和锁定(dock and lock，dnl)抗体、化学交联抗体、异多聚抗体或异缀合抗体。在一些实施方案中，所述多特异性抗体部分是包含通过任选的肽接头连接的两个scfv的串联scfv。
19.在另一方面，本技术提供了药物组合物，其包含本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种。
20.在另一方面，本技术提供了宿主细胞，其表达本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种。
21.在另一方面，本技术提供了核酸，其编码本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种的多肽组分。
22.在另一方面，本技术提供了效应细胞，其包含本文所述的核酸中的任一种。在一些实施方案中，所述效应细胞是t细胞。
23.在另一方面，本技术提供了检测在表面上呈递迷路蛋白或其部分的细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述细胞与分离的抗迷路蛋白构建体接触，其中所述分离的抗迷路蛋白构建体包含含有标记的效应结构域；以及(b)检测所述标记在所述细胞上的存在。
24.在另一方面，本技术提供了治疗患有迷路蛋白阳性疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用：(a)有效量的本文所述的药物组合物中的任一种；或(b)有效量的本文所述的效应细胞中的任一种。在一些实施方案中，将迷路蛋白状态用作选择个体进行治疗的基础。
25.在另一方面，本技术提供了诊断患有迷路蛋白阳性疾病的个体的方法，所述方法包括：(a)向所述个体施用有效量的分离的抗迷路蛋白构建体，其中所述分离的抗迷路蛋白构建体包含含有标记的效应结构域；以及(b)确定所述标记在所述个体体内的水平，其中所述标记的高于阈值水平的水平指示所述个体患有所述迷路蛋白阳性疾病。
26.在另一方面，本技术提供了诊断患有迷路蛋白阳性疾病的个体的方法，所述方法包括：(a)使源自所述个体的样品与本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种接触；以及(b)在所述样品中鉴定与所述分离的抗迷路蛋白构建体结合的一种或多种细胞，从而诊断患有迷路蛋白阳性疾病的个体。
27.在一些实施方案中，所述迷路蛋白阳性疾病是迷路蛋白阳性癌症。在一些实施方案中，所述迷路蛋白阳性癌症是腺癌。
附图说明
28.图1a-1b示出了mca 44-3a6小鼠单克隆igg抗体(图1a)和x373 scfv衍生物(图1b)的时间与结合反应测量的关系。
29.图2示出了使用x509fab的来自a549肺腺癌细胞(阳性对照)和wi38成纤维细胞(阴性对照)的裂解物的蛋白质免疫印迹。
具体实施方式
30.在一些方面，本技术提供了包含与迷路蛋白或其部分特异性结合的抗体部分和效应结构域的分离的构建体(称为“抗迷路蛋白构建体”或“抗lab构建体”)。还提供了制造和使用这些构建体及其组合物的方法。
31.本技术部分地基于以下发现，即特定癌症(诸如腺癌)选择性表达细胞表面迷路蛋白，并且迷路蛋白阳性癌症不使迷路蛋白脱落。此外，正常的非癌性癌症不表达细胞表面迷路蛋白。因此，迷路蛋白代表定义迷路蛋白阳性癌症的有用标记物和基于免疫疗法的治疗的靶标。
32.因此，在一些实施方案中，本技术提供了分离的抗迷路蛋白构建体，所述构建体包
含与迷路蛋白或其部分特异性结合的抗体部分和效应结构域。
33.在一些实施方案中，所述分离的抗迷路蛋白构建体是嵌合抗原受体(car)，其包含含有与所述效应结构域融合的所述抗体部分的细胞外结构域，其中所述效应结构域包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
34.在一些实施方案中，所述分离的抗迷路蛋白构建体是双特异性t细胞衔接器(bite)，其包含含有与抗cd3抗体或所述抗体的片段融合的所述抗体部分的细胞外结构域。
35.在一些实施方案中，所述分离的抗迷路蛋白构建体是t细胞受体(tcr)，其包含含有与所述效应结构域融合的所述抗体部分的细胞外结构域，其中所述效应结构域包含tcr亚基的跨膜结构域和/或细胞内信号传导结构域。
36.在一些实施方案中，本技术提供了包含本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种的药物组合物。
37.在一些实施方案中，本技术提供了表达本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种的宿主细胞。
38.在一些实施方案中，本技术提供了编码本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种的多肽组分的核酸。
39.在一些实施方案中，本技术提供了包含本文所述的核酸中的任一种的效应细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞是t细胞。
40.在一些实施方案中，本技术提供了检测在表面上呈递迷路蛋白或其部分的细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述细胞与分离的抗迷路蛋白构建体接触，其中所述分离的抗迷路蛋白构建体包含含有标记的效应结构域；以及(b)检测所述标记在所述细胞上的存在。
41.在一些实施方案中，本技术提供了治疗患有迷路蛋白阳性疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用：(a)有效量的本文所述的药物组合物中的任一种；或(b)有效量的本文所述的效应细胞中的任一种。
42.在一些实施方案中，本技术提供了诊断患有迷路蛋白阳性疾病的个体的方法，所述方法包括：(a)向所述个体施用有效量的分离的抗迷路蛋白构建体，其中所述分离的抗迷路蛋白构建体包含含有标记的效应结构域；以及(b)确定所述标记在所述个体体内的水平，其中所述标记的高于阈值水平的水平指示所述个体患有所述迷路蛋白阳性疾病。
43.在一些实施方案中，本技术提供了诊断患有迷路蛋白阳性疾病的个体的方法，所述方法包括：(a)使源自所述个体的样品与本文所述的分离的抗迷路蛋白构建体中的任一种接触；以及(b)在所述样品中鉴定与所述分离的抗迷路蛋白构建体结合的一种或多种细胞，从而诊断患有迷路蛋白阳性疾病的个体。
44.本领域技术人员还应理解，在不脱离本公开文本的范围的情况下，可以对本文所述的实施方式的形式和细节进行改变。此外，尽管已经参考各种实施方式描述了各种优势、方面和目的，但是本公开文本的范围不应通过参考此类优势、方面和目的来限制。定义
45.术语“抗体部分”包括全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两种链中的可变区通常含有三个高度可变的环，称为互补决定区(cdr)(轻链(lc)cdr，包括lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3；重链(hc)cdr，包括hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可以通过kabat、
chothia或al-lazikani(al-lazikani 1997；chothia 1985；chothia 1987；chothia 1989；kabat 1987；kabat 1991)的惯例来定义或鉴定。重链或轻链的三个cdr插入称为框架区(fr)的侧翼延伸之间，所述框架区比cdr更高度保守并且形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但是展现出各种效应子功能。将抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列分类。抗体的五个主要的类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，它们的特征分别在于α、δ、ε、γ和μ重链的存在。将几个主要的抗体类别分为亚类，诸如lgg1(γ1重链)、lgg2(γ2重链)、lgg3(γ3重链)、lgg4(γ4重链)、lga1(α1重链)或lga2(α2重链)。
46.如本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个cdr的抗体部分形成的多特异性抗体、驼源化单结构域抗体、纳米抗体(nanobody)、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但是不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scfv)所结合的相同抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合片段可以包含移植到来自一种或多种不同人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个cdr。
47.如本文所用的术语“表位”是指抗体或抗体部分所结合的抗原上的特定原子或氨基酸组。如果两种抗体或抗体部分展现出对某种抗原的竞争性结合，则它们可以结合所述抗原内的相同表位。
48.如本文所用，当第一抗体部分将第二抗体部分的靶迷路蛋白结合抑制至少约50％(诸如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一个)(在存在等摩尔浓度的第一抗体部分的情况下)时，则所述第一抗体部分与所述第二抗体部分“竞争”结合靶迷路蛋白，或反之亦然。基于其交叉竞争来“分箱(binning)”抗体的高通量方法描述于pct公开号wo 03/48731中。
49.如本文所用，术语“特异性结合”或“对
……
具有特异性”是指可测量且可再现的相互作用，诸如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其决定在存在包括生物分子在内的分子的异质群体的情况下靶标的存在。例如，与靶标(其可以是表位)特异性结合的抗体或抗体部分是以比它结合其他靶标更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合此靶标的抗体或抗体部分。在一些实施方案中，与抗原特异性结合的抗体或抗体部分以它对其他靶标的结合亲和力的至少约10倍的结合亲和力与所述抗原(例如，迷路蛋白或其部分)的一个或多个抗原决定簇反应。
50.如本文所用的“分离的”抗迷路蛋白构建体是指这样的抗迷路蛋白构建体，其(1)不与在自然界中发现的蛋白质缔合，(2)不含来自相同来源的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。
51.如本文所用的术语“分离的核酸”旨在意指基因组、cdna或合成来源或其某种组合的核酸，根据其来源，所述“分离的核酸”(1)不与在自然界中发现所述“分离的核酸”所在的多核苷酸的全部或一部分缔合，(2)可操作地连接至在自然界中其并不连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。
52.如本文所用，术语“cdr”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链两种多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定的区域已经通过kabat等人,j.biol.chem.252:
6609-6616(1977)；kabat等人,u.s.dept.of health and human services,“sequences of proteins of immunological interest”(1991)；chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)；和maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996)描述，其中所述定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指抗体或移植的抗体或其变体的cdr旨在在如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖如通过每个以上引用的参考文献所定义的cdr的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。表1：cdr定义1残基编号遵循kabat等人,同上的命名法2残基编号遵循chothia等人,同上的命名法3残基编号遵循maccallum等人,同上的命名法
53.术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述一条或多条链的其余部分与源自另一种物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展现出本发明的生物活性即可(参见美国专利号4,816,567；和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。
54.关于抗体或抗体部分的术语“半合成”意指抗体或抗体部分具有一个或多个天然存在的序列和一个或多个非天然存在的(即，合成的)序列。
[0055]“fv”是含有完整抗原识别位点和结合位点的最小抗体片段。此片段由处于紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(各自来自重链和轻链的3个环)，其贡献氨基酸残基用于抗原结合并且向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的cdr的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，但是其亲和力低于完整的结合位点。
[0056]“单链fv”(也缩写为“sfv”或“scfv”)是包含连接成单条多肽链的vh和vl抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，scfv多肽进一步包含vh与vl结构域之间的多肽接头，其使得scfv能够形成抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，参见pluckthun的the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编辑,springer-verlag,new york,第269-315页(1994)。
[0057]
术语“双抗体”是指通过以下方式制备的小抗体片段：构建通常具有vh与vl结构域之间的短接头(诸如约5至约10个残基)的scfv片段(参见前段)，使得实现v结构域的链间而
非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”scfv片段的异二聚体，其中两种抗体的vh和vl结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更全面地描述于例如ep 404,097；wo 93/11161；和hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)中。
[0058]“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体是含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(hvr)的残基被来自具有所需抗体特异性、亲和力和能力的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的那些高变环对应，并且全部或基本上全部的fr是人免疫球蛋白序列的那些fr。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见jones等人,nature 321:522-525(1986)；riechmann等人,nature 332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。
[0059]
术语“fc受体”或“fcr”用于描述与抗体的fc区结合的受体。在一些实施方案中，本发明的fcr是结合igg抗体的fcr(γ受体)，并且包括fcγri、fcγrii和fcγriii亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“激活受体”)和fcγriib(“抑制受体”)，所述受体具有主要在其胞质结构域方面不同的类似氨基酸序列。激活受体fcγriia在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。抑制受体fcγriib在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)(参见综述m.inannu.rev.immunol.15:203-234(1997))。所述术语包括同种异型，诸如fcγriiia同种异型：fcγriiia-phe158、fcγriiia-val158、fcγriia-r131和/或fcγriia-h131。fcr综述于ravetch和kinet,annu.rev.immunol 9:457-92(1991)；capel等人,immunomethods4:25-34(1994)；和de haas等人,j.lab.clin.med.126:330-41(1995)中。本文的术语“fcr”涵盖其他fcr，包括将来要鉴定的那些fcr。所述术语还包括新生儿受体fcrn，所述受体负责将母体igg转移至胎儿(guyer等人,j.immunol.117:587(1976)和kim等人,j.immunol.24:249(1994))。
[0060]
术语“fcrn”是指新生儿fc受体(fcrn)。fcrn在结构上与主要组织相容性复合物(mhc)类似，并且由与β2-微球蛋白非共价结合的α链组成。新生儿fc受体fcrn的多种功能综述于ghetie和ward(2000)annu.rev.immunol.18,739-766中。fcrn在免疫球蛋白igg从母亲向幼儿的被动递送以及血清igg水平的调节中起作用。fcrn可以充当挽救受体，从而在细胞内和细胞间结合和运输呈完整形式的胞吞的igg，并且从默认的降解途径中拯救它们。
[0061]
人igg fc区的“ch1结构域”(也称为“h1”结构域的“c1”)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(eu编号系统)。
[0062]“铰链区”通常被定义为人igg1的从glu216延伸至pro230(burton,molec.immunol.22:161-206(1985))。可以通过将形成重链间s-s键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同的位置而将其他igg同种型的铰链区与igg1序列对齐。
[0063]
人igg fc区的“ch2结构域”(也称为“h2”结构域的“c2”)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。ch2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。而是两条n-连接的支链碳水化合物链插入完整天然igg分子的两个ch2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并且有助于稳定ch2结构域。burton,molec immunol.22:161-206(1985)。
