重组菌和表达酮还原酶的方法与流程

1.本技术涉及酶技术领域，具体涉及重组菌和表达酮还原酶的方法。


背景技术：

2.大肠杆菌作为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统，具有结构简单、生长速度快且易于培养、遗传背景明确、便于基因操作等优点。虽然大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。
3.这归因于每种基因都具有独特的结构、mrna的稳定性和翻译速度、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和大肠杆菌的密码子偏好性的差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等。
4.因此应用大肠杆菌表达系统表达异源蛋白在实际应用中就或多或少地面临着上述的一些困难，其中最常见的是目的蛋白形成不溶性的包涵体，这为后续的研究工作带来了许多不便。包涵体的形成可能是由于新生肽链不能在正确位置形成二硫键，从而导致二硫键错配进而错误折叠的结果[anna mitraki，bentley fane，*cameron haase-petjingell et al.global suppression of protein folding defects and inclusion body formation[j].science.1991：253(5015)：54-58.]。而分子伴侣能够帮助蛋白正确折叠，提高蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成。pfeffer等[jan pfeffer，monika rusnak，carl-erik hansen，et al.functional expression of lipase a from candida antarctica in escherichia coli-a prerequisite for high-throughput screening and directed evolution[j].journal of molecular catalysis b：enzymatic 45(2007)：62-67.]在大肠杆菌表达目的蛋白的同时表达分子伴侣蛋白提高了目的蛋白的可溶性表达比例。这种与分子伴侣共表达以提高可溶性目的蛋白的方法，越来越成为研究者们的关注重点。
[0005]
中国专利申请cn110499312a公开了一种提高酶的可溶性表达的标签及方法，并且中国专利申请cn112812191a公开了一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用。然而，这些通用策略并非针对所有酶都有效。针对酮还原酶，本领域还没有公开一种已证明可行的提高其可溶性表达的方法。
[0006]
本领域仍然需要寻找一种能提高酮还原酶的可溶性表达的方法。


技术实现要素：

[0007]
为解决上述技术问题，本技术的一个方面提供一种重组菌，其包含分子伴侣载体并表达酮还原酶，所述分子伴侣载体包括pgro7载体。
[0008]
本发明的另一个方面提供了一种表达酮还原酶的方法，所述方法包括：
[0009]
a.提供一种重组菌，其包含分子伴侣载体并表达酮还原酶，所述分子伴侣载体包括pgro7载体；
[0010]
b.培养所述重组菌；和
[0011]
c.在较低温度下诱导所述重组菌以表达所述酮还原酶。
附图说明
[0012]
下面结合附图更详细地说明本技术，附图中：
[0013]
图1是显示本技术的一个实施方式的酮还原酶
‑‑‑
pgro7重组菌在37℃培养至od达到0.6时添加0.1mm的iptg，20℃发酵16h的过程中蛋白质表达概况的凝胶电泳图，其中：m是蛋白质分子量标准marker，1是诱导0h后的全细胞，2是诱导16h后的全细胞，3是诱导16h后的上清，4是诱导16h后的沉淀。
[0014]
图2是显示本技术的一个实施方式的酮还原酶
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pgro7重组菌在37℃培养至od达到0.3时添加0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加0.1mm的iptg，20℃发酵12h的过程中蛋白质表达概况的凝胶电泳图，其中：m是蛋白质分子量标准marker，1-5分别为诱导表达0h，3h，6h，9h，12h的全细胞，6是诱导12h后的上清，7是诱导12h后的沉淀。
[0015]
图3是显示本技术的一个实施方式的酮还原酶
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pgro7重组菌在37℃培养至od达到0.3时添加0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加0.1mm的iptg，25℃发酵16h的过程中蛋白质表达概况的凝胶电泳图，其中：m是蛋白质分子量标准marker，1-5分别为诱导表达0h，4h，8h，12h，16h的全细胞，6是诱导16h后的上清，7是诱导16h后的沉淀。
