一种内质网靶向型荧光碳量子点及其制备方法和应用

1.本发明涉及荧光纳米材料技术领域，具体涉及到一种内质网靶向型荧光碳量子点及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细胞内各种细胞器相互协作，紧密联系以维持正常的细胞生理活动，其中内质网(endoplasmic reticulum,er)作为真核细胞重要的细胞器之一，主要参与多种蛋白质、脂类及胆固醇类物质的合成和分泌，此外，还负责存储ca
2
，维持钙离子的平衡，是细胞中重要的代谢场所。然而当细胞中出现错误蛋白或未折叠蛋白过度堆积时，就会引发内质网的应激反应。在应激条件下，内质网的完整性以及相关活性物的指标将会受到影响，进而导致神经退行性疾病、癌症、人体炎症、代谢紊乱等疾病。因此，设计靶向内质网荧光探针，用以监测内质网形态变化，对于相关疾病的研究具有至关重要的意义。
3.目前市售的有机小分子荧光探针，虽然靶向效果好，但存在售价昂贵，抗光漂白性差的问题。碳点(cds/cqds)作为一种新型的荧光纳米材料，与有机小分子荧光探针相比，具有合成方法简单，廉价易得，毒性小，染色过程简单，抗光漂白能力强等优点。目前，有细胞器靶向成像的碳点被报道，如图1(其中，图1a.acds和lcds的合成路线；b.acds与细胞器探针在mcf-7细胞中共定位成像；c.lcds与细胞器探针在mcf-7细胞中共定位成像。(acds和lcds均为蓝色通道，ex/em＝405nm/420-500nm；溶酶体、线粒体、内质网和高尔基体细胞器探针均为红色通道，ex/em＝559nm/570-640nm))所示，以柠檬酸和尿素为原料，通过水热法，透析纯化得到表面有羧基官能团的碳点(acds)，然后通过酰胺缩合将十二胺修饰到acds表面，得到了十二胺功能化碳点(lcds)。在共定位实验中，通过激光共聚焦显微镜观察，acds和lcds分别能对细胞的溶酶体和内质网靶向成像。现有的细胞器靶向碳点主要作用于溶酶体、线粒体和高尔基体，用于内质网靶向成像的碳点很少。此外，这些cds的荧光发射波长较短(450-550nm)，在生物成像中容易被细胞本身的背景荧光干扰，实际应用受限。因此，开发一种具有长荧光发射波长的碳点用于内质网靶向成像是非常有意义的。


技术实现要素：

4.针对上述的不足，本发明的目的是提供一种内质网靶向型荧光碳量子点(以下简称“碳点”)及其制备方法和应用，该荧光碳点具有持续内质网靶向成像能力，能够缩短细胞染色时间，提高染色效率；可有效解决现有技术中存在的如下问题：1)碳点发射波长较短(420nm-500nm)，易与细胞背景荧光重叠，产生干扰；2)商售染料细胞染色时间长；3)细胞内质网商售染料抗光漂白性差。
5.为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
6.本发明提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤(1)：将芳香胺溶解于醇类有机溶剂中得反应液；
8.步骤(2)：将步骤(1)所得反应液于100～220℃温度下反应2～24h，分离纯化，制得
内质网靶向型荧光碳量子点。
9.进一步地，步骤(1)中醇类有机溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和二丙二醇中的至少一种；优选为乙醇。
10.进一步地，步骤(1)中芳香胺包括邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、苯胺和1,3,5-三氨基苯中的至少一种；优选为间苯二胺、对苯二胺和1,3,5-三氨基苯中的至少一种；更优选为对苯二胺。
11.进一步地，步骤(1)反应液中芳香胺的质量浓度为1～30mg/ml；优选为5～20mg/ml。
12.进一步地，步骤(2)中反应温度优选为120～200℃；更优选为180℃。
13.进一步地，步骤(2)中反应时间优选为4～10h；更优选为10h。