[0064]“ch3结构域”(也称为“c2”或“h3”结构域)包含fc区中ch2结构域c末端的残基延伸(即从抗体序列的约氨基酸残基341至c末端(通常在igg的氨基酸残基446或447处))。
[0065]“功能性fc片段”具有天然序列fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括c1q结合；补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如b细胞受体；bcr)等。此类效应子功能通常需要fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用本领域已知的各种测定来评估。
[0066]
具有变体igg fc的具有“改变的”fcr结合亲和力或adcc活性的抗体是与亲本多肽相比或与包含天然序列fc区的多肽相比具有增强的或减弱的fcr结合活性(例如，fcγr或fcrn)和/或adcc活性的抗体。与fcr“展现出增加的结合”的变体fc以比亲本多肽或天然序列igg fc更高的亲和力(例如，更低的表观kd或ic
50
值)结合至少一种fcr。根据一些实施方案，与亲本多肽相比的结合改善是约3倍，诸如约5、10、25、50、60、100、150、200或高达500倍中的任一个，或约25％至1000％的结合改善。与fcr“展现出降低的结合”的多肽变体以比亲本多肽更低的亲和力(例如，更高的表观kd或更高的ic
50
值)结合至少一种fcr。与亲本多肽相比的结合降低可以是约40％或更多的结合降低。
[0067]“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指这样的细胞毒性形式，其中与某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的fc受体(fcr)结合的分泌ig使得这些细胞毒性效应细胞能够与携带抗原的靶细胞特异性结合，随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是这样的杀伤绝对必需的。介导adcc的原代细胞nk细胞仅表达fcγriii，然而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达总结于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-92(1991)的第464页的表3中。为了评估目的分子的adcc活性，可以进行体外adcc测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337所述的体外adcc测定。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，诸如clynes等人pnas(usa)95:652-656(1998)中公开的动物模型中)评估目的分子的adcc活性。
[0068]
与具有野生型igg fc的多肽或亲本多肽相比“展现出增加的adcc”或在存在人效应细胞的情况下更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的包含变体fc区的多肽是这样的多肽，其当在测定中具有变体fc区的多肽和具有野生型fc区的多肽(或亲本多肽)的量基本上相同时在体外或体内实质上更有效地介导adcc。通常，此类变体将使用本领域已知的任何体外adcc测定来鉴定，所述测定是诸如用于例如在动物模型中确定adcc活性的测定或方法等。在一些实施方案中，所述变体在介导adcc方面的效率是野生型fc(或亲本多肽)的从约5倍至约100倍，例如从约25至约50倍。
[0069]“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在存在补体的情况下靶细胞的裂解。经典补
体途径的激活通过补体系统的第一组分(c1q)与结合其同源抗原的(适当亚类的)抗体的结合来启动。为了评估补体激活，可以进行cdc测定，例如如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods202:163(1996)中所述。具有改变的fc区氨基酸序列和增加或降低的c1q结合能力的多肽变体描述于美国专利号6,194,551b1和wo 99/51642中。将那些专利公开案的内容通过引用明确地并入本文。还参见，idusogie等人j.immunol.164:4178-4184(2000)。
[0070]
除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列还可以包括内含子，至编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有一个或多个内含子的程度。
[0071]
术语“可操作地连接”是指调节序列与异源核酸序列之间的功能连接，从而导致后者的表达。例如，当第一核酸序列被放置地与第二核酸序列有功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框内。
[0072]“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的两者中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个dna分子中的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，则所述分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是由这两个序列具有的匹配或同源位置的数量除以比较的位置的数量乘以100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则这两个序列是60％同源的。举例来说，dna序列attgcc和tatggc具有50％同源性。通常，当将两个序列比对以给出最大同源性时，进行比较。
[0073]
如本文所用，术语“基本上同源”是指本文公开的序列与参考序列相比的序列相似性，其中所述序列与参考或其部分具有至少约85％相似性(例如，同源性)，诸如至少约86％相似性、87％相似性、88％相似性、89％相似性、90％相似性、91％相似性、92％相似性、93％相似性、94％相似性、95％相似性、96％相似性、97％相似性、98％相似性、99％相似性或100％相似性中的任一个。用于确定序列相似性的方法是本领域已知的，例如如pearson,w.r.,curr protoc bioinformatics,2013中所述。
[0074]
当在本文中使用时，术语“标记”是指可以直接或间接与抗迷路蛋白抗体部分缀合的可检测化合物或组合物。标记可以是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化底物化合物或组合物的化学改变，所述化学改变是可检测的。
[0075]
如本文所用，“治疗”(“treatment”或“treating”)是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓和由疾病引起的一种或多种症状，减小疾病的程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的传播(例如，转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分的或全部的)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病的进展，提高或改善生活质量，增加增重和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果(例如像肿瘤体积)。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
[0076]
术语“复发”(“recurrence”、“relapse”或“relapsed”)是指在疾病消失的临床评估之后癌症或疾病的返回。远处转移或局部复发的诊断可以被视为复发。
[0077]
术语“难治性”或“耐药性”是指对治疗尚无反应的癌症或疾病。
[0078]
如本文关于t细胞所用的“激活”是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的t细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。
[0079]
如本文所用，术语“有效量”是指化合物或组合物的足以治疗特定障碍、病症或疾病(诸如改善、缓解、减轻和/或延迟所述障碍、病症或疾病的一种或多种症状)的量。关于癌症，有效量包含足以例如引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(诸如抑制肿瘤生长)或者预防或延迟癌症中其他不想要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟癌症发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟复发的量。可以将有效量在一次或多次施用中施用。在癌症的情况下，药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)抑制、延缓、减缓到一定程度，优选地阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(例如，减缓到一定程度，优选地阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)将与癌症相关的一种或多种症状缓解到一定程度。
[0080]
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上可相容的”意指不是生物学上或其他方面非期望的材料，例如，所述材料可以掺入施用给患者的药物组合物中而不引起任何显著的非期望的生物作用或以有害方式与其所处组合物的其他组分中的任一种相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选地满足毒理学和制造测试的要求标准，和/或包括在美国食品和药物管理局起草的无活性成分指南(inactive ingredient guide)中。
[0081]
如本文所用，“延迟”癌症的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推延疾病的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。正如本领域普通技术人员所清楚的，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体没有患上疾病。“延迟”癌症发展的方法是与不使用所述方法相比时，在给定时间范围内减小疾病发展概率和/或在给定时间范围内降低疾病程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用统计学上显著数量的受试者。癌症发展使用标准方法可以是可检测的，所述标准方法包括但不限于计算机轴向断层摄影术(cat扫描)、磁共振成像(mri)、腹部超声、凝血测试、动脉造影术或活组织检查。发展还可以指代癌症进展，癌症进展可能最初无法检测到，并且包括发生、复发和发作。
[0082]
术语“个体”是指哺乳动物，并且包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。
[0083]
如本文所用，术语“基于”(“based on”或“basis for”)包括评估、确定、获得或测量如本文所述的个体或其中的癌症的一个或多个特征，并且在一些实施方案中，选择适合于接受如本文公开的方法中所述的治疗的个体。例如，当将癌症的迷路蛋白状态用作选择用于本文的治疗方法的个体的基础时，评估(或帮助评估)、测量、获得或确定迷路蛋白状态可以被包括在如本文所述的治疗方法中，例如，在治疗之前和/或期间和/或之后测量迷路蛋白状态，并且临床医生将获得的值用于评估以下中的任一项：(a)个体最初接受一种或多种治疗的可能或或许的适用性；(b)个体最初接受一种或多种治疗的可能或或许的不适用性；(c)对治疗的反应；(d)个体继续接受一种或多种治疗的可能或或许的适用性；(e)个体
继续接受一种或多种治疗的可能或或许的不适用性；(f)调整剂量；或(g)预测临床益处的可能性。
[0084]
在一些方面，本文公开的用于与本技术的方法一起使用的一个或多个基础(诸如迷路蛋白状态)可以基于与对照的比较。在一些实施方案中，对照是从文献获得的已知标准(例如，已知的基因序列、rna序列、蛋白质序列、基因表达水平)。在一些实施方案中，对照是从将要或正在使用本文公开的方法治疗的个体获得的对照样品(例如，来自非癌性组织的对照样品)。在一些实施方案中，对照是从将要或正在使用本文公开的方法治疗的个体以外的个体获得的对照样品(例如，来自健康志愿者或未患癌症的志愿者的对照样品)。在一些实施方案中，对照获自给定的患者群体。例如，关于基因表达水平或酶活性水平，对照水平可以是患者群体的该基因的中值表达水平或该酶的中值酶活性水平。并且，例如，如果确定单个患者的目的基因的表达水平高于患者群体的中值表达水平，则确定该患者具有目的基因的高表达。可替代地，如果确定单个患者的目的基因的表达水平低于患者群体的中值表达水平，则确定该患者具有目的基因的低表达。在一些实施方案中，单个患者患有疾病(诸如癌症)，并且患者群体不患有所述疾病。在一些实施方案中，单个患者和患者群体患有相同组织学类型的疾病。在测量的个体数量方面，群体可以是约或可替代地至少约以下中的任一个：2、5、10、15、20、25、30、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、300、400、500。优选地，测量足够数量的个体以提供统计学上显著的群体，这可以通过本领域已知的方法确定。在一些实施方案中，群体是参与临床试验的一组。
[0085]
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“含有”和“包括”以及其他类似形式及其语法等效语旨在在含义上是等效的，并且是开放式结尾的，因为在这些单词中的任何一个后面的一个或多个项目并不意在是此类一个或多个项目的详尽列表，或者意在仅限于列出的一个或多个项目。例如，“包含”组分a、b和c的物品可以由(即，仅含有)组分a、b和c组成，或者可以不仅含有组分a、b和c，而且还可以含有一种或多种其他组分。因此，意图是并且应理解的是，“包含”及其类似形式及其语法等效语包括“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”的实施方案的公开。
[0086]
在提供值范围的情況下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的任何其他所陈述的或中间值涵盖在本公开文本内，受限于在所陈述的范围内的任何具体排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些被包括的任一个或两个限值的范围也被包括在本公开文本中。
[0087]
本文对“约”某个值或参数的提及包括(并且描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。
[0088]
如本文(包括在所附权利要求中)所用，单数形式“一个/一种”、“或”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。抗lab构建体
[0089]
本技术提供了包含与迷路蛋白或其部分特异性结合的抗体部分和效应结构域的抗迷路蛋白构建体(在本文中称为“抗lab构建体”)，诸如分离的抗lab构建体。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述效应结构域缀合。例如，所述效应结构域可以包含效应分子，其可以是治疗剂或标记。在一些实施方案中，所述治疗剂选自药物、毒素、放射性同位素、蛋
白质、肽和核酸。在一些实施方案中，所述效应分子是诊断剂，诸如标记。效应分子的缀合是本领域熟知的，并且可以包括共价缀合(例如，经由化学键或经由接头)或非共价缀合(例如，经由生物素/链霉亲和素和其他蛋白质-蛋白质相互作用对)。
[0090]
在一些实施方案中，所述抗迷路蛋白构建体是融合蛋白。例如，所述抗迷路蛋白抗体部分可以是car(嵌合抗原受体)、工程化tcr或双特异性t细胞衔接器分子的一部分。这些各种构建体在以下部分中更详细地讨论。抗lab car
[0091]
在一方面，本技术提供了包含与迷路蛋白或其部分特异性结合的抗体部分的嵌合抗原受体(car)(在本文中称为“抗lab car”)。还提供了包含含有抗lab抗体部分的car的car效应细胞(例如，t细胞)(在本文中也称为“抗lab car效应细胞”，例如“抗lab car t细胞”)。
[0092]
所述抗lab car包含(a)含有与迷路蛋白特异性结合的抗lab抗体部分的细胞外结构域和(b)细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可以存在于细胞外结构域与细胞内结构域之间。在所述抗lab car的细胞外结构域与跨膜结构域之间，或者在所述抗lab car的细胞内结构域与跨膜结构域之间，可以存在接头或间隔子结构域。所述接头或间隔子结构域可以是任何寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞内结构域。间隔子结构域可以包含多达约300个氨基酸，包括例如约10至约100个或约25至约50个氨基酸。
[0093]
所述跨膜结构域可以源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中特别有用的跨膜区可以源自t细胞受体的α、β、δ或γ链，cd28，cd3ε，cd3ζ，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137或cd154(即，至少包含其一个或多个跨膜区)。在一些实施方案中，所述跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它可以主要包含疏水残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，可以在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，长度例如在约2与约10个之间(诸如约2、3、4、5、6、7、8、9或10个中的任一个)的氨基酸长度的短寡肽或多肽接头可以在所述抗lab car的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间形成连接。在一些实施方案中，所述接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
[0094]
在一些实施方案中，使用与所述抗lab car的细胞内结构域中的序列之一天然缔合的跨膜结构域(例如，如果抗lab car细胞内结构域包含cd28共刺激序列，则所述抗lab car的跨膜结构域源自cd28跨膜结构域)。在一些实施方案中，可以通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0095]