[0016]
图4是显示酮还原酶
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pkje7重组菌在37℃培养至od达到0.3时添加0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加0.1mm的iptg，20℃发酵17h的过程中蛋白质表达概况的凝胶电泳图，其中：m是蛋白质分子量标准marker，1是诱导0h后的全细胞，2是诱导17h后的全细胞，3是诱导17h后的上清，4是诱导17h后的沉淀。
[0017]
图5是显示酮还原酶
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pg-tf2重组菌在37℃培养至od达到0.3时添加0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加0.1mm的iptg，20℃发酵17h的过程中蛋白质表达概况的凝胶电泳图，其中：m是蛋白质分子量标准marker，1是诱导0h后的全细胞，2是诱导17h后的全细胞，3是诱导17h后的上清，4是诱导17h后的沉淀。
[0018]
图6是显示酮还原酶
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pg-kje8重组菌在37℃培养至od达到0.3时添加0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加0.1mm的iptg，20℃发酵18h的过程中蛋白质表达概况的凝胶电泳图，其中：m是蛋白质分子量标准marker，1是诱导0h后的全细胞，2是诱导18h后的全细胞，3是诱导18h后的上清，4是诱导18h后的沉淀。
[0019]
图7是显示酮还原酶
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ptf16重组菌在37℃培养至od达到0.3时添加0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加0.1mm的iptg，20℃发酵18h的过程中蛋白质表达概况的凝胶电泳图，其中：m是蛋白质分子量标准marker，1是诱导0h后的全细胞，2是诱导18h后的全细胞，3是诱导18h后的上清，4是诱导18h后的沉淀。
[0020]
图8是实施例3的方法(1)转化后的4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的高效气相色谱法图谱。t＝7.687处峰为目标化合物4-氯-3-羟基-丁酸乙酯。
具体实施方式
[0021]
本技术涉及一种重组菌，其包含分子伴侣载体并表达酮还原酶，该分子伴侣载体包括pgro7载体。在本技术的一个实施方式中，pgro7载体表达pgro7融合标签。表达酮还原酶的重组菌市售可得。在本技术的一个实施方式中，通过转染编码酮还原酶的质粒来获得
表达酮还原酶的重组菌。在本技术的一个实施方式中，酮还原酶来自赤红球菌(rhodococcus ruber)株sd3。在本技术的一个优选实施方式中，酮还原酶的氨基酸序列如seq id no：2所示。在本技术的一个优选实施方式中，编码酮还原酶的核苷酸序列如seq id no：1所示。在本技术中，重组菌可以是任何适合表达酮还原酶的宿主菌。在本技术的一个实施方式中，所述重组菌包括大肠杆菌。在本技术的一个优选实施方式中，大肠杆菌包括大肠杆菌bl21(de)3。在本技术的一个优选实施方式中，大肠杆菌包括大肠杆菌bl21(de)3 rhodococcus ruber株sd3。
[0022]
本技术还涉及一种表达酮还原酶的方法。该方法包括：提供一种重组菌，其包含分子伴侣载体并表达酮还原酶，该分子伴侣载体包括pgro7载体。在本技术的一个实施方式中，该重组菌是前述的重组菌。
[0023]
本技术的表达酮还原酶的方法还包括：培养重组菌。在本技术中，重组菌在本领域已知的任何合适培养基中培养。在本技术的一个实施方式中，培养基包括m9培养基。
[0024]