14.进一步地，步骤(2)中分离纯化的方式为柱层析分离，洗脱液参数为：二氯甲烷:甲醇＝50:1(v/v)。
15.本发明还提供上述制备方法得到的内质网靶向型荧光碳量子点。
16.本发明还提供上述内质网靶向型荧光碳量子点在光电器件、生物成像、检测器件和传感器件中的应用。
17.本发明还提供上述内质网靶向型荧光碳量子点在用作和/或制备内质网靶向成像制剂、用作和/或制备荧光探针中的应用。
18.一种内质网靶向成像制剂，包括上述内质网靶向型荧光碳量子点。
19.一种荧光探针，包括上述内质网靶向型荧光碳量子点。
20.综上所述，本发明具有以下优点：
21.1、本发明提供一种具有长荧光发射波长的内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，相比于现有市售的内质网荧光染料(价格昂贵，20μl售价在千元以上)，通过以廉价的如对苯二胺等芳香胺为前驱体，一步即可制备得到内质网靶向的荧光碳点，缩短了制备时间，极大地降低了原料及人工成本。
22.2、相比于现有市售的内质网荧光染料(抗光漂白性极差、无法实现激光显微镜下实时监测内质网状态，且染色时间一般为15min)，本发明中的荧光碳点具有优异的抗光漂白性，在持续的激光激发下，仍能保持较强的荧光发射，可以用于实时追踪内质网状态。另外，该碳点在490nm的激发波长下，最强荧光发射波长为620nm，斯托克斯位移大、发射波长较长，能有效避免细胞背景荧光的干扰；本发明中的荧光碳点只需要染色2min，即能清楚地观察到内质网形态，极大地缩短了染色时间，最大程度地保证了细胞活性。
附图说明
23.图1为现有技术中报道的acds和lcds的合成路线以及共定位成像图；
24.图2为本发明中实施例1所得荧光碳点的合成示意图；
25.图3为本发明所得内质网靶向型荧光碳量子点的光学性质测定结果图；图3中(a)碳点水溶液在不同激发波长下的荧光发射光谱；(b)碳点的紫外吸收光谱；(c)碳点在不同ph的pbs缓冲液中的荧光发射；
26.图4为本发明所得内质网靶向型荧光碳量子点的红外光谱图；
27.图5为本发明所得内质网靶向型荧光碳量子点的x射线光电子能谱图；其中，a.x射
线光电子能谱总图；b.c1s的x射线光电子能谱图；c.n1s的x射线光电子能谱图；d.o1s的x射线光电子能谱；
28.图6为本发明中所得内质网靶向型荧光碳量子点的高分辨透射电镜图和粒径分布图；图6中(a)为高分辨透射电镜图，(b)为粒径分布图；
29.图7为本发明中所得内质网靶向型荧光碳量子点的不同细胞中的毒性结果；
30.图8为不同种类细胞中，本发明中所得内质网靶向型荧光碳量子点与商售染料对内质网成像的对比情况；
31.图9为本发明中不同染色浓度和不同染色时长下内质网靶向型荧光碳量子点对内质网的成像结果；图9中a.染色浓度为20，15，10，5μg/ml的条件下，碳点对内质网的成像结果；b.染色时长为10，5，2min条件下，碳点对内质网的成像结果；
32.图10为以苯二酚为前驱体制备的碳点与hepg2细胞共孵，共聚焦显微镜成像结果。
具体实施方式
33.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
34.因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1
36.本例提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
37.步骤(1)：将对苯二胺溶解于无水乙醇中得反应液；其中，对苯二胺质量浓度为5mg/ml；
38.步骤(2)：将步骤(1)所得反应液转移至聚四氟乙烯不锈钢反应釜(100ml)中，于180℃温度下反应10h；反应结束后减压旋蒸除去溶剂，柱层析干法上样，分离(二氯甲烷:甲醇＝50:1，v/v)得到最终产品-内质网靶向型荧光碳量子点。
39.实施例2