所述抗lab car的细胞内信号传导结构域负责激活其中已经置入抗lab car的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质中转导效应子功能信号并引导细胞执行特化功能的部分。虽然通常可以采用完整的细胞内信号传导结构域，但是在多种情况下不需要使用整条链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以用于代替整条链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语“细胞内信号传导序列”意在包括细胞内信号传导结构域中足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
[0096]
用于本发明的抗lab car的细胞内信号传导结构域的例子包括t细胞受体(tcr)的胞质序列和协同作用以在抗原受体接合后起始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。
[0097]
已知在一些实施方案中，仅通过tcr产生的信号不足以完全激活t细胞，并且还可能需要次级或共刺激信号。因此，在一些实施方案中，t细胞激活可以通过两种不同类别的细胞内信号传导序列来介导：通过tcr起始抗原依赖性初级激活的那些序列(初级信号传导序列)和以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(共刺激信号传导序列)。初级信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式作用的初级信号传导序列可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号传导基序。在一些实施方案中，所述抗lab car构建体包含一个或多个itam。在本发明中特别有用的含有itam的初级信号传导序列的例子包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些初级信号传导序列。
[0098]
在一些实施方案中，所述抗lab car包含源自cd3ζ的初级信号传导序列。例如，所述car的细胞内信号传导结构域可以包含单独的或与可用于本发明的抗lab car的情况下的任何一个或多个其他所需细胞内信号传导序列组合的cd3ζ细胞内信号传导序列。例如，所述抗lab car的细胞内结构域可以包含cd3ζ细胞内信号传导序列和共刺激信号传导序列。所述共刺激信号传导序列可以是共刺激分子的细胞内结构域的一部分，所述共刺激分子包括例如cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体等。
[0099]
在一些实施方案中，所述抗lab car的细胞内信号传导结构域包含cd3ζ的细胞内信号传导序列和cd28的细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，所述抗lab car的细胞内信号传导结构域包含cd3ζ的细胞内信号传导序列和4-1bb的细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，所述抗lab car的细胞内信号传导结构域包含cd3ζ的细胞内信号传导序列以及cd28和4-1bb的细胞内信号传导序列。
[0100]
因此，例如，在一些实施方案中，提供了包含以下的抗lab car：(a)含有与迷路蛋白特异性结合的抗lab抗体部分的细胞外结构域、(b)跨膜结构域和(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域能够激活免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导序列和共刺激信号传导序列。在一些实施方案中，所述初级信号传导序列包含cd3ζ细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导序列包含cd28细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，所述细胞内结构域包含cd3ζ细胞内信号传导序列和cd28细胞内信号传导序列。抗lab tcr
[0101]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分与t细胞受体(tcr)亚基的n末端融合，从而形成抗lab t细胞受体(在本文中称为“抗lab tcr”)。
[0102]
如本文所用的“t细胞受体”或“tcr”是指包含与在mhc分子中结合的特异性抗原肽结合的细胞外抗原结合结构域的内源或重组t细胞受体。在一些实施方案中，所述tcr包含tcrα多肽链和tcrβ多肽链。在一些实施方案中，所述tcr包含tcrγ多肽链和tcrδ多肽链。在
一些实施方案中，所述tcr特异性结合肿瘤抗原。“tcr-t”是指表达重组tcr的t细胞。如本文所用的“tcr复合物”是指tcr和cd3的复合物。本文使用的“tcr亚基”是指tcr复合物的亚基，其包括例如tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、cd3ε、cd3γ、cd3δ和cd3ζ。所述抗lab抗体部分可以与tcr亚基中的任一个的n末端融合。
[0103]
因此，例如，在一些实施方案中，提供了工程化tcr，其包含：(a)与迷路蛋白特异性结合的抗lab抗体部分和(b)tcr亚基。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述tcr亚基的n末端融合。在一些实施方案中，所述tcr亚基选自tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、cd3ε、cd3γ、cd3δ和cd3ζ。抗迷路蛋白双特异性抗体
[0104]
在一些实施方案中，所述抗lab构建体是多特异性抗体。具有不同特异性的抗体或其抗原结合片段还可以化学交联以产生多特异性异缀合抗体。例如，两个f(ab')2分子(各自具有针对不同抗原的特异性)可以化学连接。
[0105]
在一些实施方案中，所述抗体部分是多特异性的。在一些实施方案中，所述多特异性抗体部分是串联scfv、双抗体(db)、单链双抗体(scdb)、双亲和重定向(dart)抗体、双可变结构域(dvd)抗体、杵臼结构(kih)抗体、对接和锁定(dnl)抗体、化学交联抗体、异多聚抗体或异缀合抗体。在一些实施方案中，所述多特异性抗体部分是包含通过任选的肽接头连接的两个scfv的串联scfv。
[0106]
在一些实施方案中，可以使用重组dna技术制备多特异性抗体。例如，双特异性抗体可以通过融合两个scfv(诸如通过肽接头使它们融合)来工程化，从而产生串联scfv。串联scfv的一个例子是双特异性t细胞衔接器。双特异性t细胞衔接器通过将抗cd3 scfv与对靶细胞的表面抗原(诸如肿瘤相关抗原(taa))具有特异性的scfv连接来制造，从而导致t细胞重定向至靶细胞。
[0107]
因此，例如，在一些实施方案中，提供了双特异性t细胞衔接器，其包含：(a)与迷路蛋白特异性结合的抗lab抗体部分和(b)与cd3特异性结合的抗cd3抗体部分。在一些实施方案中，提供了双特异性t细胞衔接器，其包含：(a)与迷路蛋白特异性结合的scfv和b)与cd3特异性结合的scfv。抗lab抗体-药物缀合物(adc)或其他缀合物
[0108]
在一些实施方案中，所述抗lab构建体包含含有附接至效应分子的抗lab抗体部分的免疫缀合物(在本文中也称为“抗lab免疫缀合物”)。在一些实施方案中，所述效应分子是治疗剂(诸如癌症治疗剂)，其具有细胞毒性、细胞抑制性或以其他方式提供某种治疗益处。在一些实施方案中，所述效应分子是标记，其可以直接或间接产生可检测信号。
[0109]
在一些实施方案中，提供了包含抗lab抗体部分和治疗剂的抗lab免疫缀合物(在本文中也称为“抗体-药物缀合物”或“adc”)。在一些实施方案中，所述治疗剂是具有细胞毒性、细胞抑制性或以其他方式防止靶细胞分裂或降低靶细胞分裂的能力的毒素。重要的是，由于大多数正常细胞不会在其表面上呈递lab，因此它们无法结合抗lab免疫缀合物，并且可以免受毒素或其他治疗剂的杀伤作用。
[0110]
用于抗lab免疫缀合物的治疗剂包括例如道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤和长春地辛(参见例如，rowland等人,cancer immunol immunother,21,1986)。用于抗lab免疫缀合物的毒素包括细菌毒素(诸如白喉毒素)、植物毒素(诸如蓖麻毒素)、小分子毒素(诸如格尔德
霉素、美登素类和卡奇霉素(calicheamicin))。所述毒素可以通过包括微管蛋白结合、dna结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性作用。当与大抗体或蛋白质受体配体缀合时，一些细胞毒性药物往往无活性或活性较低。
[0111]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分可以与“受体”(诸如链霉亲和素)缀合以用于肿瘤预靶向，其中向患者施用抗体-受体缀合物，随后使用清理剂从循环中去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，亲和素)。
[0112]
本技术进一步提供了包含附接至效应分子的抗lab抗体部分的抗lab免疫缀合物，其中所述效应分子是标记，其可以间接或直接产生可检测信号。这些抗lab免疫缀合物可以用于研究或诊断应用，诸如用于体内癌症检测。所述标记优选地能够直接或间接产生可检测信号。例如，所述标记可以是不透射线的或放射性同位素，诸如3h、14c、32p、35s、123i、125i、131i；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，所述抗lab免疫缀合物是间接可检测的。例如，对所述抗lab免疫缀合物具有特异性并且含有可检测标记的第二抗体可以用于检测所述抗lab免疫缀合物。
[0113]
因此，例如，在一些实施方案中，提供了抗lab免疫缀合物，其包含：(a)与迷路蛋白特异性结合的抗lab抗体部分；和(b)效应分子。在一些实施方案中，所述效应分子是治疗剂。在一些实施方案中，所述效应分子是标记。抗lab抗体部分
[0114]
在一方面，本技术提供了与迷路蛋白或其部分特异性结合的抗体部分(在本文中称为“抗lab抗体部分”)。所述抗迷路蛋白构建体包含抗lab抗体部分。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分与存在于细胞表面的迷路蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是在实体瘤中，诸如转移性癌细胞。
[0115]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分是抗原结合片段，例如选自以下的抗原结合片段：fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)和单链抗体分子(scfv)。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分是scfv。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分是人的、人源化的或半合成的。
[0116]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分与迷路蛋白衍生的肽或其部分特异性结合。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽包含选自迷路蛋白(seq id no:1；参见表2)的一部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分源自通过使用迷路蛋白衍生的肽作为免疫原产生的抗体。在一些实施方案中，当将所述迷路蛋白衍生的肽用作免疫原时，所述迷路蛋白衍生的肽与载体(诸如白蛋白或klh)缀合。
[0117]
在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽是与迷路蛋白(seq id no:1)的一部分具有至少约60％相似性(诸如至少约65％相似性、70％相似性、75％相似性、80％相似性、85％相似性、90％相似性或95％相似性中的任一个)的序列相似性的肽，其中所述迷路蛋白衍生的肽不包含末端脯氨酸残基，并且其中所述迷路蛋白衍生的肽包含至少一个脯氨酸残基，诸如2、3、4或5个脯氨酸残基。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽是与迷路蛋白(seq id no:1)的一部分具有至少约60％相似性(诸如至少约65％相似性、70％相似性、75％相似性、80％相似性、85％相似性、90％相似性或95％相似性中的任一个)的序列相似性的肽，其中所述迷路蛋白衍生的肽的一个末端不包含末端脯氨酸残基，并且其中所述迷
路蛋白衍生的肽包含至少一个脯氨酸残基，诸如2、3、4或5个脯氨酸残基。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽的长度在7个与50个氨基酸之间，诸如长度在7个与25个氨基酸、长度在7个至13个氨基酸或长度在21个与25个氨基酸之间中的任一个。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽的长度为7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽与迷路蛋白(seq id no:1)的一部分基本上同源。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽与迷路蛋白(seq id no:1)的一部分具有至少约60％相似性(诸如至少约65％相似性、70％相似性、75％相似性、80％相似性、85％相似性、90％相似性或95％相似性中的任一个)的序列相似性。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽或其衍生物与迷路蛋白(seq id no:1)的一部分具有至少约60％相似性的序列相似性，其中所述迷路蛋白衍生的肽的序列的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加到所述迷路蛋白衍生的肽中，并且其中当存在取代、插入和/或添加时，部分被取代、插入和/或添加到所述序列中。在一些实施方案中，被取代、插入或添加的所述部分是天然氨基酸(例如，α-氨基酸或l-氨基酸或d-氨基酸)或非天然氨基酸。在一些实施方案中，被取代、插入或添加的所述部分是氨基酸替代物或接头。在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽包含t细胞表位和/或b细胞表位。
[0118]
在一些实施方案中，所述迷路蛋白衍生的肽包含选自seq id no:2-32(表2)的序列或其变体。在一些实施方案中，包含选自seq id no:2-32(表2)的序列或其变体的所述迷路蛋白衍生的肽包含一个或两个侧翼氨基酸序列，将所述一个或两个侧翼氨基酸序列添加在seq id no:2-32中提供的核心序列的末端。在一些实施方案中，包含一个或两个侧翼氨基酸序列的所述迷路蛋白衍生的肽是与迷路蛋白(seq id no:1)的一部分具有至少约60％相似性(诸如至少约65％相似性、70％相似性、75％相似性、80％相似性、85％相似性、90％相似性或95％相似性中的任一个)的序列相似性的肽。在一些实施方案中，所述侧翼氨基酸序列基于迷路蛋白(seq id no:1)的一部分的序列，并且是所述迷路蛋白序列自seq id no:2-32中提供的每个核心序列(诸如自核心序列的一个或两个末端)的相应延续。例如，对于seq id no:3，在seq id no:3左侧的两个氨基酸的第一侧翼氨基酸序列将是pro-ala，并且在seq id no:3右侧的两个氨基酸的第二侧翼氨基酸序列将是glu-ala。表2.迷路蛋白和迷路蛋白衍生的肽的氨基酸序列。
[0119]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分(或包含所述抗lab抗体部分的抗lab构建体)以在约0.1pm至约500nm之间(诸如约0.1pm、1.0pm、10pm、50pm、100pm、500pm、1nm、10nm、50nm、100nm或500nm中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的kd与迷路蛋白或其部分结合。
[0120]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分(或包含所述抗lab抗体部分的抗lab构建
体)与迷路蛋白或其部分的一个或多个(诸如2个或3个)表位结合。
[0121]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含特定序列或此类序列的某些变体。在一些实施方案中，所述变体序列中的氨基酸取代基本上不降低所述抗lab抗体部分结合迷路蛋白或其部分的能力。例如，可以进行基本上不降低迷路蛋白结合亲和力的改变。还考虑了实质上改善迷路蛋白结合亲和力或影响一些其他特性(诸如特异性和/或与迷路蛋白的相关变体的交叉反应性)的改变。
[0122]
本领域已经公开了抗迷路蛋白抗体，例如美国专利号6,166,176、美国专利号7,635,759和国际公开号wo 2011116014，将其各自的公开内容通过引用以其整体特此并入。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含与迷路蛋白结合的mca44-3a6或其部分。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分是mca44-3a6。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分与结合迷路蛋白的mca44-3a6或其部分竞争。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含来自mca44-3a6的一个或多个cdr。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含与迷路蛋白结合的x373或其部分。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分是x373。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分与结合迷路蛋白的x373或其部分竞争。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含与迷路蛋白结合的x509或其部分。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分是x509。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分与结合迷路蛋白的x509或其部分竞争。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35中所述的可变重链结构域互补决定区(cdr)中的一个或多个。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含seq id no:36、seq id no:37和seq id no:38中所述的可变轻链结构域互补决定区(cdr)中的一个或多个。在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分包含seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35中所述的可变重链结构域互补决定区(cdr)中的一个或多个，以及seq id no:36、seq id no:37和seq id no:38中所述的可变轻链结构域互补决定区(cdr)中的一个或多个。表3.cdr序列。 cdr序列seq id no:33lys-ser-ser-gln-ser-leu-val-tyr-ser-asp-gly-lys-thr-tyr-leu-asnseq id no:34leu-val-ser-lys-leu-asp-serseq id no:35leu-gln-gly-ser-his-phe-pro-arg-thrseq id no:36gly-phe-thr-phe-ser-arg-tyr-thr-met-serseq id no:37tyr-ile-ser-asn-gly-gly-arg-ser-ile-tyr-tyr-ala-asp-ser-val-lys-glyseq id no:38ala-met-asp-asn