本技术的表达酮还原酶的方法还包括：在较低温度下诱导所述重组菌以表达所述酮还原酶。在本技术中，较低温度是指比重组菌的最优生长温度低的温度。例如，对于大肠杆菌，较低温度是指低于37℃的温度。在本技术的一个实施方式中，较低温度为10-35℃。在本技术的一个优选实施方式中，较低温度为15-30℃。在本技术的一个优选实施方式中，较低温度为20-25℃。在本技术的一个实施方式中，诱导持续5-50小时。在本技术的一个优选实施方式中，诱导持续10-20小时。在本技术的一个优选实施方式中，诱导持续12-16小时。在本技术中，可以任意合适的手段诱导重组菌以表达酮还原酶。在本技术的一个实施方式中，编码酮还原酶的基因在诱导型表达载体上。在本技术的一个实施方式中，诱导包括使用诱导剂。在本技术中，诱导剂可以是能诱导酮还原酶表达的任意诱导剂。在本技术的一个优选实施方式中，诱导剂包括以下的一种或多种：阿拉伯糖和iptg。在本技术的一个实施方式中，诱导包括在特定培养阶段加入诱导剂。在本技术的一个实施方式中，诱导包括：(1)培养od达到0.2-0.4，优选0.25-0.35，更优选约0.3时，添加阿拉伯糖；和(2)培养od达到0.5-0.7，优选0.55-0.65，更优选约0.6时，添加iptg。在本技术的一个优选实施方式中，(1)包括添加0.1-0.5mg/ml的阿拉伯糖。在本技术的一个优选实施方式中，(1)包括添加0.15-0.3mg/ml的阿拉伯糖。在本技术的一个优选实施方式中，(1)包括添加约0.2mg/ml的阿拉伯糖。在本技术的一个优选实施方式中，(2)包括添加0.05-0.3mmol/l的iptg。在本技术的一个优选实施方式中，(2)包括添加0.08-0.15mmol/l的iptg。在本技术的一个优选实施方式中，(2)包括添加约0.1mmol/l的iptg。在本技术的一个实施方式中，诱导可包括在不同温度下的多个诱导过程。在本技术的一个实施方式中，(1)和(2)的添加在第一温度下进行，并且在(2)的添加完成后将温度调整至第二温度。在本技术的一个实施方式中，第一温度高于第二温度。在本技术的一个实施方式中，第一温度是重组菌的最优生长温度，例如约37℃。在本技术的一个实施方式中，第二温度是上述的较低温度。在本技术的一个优选实施方式中，(1)和(2)的添加是在约37℃下进行的，并且在(2)的添加完成后将温度降低至20-25℃，并诱导持续12-16小时。
[0025]
下面将结合附图对本技术的技术方案进行清楚、完整的表述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例都属于本技术保护的范
围。
[0026]
实验材料
[0027]
大肠杆菌bl21(de)3感受态细胞：购买自天根，货号cb105。酮还原酶基因来源于赤红球菌(rhodococcus ruber)sd3，具体基因序列见附录seq id no：1。
[0028]
lb液体培养基(g/l)：胰蛋白胨：10，酵母提取物：5，氯化钠：10。
[0029]
od检测方法：将菌液稀释合适的倍数，于紫外分光光度计的吸光度600处，测量数据。
[0030]
pgro7质粒：购买自takara，cat.#9122。
[0031]
pg-kje8质粒：购买自takara，cat.#9121。
[0032]
pkje7质粒：购买自takara，cat.#9123。
[0033]
pg-tf2质粒：购买自takara，cat.#9124。
[0034]
ptf16质粒：购买自takara，cat.#9125。
[0035]
marker：购买碧云天，cat.p0060m。
[0036]
34mg/ml氯霉素：称取1.7g氯霉素溶于40ml的无水乙醇中，定容至50ml。
[0037]
lb固体培养基(g/l)：胰蛋白胨：10，酵母提取物：5，氯化钠：10，琼脂：20。
[0038]
m9培养基(g/l)：k2hpo4：12.5，kh2po4：6.25，酵母提取物：6.67，(nh4)2so4：1.76，甘油：1，ppg2000(antifoam)：0.2，mgso4：0.26，cacl2：0.023，微量元素：1。
[0039]
200mm磷酸盐缓冲液(ph 7.0)：称取35.81g na2hpo4·
12h2o，加去离子水定容至500ml，称取7.8g nah2po4·
2h20，加去离子水定容至500ml，两者以62∶38的比例混合，ph调至7.0。
[0040]
sds page凝胶电泳方法：
[0041]
(1)配制适量1
×
sds-page hepes电泳缓冲液(20
×
beyogel
tm plus sds-page hepes电泳缓冲液加超纯水稀释；内液需现用现配；外液可重复使用10次左右)。
[0042]
(2)取出胶板，短板向里固定于胶板卡槽中，然后将胶板卡槽放入电泳槽支架上。
[0043]
(3)倒入适量配制好的缓冲液至电泳槽中，其中，内槽缓冲液须在短胶板之上，外槽缓冲液的量可根据电泳槽上的指示加入。
[0044]
(4)小心拔去梳子。
[0045]
(5)将1ml菌液12000rpm离心3min后，用0.9％nacl清洗离心，留细胞，再用1ml 0.9％nacl重悬细胞，得到全细胞样品。将1ml菌液12000rpm离心3min后，用0.9％nacl清洗离心，留细胞，再用1ml 0.9％nacl重悬细胞，进行超声破碎(200w，破1s，停2s，10min)后，12000rpm离心3min后，吸取上清保存，得上清样品，同时，离心留下的破碎液沉淀用1ml 0.9％nacl洗涤，离心，最后用1ml0.9％nacl重悬沉淀，得到沉淀样品。
[0046]
(6)上样；样品均取用10μl；marker：6μl。
[0047]