40.本例提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，与实施例1的区别仅在于：步骤(1)中对苯二胺质量浓度为20mg/ml，步骤(1)中醇类有机溶剂为异丙醇，步骤(2)中反应温度为120℃，步骤(2)中反应时间为24h；其余步骤及参数均相同。
41.实施例3
42.本例提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，与实施例1的区别仅在于：步骤(1)中对苯二胺调整为质量浓度为10mg/ml的间苯二胺，步骤(1)中醇类有机溶剂为二丙二醇，步骤(2)中反应温度为220℃，步骤(2)中反应时间为2h；其余步骤及参数均相同。
43.对比例1
44.本例提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，与实施例1的区别仅在于：将步骤(1)中对苯二胺调整为苯二酚；其余步骤及参数均相同。
45.对比例2
46.本例提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，与实施例1的区别仅在于：将步骤(1)中对苯二胺调整为萘二酚；其余步骤及参数均相同。
47.对比例3
48.本例提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，与实施例1的区别仅在于：将步骤(1)中醇类有机溶剂调整为去离子水；其余步骤及参数均相同。
49.对比例4
50.本例提供一种内质网靶向型荧光碳量子点的制备方法，与实施例1的区别仅在于：将步骤(1)中醇类有机溶剂调整为甲酰胺；其余步骤及参数均相同。
51.实验例
52.1-光学性质的测定
53.本例对实施例1～3所得产品-内质网靶向型荧光碳量子点进行光学性质的测定。将实施例1～3所得产品分别溶于无水乙醇，配成1mg/ml母液a1(实施例1)、a2(实施例2)、a3(实施例3)和5mg/ml母液b1(实施例1)、b2(实施例2)、b3(实施例3)。取10μl母液a1、a2和a3分散于990μl去离子水中，测定吸收光谱和紫外荧光光谱。取10μl母液b1、b2和b3分散于990μl不同ph的pbs缓冲液中，测定碳点在不同ph下的荧光发射光谱。实施例1的测试结果如图3所示，图3中(a)碳点水溶液在不同激发波长下的荧光发射光谱，其中7条曲线从上至下依次代表为520nm、510nm、530nm、500nm、480nm、470nm和460nm激发波长下的测试结果；(b)碳点的紫外吸收光谱；(c)碳点在不同ph的pbs缓冲液中的荧光发射，其中5条曲线从上至下依次代表为ph＝7、ph＝8、ph＝6、ph＝5和ph＝4的pbs缓冲液中的测试结果。另外，碳点的绝对量子产率(在490nm激发波长下，扣除空气背景和溶剂背景干扰后测定)分别为35.78％(实施例1)、38.67％(实施例2)和34.51％(实施例3)。
54.2-结构表征
55.本例在1-光学性质的测定实验的基础上对所得内质网靶向型荧光碳量子点进行结构表征。取10μl母液a1、a2和a3分散于990μl去离子水中，滴加到透射电镜专用超薄碳膜上，干燥后用高分辨透射电镜观察其形貌；通过x射线光电子能谱和红外吸收光谱对碳点的化学结构进行表征，结果表明碳点表面存在c＝o/c＝n，c-c/c＝c，c-o/c-n，n-h键等。其中，实施例1的测试结果如图4、图5和图6所示。图4为碳点的傅里叶转换红外吸收光谱图，其中3341cm-1
,2930cm-1
，1618cm-1
，1236cm-1
，1132cm-1
分别表示n-h/o-h，c-h，c＝n/c＝o，c-n，c-o的红外特征吸收峰。图5为碳点的x射线光电子能谱图，其中a为x射线光电子能谱总图，位于285ev的峰归属于碳元素，399ev的峰归属于氮元素，531ev的峰归属于氧元素；b为c1s的x射线光电子能谱图，键能为284.8ev的峰为归属于c-c/c＝c的峰，285.5ev的峰为归属于c-o/c-n的峰，288.4ev的峰为归属于c＝o的峰；c为n1s的x射线光电子能谱图，c图中键能为398.5ev的峰为归属于c＝n的峰，399.6ev的峰为归属于n-h的峰，400.3ev的峰为归属于c-n的峰；d为o1s的x射线光电子能谱，键能为531.7ev的峰为归属于c＝o的峰，533ev的峰为归属于c-o的峰。图6为高分辨透射电镜图片以及粒径分布图，图6中(a)为高分辨透射电镜图，(b)为粒径分布图。