核酸和效应细胞
[0123]
本文还提供了编码所述抗lab构建体或抗lab抗体部分的核酸分子。在一些实施方案中，提供了编码全长抗lab抗体的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，提供了编码多特异性抗lab分子(例如，多特异性抗lab抗体、双特异性抗lab抗体或双特异性t细胞衔接器抗lab抗体)或其多肽部分的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，提供了编码抗lab抗体部分的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，提供了编码抗lab免疫缀合物或其多肽部分的核酸(或一组核酸)。
[0124]
本技术还包括这些核酸序列的变体。例如，所述变体包括在至少中等严格的杂交条件下与编码本技术的抗lab构建体或抗lab抗体部分的核酸序列杂交的核苷酸序列。
[0125]
本发明还提供了其中插入了本发明的核酸的载体。
[0126]
简要总结，通过编码抗lab构建体(例如，抗lab car)或其多肽部分的天然或合成核酸进行的所述抗lab构建体或其多肽部分的表达可以通过以下方式来实现：将所述核酸插入适当的表达载体中，使得所述核酸与5'和3'调节元件(包括例如启动子(例如，淋巴细胞特异性启动子)和3'非翻译区(utr))可操作地连接。所述载体可以适用于在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体含有转录和翻译终止子、起始序列以及可用于调节所需核酸序列的表达的启动子。
[0127]
本发明的核酸还可以使用标准基因递送方案而用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本发明提供了基因疗法载体。
[0128]
可以将所述核酸克隆到多种类型的载体中。例如，可以将所述核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
[0129]
此外，所述表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如sambrook等人(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性内切酶位点和一种或多种选择性标记物(参见例如，wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0130]
已经开发出多种基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将所选择的基因插入载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒，并且在体内或离体递送至受试者的细胞。多种逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。多种腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。源自逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在后代细胞中的传播。慢病毒载体比源自癌逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞(诸如肝细胞)。它们还具有低免疫原性的额外优势。
[0131]
另外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加至相距50bp。
[0132]
合适的启动子的一个例子是即刻早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与之可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子是延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、eb病
毒即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。此外，本发明不应局限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，所述分子开关能够在需要这样的表达时开启其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于巯基金属结合蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0133]
为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有选择性标记物基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，所述选择性标记物可以被携带在一片单独的dna上并且用于共转染程序中。选择性标记物和报告基因两者都可以侧接适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
[0134]
使用报告基因鉴定潜在转染的细胞，并且评价调节序列的功能性。通常，报告基因是这样的基因，其在受体生物体或组织中不存在或不表达，并且编码表达表现为一些可容易地检测的特性(例如，酶活性)的多肽。在已经将dna引入受体细胞中之后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，ui-tel等人,febs letters,479,2000)。合适的表达系统是熟知的并且可以使用已知技术来制备或商购获得。通常，具有最小5'侧翼区的显示出报告基因的最高水平表达的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并且用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
[0135]
将基因引入细胞中并使其在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞(例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞)中。例如，所述表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
[0136]
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如，sambrook等人(2001,molecular cloning:alaboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)。在一些实施方案中，通过磷酸钙转染进行多核苷酸向宿主细胞中的引入。
[0137]
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体、尤其是逆转录病毒载体已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人)细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0138]
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊)。
[0139]
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质配制品来将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸可以与脂质相关。与脂质相关的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸两者都相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在
胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、作为胶束或以“塌陷”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，从而可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是可以作为天然存在的或合成的脂质的脂肪物质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类别。
[0140]
不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组dna序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如dna印迹法和rna印迹法、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(elisa和蛋白质印迹法)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。
[0141]
在一些实施方案中，提供了在其表面上呈递本文所述的抗lab构建体的效应细胞(诸如t细胞)。在一些实施方案中，所述效应细胞(诸如t细胞)在其表面上包含本文所述的抗lab car多肽。在一些实施方案中，所述效应细胞包含编码本文所述的抗lab car多肽的核酸，其中由所述核酸表达的所述抗lab car多肽或其部分位于所述效应细胞的表面上。在一些实施方案中，所述效应细胞(诸如t细胞)在其表面上包含本文所述的抗lab tcr多肽。在一些实施方案中，所述效应细胞包含编码本文所述的抗lab tcr多肽的核酸，其中由所述核酸表达的所述抗lab tcr多肽或其部分位于所述效应细胞的表面上。在一些实施方案中，所述效应细胞(诸如t细胞)在其表面上包含本文所述的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)多肽。在一些实施方案中，所述效应细胞包含编码本文所述的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)多肽的核酸，其中由所述核酸表达的所述多特异性抗体(诸如双特异性抗体)多肽或其部分位于所述效应细胞的表面上。
[0142]
可用于本发明的示例性效应细胞包括但不限于树突细胞(包括未成熟的树突细胞和成熟的树突细胞)、t淋巴细胞(诸如幼稚t细胞、效应t细胞、记忆t细胞、细胞毒性t淋巴细胞、t辅助细胞、自然杀伤t细胞、treg细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)和淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞)、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞及其组合。效应细胞的亚群可以通过本领域已知的一种或多种细胞表面标记物(例如，cd3、cd4、cd8、cd19、cd20、cd11c、cd123、cd56、cd34、cd14、cd33等)的存在或不存在来定义。
[0143]
在一些实施方案中，所述效应细胞是工程化效应细胞，诸如工程化哺乳动物效应细胞。在所述药物组合物包含多个工程化哺乳动物效应细胞的情况下，所述工程化哺乳动物效应细胞可以是某种效应细胞类型的特定亚群、某种效应细胞类型的亚群的组合或者两种或更多种效应细胞类型的组合。在一些实施方案中，所述效应细胞存在于同质细胞群体中。在一些实施方案中，所述效应细胞存在于所述效应细胞增强的异质细胞群体中。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞不是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞适用于过继免疫疗法。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是pbmc。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是源自所述pbmc的效应细胞。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是t细胞。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是cd4 t细胞。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是cd8 t细胞。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是b细胞。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞是nk细胞。
[0144]
在一些实施方案中，所述效应细胞是t细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞选自细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制性t细胞。在一些实施方案中，对所述效应细胞进行修饰以阻断或降低所述嵌合受体多肽所源自的内源tcr亚基中的一个或两个的表达。用于破坏基因表达的细胞修饰包括本领域已知的任何此类技术，包括例如rna干扰(例如，sirna、shrna、mirna)、基因编辑(例如，基于crispr或talen的基因敲除)等。制造抗lab抗体部分及其构建体的方法
[0145]
在一方面，本技术提供了制造抗lab抗体部分及其构建体的方法。单克隆抗体
[0146]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分或其构建体包含单克隆抗体。可以例如使用杂交瘤方法(诸如kohler和milstein,nature,256,1975和sergeeva等人,blood,117(16):4262-4272所述的那些方法)、使用本文和以下实施例中所述的噬菌体展示方法或使用重组dna方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。
[0147]
在杂交瘤方法中，通常将仓鼠、小鼠或其他适当的宿主动物用免疫剂进行免疫，以引发产生或能够产生将与所述免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外进行免疫。所述免疫剂可以包括目的蛋白的多肽或融合蛋白或者包含至少两种分子的复合物。通常，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“pbl”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。参见例如，goding,monoclonal antibodies:principles and practice(new york:academic press,1986)。永生化细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以将杂交瘤细胞在合适的培养基中培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt或hprt)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“hat培养基”)，其防止hgprt缺陷型细胞生长。
[0148]
在一些实施方案中，所述永生化细胞系高效地融合，支持所选择的抗体产生细胞中抗体的稳定高水平表达，并且对培养基(诸如hat培养基)敏感。在一些实施方案中，所述永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，其可以例如从加利福尼亚州圣地亚哥的salk institute cell distribution center和弗吉尼亚州马纳萨斯的american type culture collection获得。还已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体。kozbor,j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等人monoclonal antibody production techniques and applications(marcel dekker,inc.:new york,1987)第51-63页。
[0149]
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对所述多肽的单克隆抗体的存在。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定(诸如放射免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa))来确定。此类技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过munson和pollard,anal.biochem.,107:220(1980)的scatchard分析来确定。
[0150]
在鉴定出所需杂交瘤细胞之后，可以将克隆通过有限稀释程序进行亚克隆，并且通过标准方法生长。goding,同上。用于此目的的合适的培养基包括例如杜尔贝科改良伊格
尔培养基和rpmi-1640培养基。可替代地，杂交瘤细胞可以作为腹水在哺乳动物的体内生长。
[0151]
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序从培养基或腹水液中分离或纯化，所述纯化程序例如像蛋白a-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
[0152]
所述抗lab抗体部分还可以通过针对具有一种或多种所需活性的抗体筛选组合文库来鉴定。例如，用于产生噬菌体展示文库并且针对具有所需结合特征的抗体筛选此类文库的多种方法是本领域已知的。此类方法综述于例如hoogenboom等人,methods in molecular biology 178:1-37(o'brien等人编辑,human press,totowa,n.j.,2001)中，并且进一步描述于例如mccafferty等人,nature 348:552-554；clackson等人,nature 352:624-628(1991)；marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1992)；marks和bradbury,methods in molecular biology 248:161-175(lo编辑,human press,totowa,n.j.,2003)；sidhu等人,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等人,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa 101(34):12467-12472(2004)；和lee等人,j.immunol.methods 284(1-2):119-132(2004)中。