(7)加样完毕后，盖上电泳槽的盖，连接电泳仪(红对红，黑对黑)。
[0048]
(8)开始电泳，电泳程序可根据胶板指示进行。
[0049]
(9)当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处停止电泳。
[0050]
(10)电泳结束后，关闭电源，取出胶板。
[0051]
(11)轻轻撬开胶板，将胶转移至显色液中，显色液没过胶即可。
[0052]
(12)将其放到摇床上，设置程序为：100r/min，15min。
[0053]
(13)回收显色液，适量清水轻轻冲洗胶两次。
[0054]
(14)拍照及照片处理。
[0055]
名称厂商货号/规格mgcl2上海泰坦科技股份有限公司arcacl2上海埃彼化学试剂有限公司arnacl上海实验试剂有限公司ar甘油国药集团化学试剂有限公司625gm卡那霉素生工生物工程(上海)股份有限公司kb0286氯霉素生工生物工程(上海)股份有限公司cb0118iptgbeyotimest098阿拉伯糖beyotimest14204-氯乙酰乙酸乙酯sigma-aldrichgc异丙醇sigma-aldrichlcnadpsigma-aldrich25g气相色谱shimadzugc-2030离心机上海丛融仪器有限公司md80r发酵罐赛思柏欧prolab d型超净台泰事达aeolus v6金属浴赛默飞crs10恒温箱维根技术(北京)有限公司wh-05培养箱上海丛融仪器有限公司isf-1-xsmx1503破碎机宁波新芝生物科技股份有限公司scientz-950e
[0056]
实施例1
[0057]
重组菌的构建
[0058]
(1)感受态细胞的制备
[0059]
挑取酮还原酶单菌入10ml含有终浓度50ug/ml的卡那抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，后再将酮还原酶菌株接入到lb液体培养基中，37℃培养至od为0.4-0.6，然后置于冰上20min。分装成50ml的液体进行4000rpm，4℃离心15min，留沉淀。用100mm的mgcl2重悬，3000rpm，4℃离心15min，留沉淀。继续用100mm cacl2重悬，冰浴20min后，3000rpm，4℃离心15min。先用85mm cacl2的15％的甘油洗涤细胞，2500rpm，4℃离心15min，最后用85mm cacl2的15％的甘油重悬细胞，制得酮还原酶感受态细胞。
[0060]
(2)转化
[0061]
在超净台中用无菌的吸头吸取50ul的酮还原酶感受态细胞与5ul的pgro7或pg-kje8或pkje7或pg-tf2或ptf16质粒于预冷的ep管内，冰浴30min，用金属浴42℃热激2min后立即转入冰浴中15min，随后加入700ul的lb培养基，37℃恒温箱震荡培养1h。吸取200ul的液体涂布于含抗生素的lb固体培养基上，置于37℃培养箱中过夜培养。分别得到含有酮还原酶
‑‑‑
pgro7重组菌、酮还原酶
‑‑‑
pg-kje8重组菌、酮还原酶
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pkje7重组菌、酮还原酶
‑‑‑
pg-tf2重组菌、和酮还原酶
‑‑‑
ptf16重组菌的单菌落的lb固体培养基。
[0062]
实施例2
[0063]
酮还原酶
‑‑‑
pgro7重组菌的低温诱导表达(一)
[0064]
挑取实施例1中所得的酮还原酶
‑‑‑
pgro7重组菌的单菌落入lb液体培养基中，37℃过夜活化，按1％的吸取量将种子液接入m9培养基中，37℃培养至od达到0.6时添加终浓度为0.1mm的iptg，20℃发酵16h后，离心收集菌体及破碎细胞。细胞破碎15min，收集包涵体。目的蛋白的分子量为35.2kda。表达结果见图1。上清中目的蛋白含量较低，可溶性表达较差。
[0065]
实施例3
[0066]
酮还原酶
‑‑‑
pgro7重组菌的低温诱导表达(二)
[0067]
(1)20℃培养及诱导12h
[0068]
挑取实施例1中所得的酮还原酶
‑‑‑
pgro7重组菌的单菌落入lb液体培养基中，37℃过夜活化，按1％的吸取量将种子液接入m9培养基中，37℃培养至od达到0.3时，添加终浓度为0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加终浓度为0.1mm的iptg，20℃发酵12h后，离心收集菌体及破碎细胞。细胞破碎15min，收集包涵体。目的蛋白的分子量为35.2kda。表达结果见图2。目的蛋白在上清液(即粗酶液)中含量较高，可溶性表达较好。
[0069]
(2)25℃培养及诱导16h
[0070]
挑取实施例1中所得的酮还原酶
‑‑‑
pgro7重组菌的单菌落入lb液体培养基中，37℃过夜活化，按1％的吸取量将种子液接入m9培养基中，37℃培养至od达到0.3时，添加终浓度为0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加终浓度为0.1mm的iptg，25℃发酵16h后，离心收集菌体及破碎细胞。细胞破碎15min，收集包涵体。目的蛋白的分子量为35.2kda。表达结果见图3。目的蛋白在上清液中含量较高，可溶性表达较好。