56.3-细胞毒性
57.本例考察所得内质网靶向型荧光碳量子点的细胞毒性。在96孔板中分别接种人体正常肝细胞hl-7702、肝癌细胞hepg2、小鼠黑色素瘤细胞b16，每孔1
×
104个细胞，培养24h
后，将原本100μl培养基换成含不同浓度的实施例1所得的荧光碳点的培养基(0、5、10、20、40、60、80μg/ml)，共培养24h。弃去含有碳点的培养基，每孔加入100μl含10％cck-8的无血清培养基，37℃孵化30min，用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度值。根据下面公式计算：
58.细胞相对存活率(％)＝(od
450
样品/od
450
对照)
×
100％
59.其中，od为5个平行样所测得的平均值。
60.本例测试结果如图7所示，结果表明：当材料浓度在成像浓度20μg/ml时，三种细胞的存活率能保持70％以上，表现出较低细胞毒性。可见制备得到的碳点具有较好的生物相容性，能应用于生物体内成像。
61.4-内质网定位
62.本例在1-光学性质的测定实验所得的母液b1的基础上，在共聚焦小皿中接种hl-7702、hepg2、b16和宫颈癌细胞hela，培养24h。弃去原本培养基，加入1ml含有4μl母液b1的无血清培养基，在37℃培养箱中共培养10min，然后加入pbs溶液洗涤两次；再加入商售内质网染料探针er-traker-green染色20min，pbs洗涤三遍。通过激光共聚焦显微镜观察并拍照。结果如图8所示，本发明所得碳点的通道(r-cds所对应测试结果)与er-traker-green的通道(er-traker-green所对应测试结果)有很好的重叠，共定位系数达到0.93，说明本发明所得碳点能对内质网进行靶向成像。
63.5-细胞染色条件
64.测试结果如图9所示，图9中a.染色浓度为20，15，10，5μg/ml的条件下，碳点对内质网的成像结果；b.染色时长为10，5，2min条件下，碳点对的内质网的成像结果。结果表明：只需要2min的染色时间，碳点即可清晰成像内质网，观察到内质网形态；与商售染料(20min)相比，大大缩短染色时间，保证细胞活性。另外，该碳点能在低浓度(5μg/ml)下即可成像内质网。
65.本例在上述实验基础上，还将对比例1(以苯二酚为前驱体制备的碳点)、对比例2(以萘二酚为前驱体)所得碳点进行光学性质和细胞器靶向成像等实验，结果发现，以苯二酚，萘二酚为前驱体，高温碳化得到碳点不仅光学性质较差，且无细胞器靶向成像能力；以甲酰胺作溶剂(对比例4)制备得到蓝光碳点发射波长在450-500nm，这不利于碳点在生物成像方面的应用；而以去离子水(对比例3)为溶剂制备的碳点荧光弱，光学性质差。其中，对比例1(以苯二酚为前驱体制备的碳点)所得碳点与hepg2细胞共孵，共聚焦显微镜成像，测试结果如图10所示。
66.综上所述，相比于现有市售的内质网荧光染料(抗光漂白性极差、无法实现激光显微镜下实时监测内质网状态且内质网染料的染色时间一般为15min)，本发明中的内质网靶向型荧光碳量子点具有优异的抗光漂白性，在持续的激光激发下，仍能保持较强的荧光发射，可以用于实时追踪内质网状态。另外，该碳点在490nm的激发波长下，最强荧光发射波长为620nm，斯托克斯位移大、发射波长较长，能有效避免细胞背景荧光的干扰；本发明中的荧光碳点只需要染色2min，即能清楚地观察到内质网形态，极大地缩短了染色时间，最大程度地保证了细胞活性。
67.以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。