[0153]
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(pcr)分别克隆vh和vl基因的库，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以如winter等人,ann.rev.immunol.,12:433-455(1994)中所述的针对抗原结合噬菌体筛选所述噬菌体文库。噬菌体通常展示作为单链fv(scfv)片段或作为fab片段的抗体片段。来自免疫源的文库在不需要构建杂交瘤的情况下提供了针对免疫原的高亲和力抗体。可替代地，可以(例如，从人)克隆天然库以在不进行任何免疫的情况下提供针对多种非自身以及自身抗原的单一来源的抗体，如griffiths等人,embo j,12:725-734(1993)所述。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的v基因区段，并且使用含有随机序列的pcr引物编码高度可变的cdr3区并且完成体外重排来合成地制造天然文库，如hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开案包括例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
[0154]
所述抗体或其抗原结合片段可以使用噬菌体展示来制备，以针对对迷路蛋白或其部分具有特异性的抗体筛选文库。所述文库可以是人scfv噬菌体展示文库，其具有至少1x109个(诸如至少约1x109个、2.5x109个、5x109个、7.5x109个、1x10
10
个、2.5x10
10
个、5x10
10
个、7.5x10
10
个或1x10
11
个中的任一个)独特人抗体片段的多样性。在一些实施方案中，所述文库是由从来自健康供体的人pmbc和脾提取的dna构建的天然人文库，其涵盖所有人重链和轻链亚家族。在一些实施方案中，所述文库是由从患有各种疾病的患者(诸如患有自身免疫性疾病的患者、癌症患者和患有感染性疾病的患者)中分离的pbmc提取的dna构建的天然人文库。在一些实施方案中，所述文库是半合成的人文库，其中使重链cdr3完全随机化，所有氨基酸(半胱氨酸除外)同等可能地存在于任何给定位置(参见例如，hoet,r.m.等人,nat.biotechnol.23(3):344-348,2005)。在一些实施方案中，所述半合成人文库的重链cdr3具有从约5个至约24个(诸如约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个中的任一个)氨基酸的长度。在一
些实施方案中，所述文库是非人噬菌体展示文库。
[0155]
可以通过以下方式来选择以高亲和力与迷路蛋白或其部分结合的噬菌体克隆：使噬菌体与迷路蛋白迭代结合，所述迷路蛋白与固体支持物(例如像用于溶液淘选的珠或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)结合；然后去除未结合的噬菌体，并且洗脱特异性结合的噬菌体。在溶液淘选的一个例子中，可以将迷路蛋白生物素化以固定到固体支持物上。将生物素化的迷路蛋白与噬菌体文库和固体支持物(诸如链霉亲和素缀合的dynabeads m-280)混合，然后分离迷路蛋白-噬菌体-珠复合物。然后将结合的噬菌体克隆洗脱并且用于感染适当的宿主细胞，诸如大肠杆菌(e.coli)xl1-blue，以进行表达和纯化。可以用溶液淘选、细胞淘选或两者的组合进行多轮(诸如约2轮、3轮、4轮、5轮、6轮或更多轮中的任一个)淘选，以富集与迷路蛋白特异性结合的噬菌体克隆。可以通过本领域已知的任何方法(包括例如elisa和facs)测试经富集的噬菌体克隆与迷路蛋白的特异性结合。
[0156]
单克隆抗体还可以通过重组dna方法(诸如美国专利号4,816,567中所述的那些方法)来制造。编码本发明的单克隆抗体的dna可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离并且测序。如上所述的杂交瘤细胞或本发明的迷路蛋白特异性噬菌体克隆可以用作这样的dna的来源。一旦分离，便可以将dna置于表达载体中，然后将所述表达载体转染到原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(诸如猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域和/或框架区的编码序列取代同源非人序列(美国专利号4,816,567；morrison等人,同上)或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接至免疫球蛋白编码序列来修饰dna。这样的非免疫球蛋白多肽可以取代本发明的抗体的恒定结构域，或者可以取代本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。
[0157]
所述抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。通常将重链在fc区中的任何点处截短，以便防止重链交联。可替代地，相关的半胱氨酸残基被另一个氨基酸残基取代或被缺失，以便防止交联。
[0158]
体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的任何方法来完成抗体的消化以产生其片段，特别是fab片段。
[0159]
具有所需结合特异性(抗体抗原结合位点)的抗体可变结构域可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合体优选地具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链区、ch2区和ch3区的至少一部分。在一些实施方案中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(ch1)存在于至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的dna插入单独的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物体中。关于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如suresh等人,methods in enzymology,121:210(1986)。人抗体与人源化抗体
[0160]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分或其构建体包含人源化抗体或人抗体。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如fv、fab、fab'、f(ab')2、scfv或抗体的其他抗原结合子序列)，其通常含有源自非人免疫球蛋白
的最小序列。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的cdr的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的诸如小鼠、大鼠或兔等的非人物种(供体抗体)的cdr的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架残基被相应的非人残基替代。人源化抗体还可以包含既未发现于受体抗体中也未发现于输入cdr或框架序列中的残基。通常，所述人源化抗体可以包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部cdr区与非人免疫球蛋白的那些cdr区对应，并且全部或基本上全部fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些fr区。在一些实施方案中，所述人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。参见例如，jones等人,nature,321:522-525(1986)；riechmann等人,nature,332:323-329(1988)；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)。
[0161]
通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。根据一些实施方案，人源化可以基本上按照winter和同事的方法(jones等人,nature,321:522-525(1986)；riechmann等人,nature,332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science,239:1534-1536(1988))通过用啮齿动物cdr或cdr序列取代人抗体的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是这样的抗体(美国专利号4,816,567)，其中明显小于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中一些cdr残基和可能一些fr残基被来自啮齿动物抗体中的类似部位的残基取代。
[0162]
作为人源化的替代方案，可以产生人抗体。例如，现在有可能产生在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下能够在免疫后产生人抗体完整库的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(jh)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。向此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原激发后产生人抗体。参见例如，jakobovits等人,pnas usa,90:2551(1993)；jakobovits等人,nature,362:255-258(1993)；bruggemann等人,year in immunol.,7:33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669、5,545,807；和wo97/17852。可替代地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的转基因动物(例如，小鼠)中来制造人抗体。在激发后，观察到在所有方面(包括基因重排、组装和抗体库)都非常类似于在人中看到的人抗体产生。此方法描述于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016，以及marks等人,bio/technology,10:779-783(1992)；lonberg等人,nature,368:856-859(1994)；morrison,nature,368:812-813(1994)；fishwild等人,nature biotechnology,14:845-851(1996)；neuberger,nature biotechnology,14:826(1996)；lonberg和huszar,intern.rev.immunol.,13:65-93(1995)中。
[0163]
还可以通过体外激活的b细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来产生人抗体。hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等人,j.mol.biol.,222:581(1991)。cole等人和boerner等人的技术也可用于人单克隆抗体的制备。cole等人,monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,第77页(1985)和boerner等人,j.immunol.,147(1):86-95(1991)。
多特异性抗体
[0164]
在一些实施方案中，所述抗lab抗体部分或其构建体包含多特异性抗体。用于制造多特异性(例如，双特异性)抗体的合适方法是本领域熟知的。例如，双特异性抗体的产生可以基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中这两对各自具有不同的特异性并且在缔合后产生异二聚抗体(参见例如，milstein和cuello,nature,305:537-539(1983)；wo 93/08829；和traunecker等人,embo j.10:3655(1991))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生十种不同的抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和色谱步骤来完成。类似的程序公开于wo 93/08829和traunecker等人,embo,10:3655-3659(1991)中。可替代地，可以通过利用物种限制的配对指导重链和轻链的组合(参见例如，lindhofer等人,j.immunol.,155:219-225(1995))，并且可以通过使用ch3结构域的“杵臼结构”工程化指导重链的配对(参见例如，美国专利号5,731,168；ridgway等人,protein eng.,9(7):617-621(1996))。还可以通过工程化静电操纵效应以制造抗体fc-异二聚分子来制造多特异性抗体(参见例如，wo 2009/089004 a1)。在又另一种方法中，可以通过受控的fab臂交换来产生稳定的双特异性抗体，其中将具有不同的抗原特异性和ch3结构域中的匹配的点突变的两种亲本抗体在还原条件下混合，以允许分离、重新组装和再氧化以形成高度纯度的双特异性抗体。labrigin等人,proc.natl.acad.sci.,110(13):5145-5150(2013)。包含重链/轻链对的混合物的此类抗体在本文中也被称为“异多聚抗体”。
[0165]
具有不同特异性的抗体或其抗原结合片段还可以化学交联以产生多特异性异缀合抗体。例如，两个f(ab')2分子(各自具有针对不同抗原的特异性)可以化学连接。pullarkat等人,trends biotechnol.,48:9-21(1999)。例如，已经提出了将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)并且用于治疗hiv感染的此类抗体。wo 91/00360；wo 92/200373；ep 03089。考虑到可以使用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及交联剂的那些方法)在体外制备抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(mercaptobutyrimidate)和例如公开于美国专利号4,676,980的那些试剂。
[0166]
在一些实施方案中，可以使用重组dna技术制备多特异性抗体。例如，双特异性抗体可以通过融合两个scfv(诸如通过肽接头使它们融合)来工程化，从而产生串联scfv。串联scfv的一个例子是双特异性t细胞衔接器。双特异性t细胞衔接器通过将抗cd3 scfv与对靶细胞的表面抗原(诸如肿瘤相关抗原(taa))具有特异性的scfv连接来制造，从而导致t细胞重定向至靶细胞。mack等人,proc.natl.acad.sci.,92:7021-7025(1995)；brischwein等人,mol.immunol.,43(8):1129-1143(2006)。通过缩短两个可变结构域之间的肽接头的长度，可以防止它们自组装并且被迫与第二多肽上的结构域配对，从而产生称为双抗体(db)的紧凑型双特异性抗体。holliger等人,proc.natl.acad.sci.,90:6444-6448(1993)。db的两个多肽各自包含通过接头连接至vl的vh，所述接头太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个多肽的vh结构域和vl结构域与另一个多肽的互补vl结构域和vh结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在这种形式的修饰中，这两个多肽通过另一个肽接头连接，从而产生单链双抗体(scdb)。在db形式的又另一种修饰中，可以通过在
每个多肽的c末端的半胱氨酸残基之间引入二硫键来产生双亲和重定向(dart)双特异性抗体，所述每个多肽任选地包括在c末端半胱氨酸残基之前的驱动所需异二聚结构的组装的结构域。veri等人,arthritis rheum.,62(7):1933-1943(2010)。双可变结构域免疫球蛋白(dvd-ig
tm
)也是本领域已知的，其中两种单克隆抗体的靶结合可变结构域经由天然存在的接头组合以产生四价双特异性抗体。gu和ghayur,methods enzymol.,502:25-41(2012)。在又另一种形式中，通过利用源自人camp依赖性蛋白激酶(pka)的调节亚基的肽(ddd2)与源自人a激酶锚定蛋白(akap)的锚定结构域的肽(ad2)的二聚化来制备对接和锁定(dnl)双特异性抗体。rossi等人,proc.natl.acad.sci.,103:6841-6846(2006)。
[0167]
还已经描述了用于直接从重组细胞培养物制造和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。kostelny等人,j.immunol.,148(5):1547-1553(1992)。此方法也可以用于产生抗体同二聚体。抗lab抗体部分变体
[0168]
在一些实施方案中，考虑了本文提供的抗体部分的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善所述抗体部分的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体部分的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码所述抗体部分的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如所述抗体部分的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有所需特征(例如，抗原结合)。
[0169]
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体部分变体。用于取代诱变的目的位点包括hvr和fr。可以将氨基酸取代引入目的抗体部分中，并且筛选产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc。
[0170]
保守取代示于下表4中。表4：保守取代
[0171]