[0071]
实施例4
[0072]
酮还原酶
‑‑‑
pkje7重组菌的低温诱导表达
[0073]
挑取实施例1中所得的酮还原酶
‑‑‑
pkje7重组菌的单菌落入lb液体培养基中，37℃过夜活化，按1％的吸取量将种子液接入m9培养基中，37℃培养至od达到0.3时，添加终浓度为0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加终浓度为0.1mm的iptg，25℃发酵17h后，离心收集菌体及破碎细胞。细胞破碎15min，收集包涵体。目的蛋白的分子量为35.2kda。表达结果见图4。目的蛋白整体可溶性表达较少。
[0074]
实施例5
[0075]
酮还原酶
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pg-tf2重组菌的低温诱导表达
[0076]
挑取实施例1中所得的酮还原酶
‑‑‑
pg-tf2重组菌的单菌落入lb液体培养基中，37℃过夜活化，按1％的吸取量将种子液接入m9培养基中，37℃培养至od达到0.3时，添加终浓度为0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加终浓度为0.1mm的iptg，25℃发酵17h后，离心收集菌体及破碎细胞。细胞破碎15min，收集包涵体。目的蛋白的分子量为35.2kda。表达结果见图5。目的蛋白整体可溶性表达较少。
[0077]
实施例6
[0078]
酮还原酶
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pg-kje8重组菌的低温诱导表达
[0079]
挑取实施例1中所得的酮还原酶
‑‑‑
pg-kje8重组菌的单菌落入lb液体培养基中，37℃过夜活化，按1％的吸取量将种子液接入m9培养基中，37℃培养至od达到0.3时，添加终浓度为0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加终浓度为0.1mm的iptg，25℃发
酵18h后，离心收集菌体及破碎细胞。细胞破碎15min，收集包涵体。目的蛋白的分子量为35.2kda。表达结果见图6。目的蛋白整体可溶性表达较少。
[0080]
实施例7
[0081]
酮还原酶
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ptf16重组菌的低温诱导表达
[0082]
挑取实施例1中所得的酮还原酶
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ptf16重组菌的单菌落入lb液体培养基中，37℃过夜活化，按1％的吸取量将种子液接入m9培养基中，37℃培养至od达到0.3时，添加终浓度为0.2mg/ml的阿拉伯糖继续培养，至od达到0.6时添加终浓度为0.1mm的iptg，25℃发酵18h后，离心收集菌体及破碎细胞。细胞破碎15min，收集包涵体。目的蛋白的分子量为35.2kda。表达结果见图7。目的蛋白整体可溶性表达较少。
[0083]
由实施例4-7的结果可知，并非任意分子伴侣载体都可提高酮还原酶的可溶表达。
[0084]
实施例8
[0085]
酮还原酶
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pgro7重组菌粗酶液的催化反应：
[0086]
(1)100mg的底物(4-氯乙酰乙酸乙酯)，加4.4g异丙醇溶解混匀。
[0087]
(2)20mg的实施例3的方法(1)的酮还原酶
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pgro7破碎细胞粗酶液与20mg的nadp入到2.5ml的200mm磷酸盐缓冲液中，25℃条件下温浴。
[0088]
(3)将底物混合液加入到酶液混合液中，25℃条件下反应2小时，取样，气相色谱分析。经气相色谱检测，2小时的转化率为100％。如图8显示，t＝7.687处峰为目标化合物4-氯-3-羟基-丁酸乙酯。
[0089]
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0090]
1.本发明首次发现将酮还原酶与pgro7载体组合能够实现酮还原酶的可溶表达，获得了针对酮还原酶的有效可溶表达方案；
[0091]
2.通过在较低温度下诱导包含分子伴侣载体并表达酮还原酶的重组菌可以实现酮还原酶可溶表达的大幅改善，并显著减少包涵体的形成，同时保留完全酶活性。
[0092]
以上仅是本技术的具体应用范例，对本技术的保护范围不构成任何限制。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本技术权利保护范围之内。