可以根据常见的侧链特性将氨基酸分组为不同的类别：a.疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；b.中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；c.酸性：asp，glu；d.碱性：his、lys、arg；
e.影响链取向的残基：gly、pro；f.芳香族：trp、tyr、phe。
[0172]
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一种类别。
[0173]
示例性取代变体是亲和力成熟的抗体部分，其可以使用例如基于噬菌体展示的亲和力成熟技术便利地产生。简言之，突变一个或多个cdr残基并且在噬菌体上展示变体抗体部分，并且针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。可以在hvr中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体部分亲和力。此类改变可以在hvr“热点”和/或特异性决定残基(sdr)中进行，所述热点即由在体细胞成熟过程期间高频率发生突变的密码子编码的残基(参见例如，chowdhury,methods mol.biol.207:179-196(2008))，并且测试所得变体vh或vl的结合亲和力。例如在hoogenboom等人的methods in molecular biology 178:1-37(o'brien等人编辑,human press,totowa,nj,(2001))中已经描述了通过构建和从二级文库中重新选择进行的亲和力成熟。
[0174]
在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错pcr、链改组或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入选择进行成熟的可变基因中。然后建立二级文库。然后筛选所述文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体部分变体。用于引入多样性的另一种方法涉及hvr指导的方法，其中随机化几个hvr残基(例如，每次4-6个残基)。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定抗原结合中所涉及的hvr残基。特别地，通常靶向cdr-h3和cdr-l3。
[0175]
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个hvr内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在hvr中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可以位于hvr“热点”或sdr的外部。在上文提供的变体vh和vl序列的一些实施方案中，每个hvr未改变，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
[0176]
用于鉴定抗体部分的可以靶向进行诱变的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗体部分与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置处引入进一步的取代，从而证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地，抗原-抗体部分复合物的晶体结构可以被确定为鉴定抗体部分与抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需特性。
[0177]
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n末端甲硫氨酰残基的抗体部分。所述抗体部分的其他插入变体包括将所述抗体部分的n末端或c末端与酶(例如，用于adept)或增加所述抗体部分的血清半衰期的多肽融合。fc区变体
[0178]
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的全长抗lab抗体部分的fc区中，从而产生fc区变体。在一些实施方案中，所述fc区变体具有增强的抗体依赖性细胞毒性(adcc)效应子功能，通常和与fc受体(fcr)的结合相关。在一些实施方案中，
所述fc区变体具有降低的adcc效应子功能。有许多可以改变效应子功能的fc序列的变化或突变的例子。例如，wo 00/42072和shields等人j biol.chem.9(2):6591-6604(2001)描述了与fcr的结合改善或减弱的抗体变体。将那些出版物的内容通过引用明确地并入本文。
[0179]
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)是治疗性抗体针对肿瘤细胞的作用机制。adcc是细胞介导的免疫防御，借此免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞(例如，癌细胞)，所述靶细胞的膜表面抗原已经被特异性抗体(例如，抗lab抗体)结合。典型的adcc涉及抗体激活nk细胞。nk细胞表达作为fc受体的cd16。此受体识别并且结合至与靶细胞表面结合的抗体的fc部分。nk细胞表面最常见的fc受体称为cd16或fcγriii。fc受体与抗体的fc区的结合导致nk细胞激活、溶细胞颗粒的释放以及随之发生的靶细胞凋亡。adcc对肿瘤细胞杀伤的贡献可以通过使用已经被高亲和力fcr转染的nk-92细胞的特定测试来测量。将结果与不表达fcr的野生型nk-92细胞进行比较。
[0180]
在一些实施方案中，本发明考虑了包含具有一些但不是所有效应子功能的fc区的抗lab构建体变体，这使其成为以下应用的理想候选物，在所述应用中抗lab构建体的体内半衰期是重要的，但是某些效应子功能(诸如cdc和adcc)是不必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实cdc和/或adcc活性的降低/耗尽。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定以确保抗体缺乏fcγr结合(因此可能缺乏adcc活性)，但是保留fcrn结合能力。介导adcc的原代细胞nk细胞仅表达fcγriii，然而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达总结于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目的分子的adcc活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见例如，hellstrom,i.等人proc.nat'l acad.sci.usa 83:7059-7063(1986))和hellstrom,i等人,proc.nat'l acad.sci.usa 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见bruggemann,m.等人,j.exp.med.166:1351-1361(1987))中。可替代地，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的acti
tm
非放射性细胞毒性测定(celltechnology,inc.，加利福尼亚州山景城)；和cytotox 96
tm
非放射性细胞毒性测定(promega，威斯康星州麦迪逊))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，如clynes等人proc.nat'l acad.sci.usa 95:652-656(1998)中公开的动物模型中)评估目的分子的adcc活性。还可以进行c1q结合测定以证实，所述抗体不能结合c1q并且因此缺乏cdc活性。参见例如，wo 2006/029879和wo 2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以进行cdc测定(参见例如，gazzano-santoro等人,j.immunol.methods 202:163(1996)；cragg,m.s.等人,blood 101:1045-1052(2003)；和cragg,m.s.和m.j.glennie,blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行fcrn结合和体内清除率/半衰期确定(参见例如，petkova,s.b.等人,int'l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。
[0181]
具有降低的效应子功能的抗体包括具有fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的fc突变体，包括具有残基265和297的至丙氨酸的取代的所谓“dana”fc突变体(美国专利号7,332,581)。
[0182]
描述了与fcr的结合改善或减弱的某些抗体变体(参见例如，美国专利号6,737,
056；wo 2004/056312；和shields等人,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001))。
[0183]
在一些实施方案中，提供了抗lab构建体(例如，全长抗lab抗体)变体，其包含含有改善adcc的一个或多个氨基酸取代的变体fc区。在一些实施方案中，所述变体fc区包含改善adcc的一个或多个氨基酸取代，其中所述取代位于变体fc区的位置298、333和/或334处(残基的eu编号)。在一些实施方案中，所述抗lab构建体(例如，全长抗lab抗体)变体在其变体fc区中包含以下氨基酸取代：s298a、e333a和k334a。
[0184]
在一些实施方案中，在fc区中进行改变，所述改变导致改变(即，改善或减弱)的c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如如美国专利号6,194,551、wo 99/51642和idusogie等人,j.immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
[0185]
在一些实施方案中，提供了抗lab构建体(例如，全长抗lab抗体)变体，其包含含有增加半衰期和/或改善与新生儿fc受体(fcrn)的结合的一个或多个氨基酸取代的变体fc区。具有增加的半衰期和改善的与fcrn的结合的抗体描述于us 2005/0014934 a1(hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的fc区，所述一个或多个取代改善fc区与fcrn的结合。此类fc变体包括在以下fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
[0186]
关于fc区变体的其他例子，还参见duncan&winter,nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和wo 94/29351。
[0187]
考虑了包含本文所述的fc变体中的任一种或其组合的抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)。糖基化变体
[0188]
在一些实施方案中，改变本文提供的抗lab构建体以增加或降低所述抗lab构建体被糖基化的程度。通过改变抗lab构建体或其多肽部分的氨基酸序列可以便利地完成糖基化位点在所述抗lab构建体中的添加或缺失，使得产生或去除一个或多个糖基化位点。
[0189]
在所述抗lab构建体包含fc区的情况下，可以改变附接至其上的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链、二天线寡糖，其通常通过n-连接而附接至fc区的ch2结构域的asn297。参见例如，wright等人,tibtech 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、n-乙酰基葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸以及附接至二天线寡糖结构的“茎”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的抗lab构建体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善的特性的抗lab构建体。
[0190]
在一些实施方案中，提供了包含fc区的抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)变体，其中附接至所述fc区的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可以改善adcc功能。特别地，在本文中考虑了相对于在野生型cho细胞中产生的相同抗lab构建体上岩藻糖的量，具有减少的岩藻糖的抗lab构建体。也就是说，它们的特征在于具有比如果由天然cho细胞(例如，产生天然糖基化模式的cho细胞，诸如含有天然fut8基因的cho细胞)产生的情况下它们原本将具有的量低的量的岩藻糖。在一些实施方案中，所述抗lab构建体是这样的构建体，其中其上少于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的n-连接的聚糖包含岩藻糖。例如，这样的抗lab构建体中岩藻糖的量可以是从1％至80％、从1％至65％、从5％至65％或从20％至40％。在一些实施方案中，所述抗lab构建体是这样的构建体，其中其上的n-连接
的聚糖均不包含岩藻糖，即其中所述抗lab构建体完全没有岩藻糖，或者没有岩藻糖或是非岩藻糖基化的。如通过maldi-tof质谱法测量的，例如如wo 2008/077546中所述，通过相对于附接至asn 297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算asn297处糖链内岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量。asn297是指位于fc区中的约位置297(fc区残基的eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于位置297上游或下游约
±
3个氨基酸处，即在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可能具有改善的adcc功能。参见例如，美国专利公开号us 2003/0157108(presta,l.)；us 2004/0093621(kyowa hakko kogyo co.,ltd)。与“脱岩藻糖基化的”或“缺乏岩藻糖的”抗体变体相关的出版物的例子包括：us 2003/0157108；wo 2000/61739；wo 2001/29246；us 2003/0115614；us 2002/0164328；us 2004/0093621；us 2004/0132140；us 2004/0110704；us 2004/0110282；us 2004/0109865；wo 2003/085119；wo 2003/084570；wo 2005/035586；wo 2005/035778；wo2005/053742；wo 2002/031140；okazaki等人j.mol.biol.336:1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等人biotech.bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化的抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的lec13 cho细胞(ripka等人arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号us 2003/0157108 a1，presta,l；和wo 2004/056312 a1，adams等人，尤其是实施例11)以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(fut8)敲除的cho细胞(参见例如，yamane-ohnuki等人biotech.bioen g.87:614(2004)；kanda,y.等人,biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006)；和wo2003/085107)。
[0191]
抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)变体进一步提供有二等分的寡糖，例如其中附接至所述抗lab构建体的fc区的二天线寡糖被glcnac二等分。此类抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)变体可能具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能。此类抗体变体的例子描述于例如wo 2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利号6,602,684(umana等人)；us 2005/0123546(umana等人)；和ferrara等人,biotechnology and bioengineering,93(5):851-861(2006)中。还提供了在附接至fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)变体。此类抗lab构建体变体可能具有改善的cdc功能。此类抗体变体描述于例如wo 1997/30087(patel等人)；wo 1998/58964(raju,s.)；和wo 1999/22764(raju,s.)中。
[0192]
在一些实施方案中，包含fc区的抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)变体能够与fcγriii结合。在一些实施方案中，与在其他方面相同的包含人野生型igg1fc区的抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)相比，包含fc区的抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)变体在存在人效应细胞的情况下具有adcc活性或在存在人效应细胞的情况下具有增加的adcc活性。半胱氨酸工程化变体
[0193]
在一些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸工程化抗lab构建体(诸如全长抗lab抗体)，其中一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施方案中，被取代的残基出现在所述抗lab构建体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基定位于所述抗lab构建体的可及位点处，并且可以用于将所述抗lab构建体缀合至其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分，以产生抗lab免疫缀合物，如本文进一步所述。可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生半胱氨酸工程化抗lab构建体(诸如全长抗lab抗
体)。衍生物
[0194]
在一些实施方案中，可以对本文提供的抗lab构建体进行进一步修饰以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适用于衍生化所述抗lab构建体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可以在制造中具有优势。所述聚合物可以具有任何分子量，并且可以有支链或无支链。附接至所述抗lab构建体的聚合物的数量可以变化，并且如果附接多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于包括但不限于以下的考虑因素来确定：待改善的抗lab构建体的特定特性或功能、抗lab构建体衍生物是否将要用于在确定条件下的疗法中等。
[0195]
在一些实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射而选择性地加热的抗lab构建体和非蛋白质部分的缀合物。在一些实施方案中，所述非蛋白质部分是碳纳米管(kam等人,proc.natl.acad.sci.usa 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于这样的波长，其不伤害普通细胞，但是将非蛋白质部分加热至接近抗lab构建体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度。抗lab car、抗lab tcr和抗lab双特异性t细胞衔接器
[0196]
在一方面，本技术提供了抗lab构建体，其中所述抗lab构建体是例如抗lab car、抗lab tcr或抗lab双特异性t细胞衔接器。用于制造此类抗lab构建体的方法是本领域已知的，并且描述于例如以上部分中。效应细胞制备
[0197]
在一方面，本发明提供了表达例如抗lab car的效应细胞(诸如淋巴细胞，例如t细胞)。本文提供了制备表达所述抗lab car的效应细胞(诸如t细胞)(抗lab car效应细胞，诸如抗lab car t细胞)的示例性方法。
[0198]
在一些实施方案中，可以通过将包含抗lab car(例如包含抗lab抗体部分以及cd28和cd3ζ细胞内信号传导序列的car)的载体(包括例如慢病毒载体)引入效应细胞(诸如t细胞)中来产生抗lab car效应细胞(诸如t细胞)。在一些实施方案中，本发明的抗lab car效应细胞(诸如t细胞)能够在体内复制，从而导致长期持久性，这可以导致对迷路蛋白阳性疾病(诸如癌症，例如腺癌)的持续控制。
[0199]
在一些实施方案中，本发明涉及使用淋巴细胞输注施用表达抗lab car的基因修饰的t细胞以治疗患有迷路蛋白阳性疾病或有患有迷路蛋白阳性疾病的风险的患者。在一些实施方案中，在所述治疗中使用自体淋巴细胞输注。从需要治疗的患者收集自体pbmc，并且使用本文所述和本领域已知的方法激活和扩增t细胞，然后将所述t细胞输注回所述患者体内。
[0200]
在一些实施方案中，所述抗lab car t细胞表达包含抗lab抗体部分的抗lab car(在本文中也称为“抗lab car t细胞”)。在一些实施方案中，所述抗lab car t细胞表达抗
lab car，其包含含有抗lab抗体部分的细胞外结构域和含有cd3ζ和cd28的细胞内信号传导序列的细胞内结构域。本发明的抗lab car t细胞可以经历稳健的体内t细胞扩增，并且可以建立在血液和骨髓中以高水平持续很长一段时间的迷路蛋白特异性记忆细胞。在一些实施方案中，输注到患者体内的本发明的抗lab car t细胞可以在患有迷路蛋白阳性疾病的患者体内消除迷路蛋白呈递细胞，诸如迷路蛋白呈递癌细胞。在一些实施方案中，输注到患者体内的本发明的抗lab car t细胞可以在患有对至少一种常规治疗难治的迷路蛋白阳性疾病的患者体内消除迷路蛋白呈递细胞，诸如迷路蛋白呈递癌细胞。
[0201]
在t细胞的扩增和基因修饰之前，从受试者获得t细胞来源。t细胞可以获自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的一些实施方案中，可以使用任何数量的在本领域中可获得的t细胞系。在本发明的一些实施方案中，可以使用熟练技术人员已知的任何数量的技术(诸如ficoll
tm
分离)从收集自受试者的血液单位获得t细胞。在一些实施方案中，来自个体的循环血液的细胞是通过单采术获得的。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或者可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。如本领域普通技术人员应容易地理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，诸如通过根据制造商的说明书使用半自动化“流通式”离心机(例如，cobe 2991细胞处理器、baxter cytomate或haemonetics cell saver 5)来完成。在洗涤之后，可以将细胞重悬于多种生物相容的缓冲液中，所述缓冲液是诸如无ca
2
、无mg
2
的pbs、plasmalyte a或者有或没有缓冲剂的其他盐水溶液。可替代地，可以去除单采术样品的非期望的组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
[0202]
在一些实施方案中，通过裂解红细胞并且耗尽单核细胞，例如通过经由percoll
tm
梯度离心或通过逆流离心淘析法，从外周血淋巴细胞中分离t细胞。t细胞的特定亚群(诸如cd3

、cd28

、cd4

、cd8

、cd45ra

和cd45ro

t细胞)可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一些实施方案中，通过与抗cd3/抗cd28(即，3
×
28)缀合的珠(诸如m-450cd3/cd28 t)一起孵育持续足以进行所需t细胞的阳性选择的时间段来分离t细胞。在一些实施方案中，所述时间段是约30分钟。在一些实施方案中，所述时间段的范围是30分钟至36小时或更长时间以及其间的所有整数值。在一些实施方案中，所述时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施方案中，所述时间段是10至24小时。在一些实施方案中，所述孵育时间段是24小时。对于从患有白血病的患者分离t细胞，使用更长的孵育时间(诸如24小时)可以增加细胞产量。在t细胞少于其他细胞类型的任何情况下，诸如在从肿瘤组织或从免疫受损的个体分离肿瘤浸润性淋巴细胞(til)时，可以使用更长的孵育时间来分离t细胞。此外，使用更长的孵育时间可以增加捕获cd8

t细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许t细胞与cd3/cd28珠结合的时间和/或通过增加或减小珠与t细胞的比率，可以在培养起始时或在过程期间的其他时间点优先选择或淘汰t细胞亚群。另外，通过增加或减小抗cd3和/或抗cd28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他所需时间点优先选择或淘汰t细胞亚群。熟练技术人员应认识到，在本发明的上下文中还
可以使用多轮选择。在一些实施方案中，可能希望进行选择程序并且在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。还可以使“未选择的”细胞进一步经历多轮选择。
[0203]
通过阴性选择富集t细胞群体可以用针对阴性选择的细胞独有的表面标记物的抗体的组合来完成。一种方法是经由使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物(cocktail)的阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集cd4 细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在一些实施方案中，可能希望富集或阳性选择通常表达cd4

、cd25

、cd62lhi、gitr

和foxp3

的调节性t细胞。可替代地，在一些实施方案中，t调节细胞被抗cd25缀合的珠或其他类似的选择方法耗尽。
[0204]
对于通过阳性或阴性选择分离所需细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒，诸如珠)的浓度。在一些实施方案中，可能希望显著减小珠与细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞与珠的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用约10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用大于约1亿个细胞/ml。在一些实施方案中，使用约1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml中的任一个的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml中的任一个的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约1.25亿或约1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，诸如cd28阴性t细胞，或者从存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)捕获。此类细胞群体可以具有治疗价值并且将是期望获得的。例如，使用高细胞浓度允许更高效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8

t细胞。
[0205]
在本发明的一些实施方案中，t细胞是在治疗后立刻从患者获得的。就此而言，已经观察到，在某些癌症治疗后，特别是在用损害免疫系统的药物的治疗中，在治疗后不久患者通常将从治疗中恢复的阶段期间，所获得的t细胞的品质可能是最佳的或者针对其离体扩增的能力有所改善。同样，在使用本文所述的方法离体操作后，这些细胞可以处于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的上下文内考虑在此恢复期期间收集血液细胞，包括t细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在一些实施方案中，动员(例如，用gm-csf动员)和调理方案可以用于在受试者体内产生这样的条件，其中有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增，尤其在治疗后的限定时间窗期间。说明性细胞类型包括t细胞、b细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
[0206]
无论是在对t细胞进行基因修饰以表达期望的抗lab car之前还是之后，t细胞都可以通常使用如例如以下专利中所述的方法激活和扩增：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005。
[0207]
通常，本发明的t细胞通过与表面接触来扩增，所述表面附接有刺激cd3/tcr复合物相关信号的药剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以刺激t细胞群体，诸如通过与固定在表面上的抗cd3抗体或其抗原结合片段或抗cd2抗体接触，或者通过与蛋白激酶c激活剂(例如，苔藓抑素)结合钙离子载体接触。对于t细胞表面上的辅助分子的共
刺激，使用结合所述辅助分子的配体。例如，可以使t细胞群体与抗cd3抗体和抗cd28抗体在适合于刺激t细胞增殖的条件下接触。为了刺激cd4

t细胞或cd8

t细胞的增殖，抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的例子包括9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone，法国贝桑松)，其可以用作本领域通常已知的其他方法(berg等人,transplant proc.30(8):3975-3977,1998；haanen等人,j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland等人,j.immunol.meth.227(1-2):53-63,1999)。免疫缀合物制备
[0208]
可以使用本领域已知的任何方法制备抗lab免疫缀合物。参见例如，wo 2009/067800、wo 2011/133886和美国专利申请公开号2014322129，通过引用以其整体并入本文。
[0209]
抗lab免疫缀合物的抗lab抗体部分可以通过所述抗lab抗体部分可以与所述效应分子缔合或连接的任何手段“附接至”所述效应分子。例如，抗lab免疫缀合物的抗lab抗体部分可以通过化学或重组手段附接至所述效应分子。用于制备融合体或缀合物的化学手段是本领域已知的，并且可以用于制备所述抗lab免疫缀合物。用于缀合抗lab抗体部分和效应分子的方法必须能够将所述结合蛋白与所述效应分子连接，而不干扰所述结合蛋白与靶细胞上的抗原结合的能力。
[0210]
抗lab免疫缀合物的抗lab抗体部分可以与所述效应分子间接连接。例如，抗lab免疫缀合物的抗lab抗体部分可以与含有几种类型之一的效应分子的脂质体直接连接。所述一种或多种效应分子和/或所述抗lab抗体部分还可以与固体表面结合。
[0211]
在一些实施方案中，抗lab免疫缀合物的抗lab抗体部分和所述效应分子两者都是蛋白质，并且可以使用本领域熟知的技术缀合。几百种可以缀合两种蛋白质的交联剂是可用的。(参见例如“chemistry of protein conjugation and crosslinking”1991,shans wong,crc press,ann arbor)。通常基于可用或插入在所述抗lab抗体部分和/或效应分子上的反应性官能团来选择交联剂。此外，如果没有反应性基团，则可以使用可光激活的交联剂。在某些情况下，可能希望在所述抗lab抗体部分与所述效应分子之间包括间隔子。本领域已知的交联剂包括同双功能试剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物(dimethyladipimidate)和双(重氮基联苯胺)；以及异双功能试剂：m马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺和磺基-m马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺。
[0212]
在一些实施方案中，抗lab免疫缀合物的抗lab抗体部分可以用特定残基工程化以用于所述效应分子的化学附接。本领域已知的用于分子的化学附接的特定残基包括赖氨酸和半胱氨酸。基于插入在所述抗lab抗体部分上并且在所述效应分子上可用的反应性官能团来选择交联剂。
[0213]
还可以使用重组dna技术来制备抗lab免疫缀合物。在这样的情况下，编码所述抗lab抗体部分的dna序列与编码所述效应分子的dna序列融合，从而产生嵌合dna分子。将嵌合dna序列转染到表达所述融合蛋白的宿主细胞中。可以从细胞培养物中回收所述融合蛋白，并且使用本领域已知的技术进行纯化。
[0214]
将效应分子(其是标记)附接至所述结合蛋白的例子包括以下文献中所述的方法：hunter等人,nature 144:945(1962)；david等人,bioch emistry 13:1014(1974)；pain等人,j.immunol.meth.40:219(1981)；nygr en,j.histochem.and cytochem.30:407(1982)；wensel和meares,radioimmunoimaging and radioimmunotherapy,elsevier,n.y.(1983)；
和colcher等人,“use of monoclonal antibodies as radiopharmaceuticals for the lo calization of human carcinoma xenografts in athymic mice”,meth.enz ymol.,121:802-16(1986)。
[0215]
可以以已知的方式将放射性标记或其他标记掺入所述免疫缀合物中。例如，肽可以是生物合成的，或者可以通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体合成，所述氨基酸前体涉及例如替代氢的氟-19。在肽中可以经由半胱氨酸残基附接标记，诸如
99
tc或
123
i、
186
re、
188
re和
111
in。钇-90可以经由赖氨酸残基附接。iodogen方法(fraker等人,biochem.biophys.res.commun.80:49-57(1978))可以用于掺入碘-123。“monoclonal antibodies in immunoscintigraphy”(chatal,crc press 1989)详细描述了其他方法。
[0216]
可以使用多种双功能蛋白偶联剂诸如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二亚酰胺化物hci)、活性酯(诸如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(诸如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸盐(诸如甲苯2,6-二异氰酸盐)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来制造所述抗体部分与细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如vitetta等人,science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见例如，wo94/11026。所述接头可以是“可切割接头”，其促进细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(chari等人,cancer research 52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
[0217]
本发明的抗lab免疫缀合物明确地考虑但不限于用如下交联试剂制备的adc：bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，它们可商购获得(例如，来自pierce biotechnology,inc.，美国伊利诺伊州罗克福德)。参见2003-2004applications handbook and catalog的第467-498页。药物组合物
[0218]
本文还提供了包含抗lab构建体的组合物(诸如药物组合物，在本文中也称为配制品)。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含与所述抗lab构建体相关的细胞(诸如效应细胞，例如t细胞)。在一些实施方案中，提供了包含抗lab构建体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含与所述抗lab构建体相关的细胞(诸如效应细胞，例如t细胞)。
[0219]
通过将具有所需纯度的抗lab构建体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来获得呈冻干配制品或水溶液形式的抗lab构建体的合适配制品(remington's pharmaceutical sciences第16版,osol,a.编辑(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，诸如对羟基苯甲
酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。示例性配制品描述于wo98/56418中，通过引用明确地并入本文。适用于皮下施用的冻干配制品描述于wo 97/04801中。此类冻干配制品可以用合适的稀释剂重构至高蛋白质浓度，并且可以向本文待治疗的个体皮下施用重构的配制品。脂质体(lipofectin或liposome)可以用于将本发明的抗lab构建体递送至细胞中。
[0220]
本文的配制品还可以含有除所述抗lab构建体之外的所治疗特定适应症所必需的一种或多种活性化合物，优选地彼此没有不利影响的具有互补活性的那些活性化合物。例如，除所述抗lab构建体之外，可能希望进一步提供抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。此类分子适合地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的抗lab构建体的量、疾病或障碍或治疗的类型和以上所讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量和如本文所述的施用途径或迄今所采用的剂量的约1％至99％使用。
[0221]
所述抗lab构建体还可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或者包埋在粗乳液中。此类技术公开于remington's pharmaceutical sciences第16版,osol,a.编辑(1980)中。可以制备缓释制剂。
[0222]
可以制备所述抗lab构建体的缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有所述抗体(或其片段)的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品(例如，薄膜或微胶囊)的形式。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如lupron depot tm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球))和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙烯基乙酸酯和乳酸-乙醇酸等的聚合物能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质持续较短时间段。当所包封的抗体长时间保留在体内时，它们可能由于在37℃下暴露于水分而变性或聚集，从而导致生物活性的丧失和可能的免疫原性的变化。根据所涉及的机制，可以设计合理的策略来稳定抗lab构建体。例如，如果发现聚集机制是通过硫基-二硫键互换形成分子间s-s键，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂以及开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
[0223]
在一些实施方案中，所述抗lab构建体被配制在缓冲液中，所述缓冲液包含柠檬酸盐、nacl、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(tween 80)或前述的任何组合。在一些实施方案中，所述抗lab构建体被配制在包含约100mm至约150mm甘氨酸的缓冲液中。在一些实施方案中，所述抗lab构建体被配制在包含约50mm至约100mm nacl的缓冲液中。在一些实施方案中，所述抗lab构建体被配制在包含约10mm至约50mm乙酸盐的缓冲液中。在一些实施
方案中，所述抗lab构建体被配制在包含约10mm至约50mm琥珀酸盐的缓冲液中。在一些实施方案中，所述抗lab构建体被配制在包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中。在一些实施方案中，所述抗lab构建体被配制在具有在约5.1与5.6之间的ph的缓冲液中。在一些实施方案中，所述抗lab构建体被配制在缓冲液中，所述缓冲液包含10mm柠檬酸盐、100mm nacl、100mm甘氨酸和0.01％聚山梨醇酯80，其中所述配制品的ph是5.5。待用于体内施用的配制品必须是无菌的。这通过例如经由无菌过滤膜过滤而容易地实现。使用抗lab构建体的方法
[0224]
可以向个体(例如哺乳动物，诸如人)施用本技术的抗lab构建体和/或组合物以治疗和/或预防包括例如癌症(诸如腺癌)在内的疾病和/或障碍。在一些实施方案中，所述癌症是迷路蛋白阳性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是腺癌，诸如迷路蛋白阳性腺癌。因此，在一些实施方案中，本技术提供了治疗个体的迷路蛋白阳性疾病(诸如癌症)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的组合物(诸如药物组合物)，所述组合物包含含有抗lab抗体部分的抗lab构建体，诸如本文所述的抗lab构建体中的任一种。在一些实施方案中，所述组合物包含表达所述抗lab构建体(诸如car)的细胞(诸如效应细胞)。
[0225]
例如，在一些实施方案中，提供了治疗个体的迷路蛋白阳性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含含有与迷路蛋白特异性结合的抗lab抗体部分的抗lab构建体。在一些实施方案中，提供了治疗个体的迷路蛋白阳性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含表达抗lab构建体(例如，本文所述的抗lab car或抗lab tcr)的效应细胞(诸如免疫细胞，例如t细胞)。在一些实施方案中，当来自所述个体的癌症样品显示所述样品中约10％或更多(诸如至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个)的癌细胞对迷路蛋白呈阳性(诸如使用免疫组织化学(ihc)技术确定)时，则选择所述个体进行治疗。在一些实施方案中，当来自所述个体的癌症样品显示所述样品中约10％或更多(诸如至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个)的癌细胞亚群(诸如在肿瘤周围的细胞)对迷路蛋白呈阳性(诸如使用免疫组织化学(ihc)技术确定)时，则选择所述个体进行治疗。
[0226]
在一些实施方案中，所述个体是人。
[0227]
向个体(诸如人)施用的抗lab构建体组合物的剂量可以随特定组合物、施用方式和所治疗疾病的类型而变化。在一些实施方案中，所述组合物的量有效地产生客观反应(诸如部分反应或完全反应)。在一些实施方案中，在所述组合物中抗lab构建体(例如，全长抗lab抗体、多特异性抗lab分子或抗lab免疫缀合物)的量被包括在例如约0.001μg至约1000μg的范围内。在上述方面中的任一个的一些实施方案中，在所述组合物中抗lab构建体(例如，全长抗lab抗体、多特异性抗lab分子或抗lab免疫缀合物)的有效量在约0.1μg/kg至约100mg/kg的总体重的范围内。
[0228]
可以经由各种途径向个体(诸如人)施用所述抗lab构建体组合物，所述途径包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊泡内、肌内、气管内、皮下、皮内、眼内、鞘内、透粘膜和透皮。在一些实施方案中，可以使用所述组合物的连续缓释配制品。
[0229]
本技术还提供了使用抗lab car或抗lab tcr将效应细胞(诸如免疫细胞，例如t细胞)的特异性重定向至表达迷路蛋白的细胞的方法。因此，本技术还提供了在哺乳动物中刺
激对表达迷路蛋白的靶细胞群体或组织的效应细胞介导的反应(诸如t细胞介导的免疫反应)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用表达抗lab car和抗lab tcr的效应细胞(诸如t细胞)的步骤。
[0230]
可以将抗lab car或表达所述抗lab car的抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)输注到有需要的受体体内。所输注的细胞能够杀死受体体内表达迷路蛋白的细胞。在一些实施方案中，与抗体疗法不同，抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)能够在体内复制，从而导致可以引起持续肿瘤控制的长期持久性。
[0231]
离体程序是本领域熟知的，并且在下面进行了更全面的讨论。简言之，将细胞从哺乳动物(优选地人)中分离，并且用表达本文公开的抗lab car或抗lab tcr的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。可以向哺乳动物受体施用抗lab cart或抗lab tcrt细胞以提供治疗益处。所述哺乳动物受体可以是人，并且所述抗lab cart或抗lab tcrt细胞相对于所述受体可以是自体的。可替代地，所述细胞相对于所述受体可以是同种异体的、同基因的或异基因的。
[0232]
除在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本技术还提供了用于体内免疫的组合物和方法以在患者体内引发针对抗原的免疫反应。
[0233]
待施用的本技术的抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)组合物的精确量可以由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定。在一些实施方案中，以约104个至约109个细胞/kg体重的剂量施用包含所述抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)的药物组合物。抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)组合物还可以以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用所述细胞。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域技术人员通过监测患者的疾病征候和相应调整治疗而容易地确定。
[0234]
所述抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)的施用可以以任何便利的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输液、植入或移植进行。可以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者施用本文所述的组合物。在一些实施方案中，通过皮内或皮下注射向患者施用本技术的抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)组合物。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用本技术的抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)组合物。可以将抗lab car或抗lab tcr效应细胞(诸如t细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
[0235]
本文公开的方法可以包括在一段时间内向个体施用多个剂量的本文所述的抗lab构建体和/或组合物。在一些实施方案中，基于施用医师的判断，在治疗过程中调整本文所述的抗lab构建体和/或组合物的给药频率和或剂量量。
[0236]
本文公开的用于治疗和/或预防的方法可用于治疗或预防个体的增殖性疾病，诸如癌症。在一些实施方案中，所述癌症是表达迷路蛋白的癌症，诸如迷路蛋白阳性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症、缓解期癌症、复发性癌症、耐药性癌症或难治性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是局部可切除癌症(例如，局限于允许完全手术切除的器官的一部分的肿瘤)、局部不可切除癌症(例如，由于重要血管结构而不可切除的局部肿瘤)或不可切除癌症。在一些实施方案中，根据tnm分类，所述癌症是i期肿瘤、ii
期肿瘤、iii期肿瘤、iv期肿瘤、n1肿瘤或m1肿瘤。
[0237]
本文公开的方法可用于治疗或预防个体的癌症，诸如表达迷路蛋白的癌症。在一些实施方案中，所述个体具有以下特征中的一个或多个：(i)理解知情同意书的能力和签署知情同意书的意愿；(ii)至少18岁，具有组织学证实的腺癌和/或表达迷路蛋白的癌症；(iii)先前用至少1种在先全身疗法(化学疗法和/或生物学疗法)治疗，并且在治疗期间没有反应/进展或在完成全身疗法后进展或拒绝所有其他治疗；(iv)一种或多种肿瘤必须过表达迷路蛋白抗原，如通过石蜡包埋的档案标本的筛选免疫组织化学评价确定的，所述档案标本展现》10％的恶性细胞针对抗原染色，并且根据单一参考病理学家的评分具有至少2x背景的强度；(v)任何数量的在先化学疗法方案；(vi)在第一次注射疫苗之前对常见回忆抗原的迟发型超敏反应(dth)的记录；(vii)karnofsky量表的功能状态≥60％；(viii)治疗时的预期寿命≥6个月；(ix)可测量或可评价的疾病；(x)在第一次注射疫苗之前4周内获得的治疗前绝对粒细胞计数(agc)≥1,000且治疗前血小板计数≥75,000；(xi)需要治疗前血清肌酐≤1.5mg/dl；和(xii)血清胆红素≤1.5且ast≤2.5x正常的机构上限(如果有肝转移，则≤5x)。
[0238]
本领域技术人员应认识到，在本技术的公开文本的范围和精神内可以有若干种实施方案。通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应被解释为在范围或精神上将本公开文本限制在其中所述的具体程序内。实施例实施例1
[0239]
此实施例展现了源自抗迷路蛋白抗体(mca 44-3a6)的功能性单链可变片段(scfv)和抗原结合片段(fab)的开发和测试。
[0240]
用可用于cdna合成和pcr方法的寡核苷酸引物克隆mca44-3a6的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vh)cdna。克隆基于免疫球蛋白数据库中发布的序列。简言之，通过可商购获得的试剂，将从约5x108个杂交瘤细胞制备的rna用于制备cdna。用限制性酶消化vh和vl的扩增的cdna，在pcr扩增期间安装所述限制性酶的位点。然后将基因亚克隆到噬菌体展示载体中以构建scfv用于文库选择目的。
[0241]
然后亚克隆scfv的文库。对于每个scfv，将序列融合，使得在随后表达时，产物将具有c末端myc标签。对于噬菌体文库选择，将蛋白质抗原(组氨酸标记的迷路蛋白)固定到96孔板上过夜。将文库噬菌体的等分试样置于指定的孔中。将结合的噬菌体洗脱并且添加到tg1培养物中进行感染，然后由ko7辅助噬菌体拯救。使感染的tg1细胞生长(30℃过夜)，并且收获细菌培养上清液，将其沉淀并且重悬于pbs中，用于下一轮选择或噬菌体elisa。
[0242]
对于抗原制备，克隆迷路蛋白的细胞外结构域，并且使用pgex-2t将其表达为gst融合蛋白。使用尺寸排阻色谱容易地制备粗制剂，并且通过亲和色谱制造纯制剂。观察到，由于蛋白质的一些部分中的带负电的和酸性的残基，迷路蛋白随着逐步纯化而强烈聚集。因此，产生组氨酸标记的经修饰的迷路蛋白(减去前22个非常疏水的氨基酸：前导样序列)，并且将其用于上述抗原-抗体筛选程序(噬菌体展示)。尽管预期组氨酸不对迷路蛋白二级结构产生主要作用，但是考虑到围绕此蛋白质纯化的问题，还合成含有mca 44-3a6的已知结合位点的对应于氨基酸#109-130的替代klh缀合的肽。因此，尽管在噬菌体展示抗体选择中使用经修饰的his-迷路蛋白，但是在biacore结合测量中还包括合成肽以确保最佳的候
选抗体选择。
[0243]
对于噬菌体elisa，将his-迷路蛋白涂覆在elisa板上(4℃过夜)。将每个待测试的噬菌体的等分试样添加到相应的孔中(在37℃下孵育30-90min)，然后用pbs充分洗涤。通过与hrp缀合的抗m13抗体一起孵育来检测噬菌体结合的抗原。
[0244]
随后，通过胺偶联将纯化的蛋白质迷路蛋白抗原(his-迷路蛋白和合成肽)固定在cm5芯片上用于biacore测量。将各种浓度的纯化的抗体前导变体(选自噬菌体文库)注入系统中，以评价抗体-抗原相互作用的缔合和解离。根据制造商的方案(biacore,inc.，新泽西州皮斯卡特维)在biacore1000仪器上进行抗体亲和力测量。根据不同克隆的测得亲和力彼此之间的接近程度，将最终筛选和生长的前三个候选物储存，并且使用体外筛选进一步评价最高亲和力候选物。
[0245]
如图1a和图1b所示，使用his标记的迷路蛋白进行克隆和表达的蛋白质(克隆x373 scfv；图1b)和亲本mca 44-3a6抗体(图1a)的初始结合测定。测得x373 scfv的解离常数(kd)是亲本mca 44-3a6抗体的约四分之一。具体地，测得x373 scfv的kd是4.8x10-7
m，并且测得mca 44-3a6的kd是1.17x10-7
m。
[0246]
修改以上描述的开发策略，产生fab形式的另外的文库。通过筛选鉴定出fab(x509fab)，随后使用以上详述的biacore方法评估其对his-迷路蛋白和klh缀合的迷路蛋白衍生的肽的亲和力。x509fab的亲和力测量报告于表5中。表5.x509fab的亲和力测量。 kon/sekoff/sekd(m)his-迷路蛋白3.23e 04/8262.58e-03/3.89e-058.0e-8klh缀合的迷路蛋白衍生的肽5.48e 04/12601.28e-03/3.19e-052.33e-8
[0247]
随后测试x509fab识别腺癌细胞中天然迷路蛋白的能力。使用a549异种移植肿瘤切片的连续切片(约6μm厚)在几乎相同的环境中比较x509fab与亲本mca 44-3a6抗体。随后使用标准abc方法(vector laboratory，加利福尼亚州伯林盖姆)，用适当的第二抗体(hrp缀合的山羊抗小鼠或抗人igg)和dab使暴露于10μg/ml的抗体(或无第一抗体)的组织切片显影。结果(未示出)证明，x509fab与天然迷路蛋白结合，并且在识别癌细胞上的表位(迷路蛋白)的能力上至少等于亲本抗体。
[0248]
为了确定x509fab的阳性细胞结合结果是否代表对迷路蛋白的特异性识别，用wi39正常人成纤维细胞(阴性对照)和a549肺腺癌细胞(阳性对照)裂解物进行标准的蛋白质免疫印迹法。在迷路蛋白的预期大小(约40kd)下看到清晰的条带，然而在阴性对照中没有获得信号(图2)。与使用mca 44-3a6的先前结果一样，存在模糊的较低条带(分解产物)和较高条带(约80kd)(证实迷路蛋白的自聚集)(图2)。
[0249]
源自抗迷路蛋白抗体(mca 44-3a6)的scfv和fab对his-迷路蛋白和klh缀合的迷路蛋白衍生的肽的亲和力测量的总结示于表6中。表6.x373 scfv和x509fab的亲和力测量。 his-迷路蛋白klh缀合的迷路蛋白衍生的肽mca 44-3a6117nmn/ax373scfv479nm277nmx509fab80nm23nm