一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法与流程

1.本发明涉及雏鸟性别鉴定技术领域，尤其涉及一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法。


背景技术：

2.鸸鹋(学名：dromaius novaehollandia)又名澳洲鸵鸟，体型仅次于非洲鸵鸟。鸸鹋作为一种珍禽，因具有重要的经济价值在世界各国被广泛地养殖。鸸鹋具有很高的营养价值，含有丰富的蛋白质、维生素，血红素铁和肌酸；脂肪、胆固醇的含量较低。鸸鹋油含有大量的多不饱和脂肪酸和抗氧化剂，具有强效的抗炎、降胆固醇和透皮促渗等功效。鸸鹋因其营养价值和药用价值而备受关注，被引入世界各国大量养殖。
3.鸸鹋是雌雄同态鸟，16月龄内的鸸鹋很难通过外观等特征进行性别判定。鸸鹋性别鉴定能帮助饲养人员按照不同性别的需求提供更适合的管理和喂养。鸸鹋生长周期长、饲养成本高，性别鉴定可以缩短非目的性别个体的饲养时间，从而节省大量饲养成本。随着基因组测序和核酸检测技术的发展，pcr等分子检测技术为鸸鹋性别早期快速鉴定提供了工具。鸸鹋的性别由性染色体的组合决定，雄性鸸鹋包含两条z染色体，为zz型；雌性鸸鹋包含z和w染色体各1条，为zw型，w染色体为雌性鸸鹋所特有，通过检测z染色和w染色体的序列差异可以鉴定鸸鹋的性别。
4.现有的通过检测z染色和w染色体的序列差异鉴定鸸鹋的性别的检测方法大多是通过检测鸸鹋的血液和肉进行检测，这种方法会对鸸鹋造成伤害，同时在获取检测样本时容易造成鸸鹋对人的攻击，容易使得工作人员受伤。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法，包括以下步骤：
7.s1：在鸸鹋养殖场对鸸鹋雏鸟佩戴好标有编号的脚环标记，然后对进行采样，采取幼鸟背部和尾部羽毛5根，放入低温冷藏盒送往检测的实验室；
8.s2：将2根羽毛的根部0.5cm处剪下，然后剪碎放入装有180μl组织裂解液tl的1.5ml离心管中，加入20μl的蛋白酶k(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀，从而得到裂解物；
9.s3：将裂解物放置在55℃水浴过夜直到组织消化完全，然后加入200μl结合液cb，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟，待其自然冷却后加入100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，得到混合物；
10.s4：用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱ac中，将吸附柱放入收集管中以13000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，加入200μl抑制物去除液ir，以12000rpm离心30秒，倒掉废液，加入700μl漂洗液wb，以12000rpm离心30秒，倒掉废液，加入500μl漂洗
液wb，以12000rpm离心30秒，倒掉废液；
11.s5：将吸附柱ac放回空收集管中，以13000rpm离心2分钟，去除漂洗液，然后取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液eb，室温放置3-5分钟；
12.s6：然后以12,000rpm离心1分钟，然后丢弃吸附柱ac，保留含dna溶液的收集管，用核酸蛋白测定仪对dna进行浓度测定，从而得到提取的基因组dna，对提取的基因组dna进行包保存；
13.s7：根据鸸鹋z和w染色体的差异短序设计3条引物emu-sd1、emu-sd2和emu-sd3来区分雌雄，引物emu-sd2对应的区域仅存在于w染色体上，为雌性鸸鹋所特有，然后在引物emu-sd2区域的上游和下游各选取了一个z、w序列相同区作为引物emu-sd1和引物emu-sd2的设计区，所设计的引物emu-sd1的序列为agctgctttgctactgctttatcct，引物emu-sd2的序列为aatgagtgtctcagtactcctttg，引物emu-sd3的序列为taggaattaattactcaggtaaaac；
14.s8：然后进行pcr分反应，pcr反应体系(50μl)如下：
[0015][0016]
pcr反应条件如下：
[0017][0018]
s9：将pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离，0.5xtbe电泳缓冲液，150v，电泳40min，dna染料为na-red，紫外下拍照后将电泳条带与dl2000 dna ladder对比，出现166bp雌性特异性条带的为雌性鸸鹋，缺少166bp雌性特异性条带，包含1条409bp左右的扩增条带，为雄性鸸鹋。
[0019]
为了达到更好的采取效果，本发明的改进有，所述步骤s1中采样时，采样者需要穿戴一次性手套拔取每只鸸鹋幼鸟背部和尾部羽毛5根，每次拔羽后，需要使用手套翻转包裹羽毛，用夹子夹紧手套，然后将羽毛连同手套放入低温冷藏盒内进行存放。
[0020]
为了达到更好的使用效果，本发明的改进有，所述步骤s5中洗脱缓冲液在使用前，
可以放入65-70℃的水中进行预热。
[0021]
为了达到较好的检测效果，本发明的改进有，所述步骤s6中使用到的核酸蛋白测定仪为美国nanodrop nd-2000超微量核酸蛋白测定仪。
[0022]
为了使提取到的基因组dna能够正常保存，本发明的改进有，所述步骤s6中提取到的基因组dna需要在-20℃下进行保存。
[0023]
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于，
[0024]
本发明中，通过分析最新公布的鸸鹋基因组中z与w染色体序列差异，设计了一组性别鉴定引物，通过pcr和电泳来鉴定鸸鹋的性别，用于鉴定的样本是少量的羽毛、而非血液和肉，所以对鸸鹋没有伤害，同时也减少了在抓捕取样过程鸸鹋对人的攻击，是一种无创鉴定技，通过优化基因组dna提取方法和pcr退火温度，实现了羽毛中微量dna的提取和pcr扩增，性别鉴定引物的特异性好，用于性别鉴定的电泳条带清晰明亮，是一种准确可靠的鉴定技术。
附图说明
[0025]
图1为本发明提出一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法的三条引物及差异序列区域示意图；
[0026]
图2为本发明提出一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法的三条引物序列示意图；
[0027]
图3为本发明提出一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法的不同退火温度的鉴定结果示意图；
[0028]
图4为本发明提出一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法的性别未知的鸸鹋样品pcr结果示意图。
具体实施方式
[0029]
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0030]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0031]
实施例，请参阅图1-4，本发明提供一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法，包括以下步骤：
[0032]
s1：在鸸鹋养殖场对鸸鹋雏鸟佩戴好标有编号的脚环标记，然后对进行采样，采样时，采样者需要穿戴一次性手套拔取每只鸸鹋幼鸟背部和尾部羽毛5根，每次拔羽后，需要使用手套翻转包裹羽毛，用夹子夹紧手套，然后将羽毛连同手套放入低温冷藏盒送往检测的实验室；
[0033]
s2：将2根羽毛的根部0.5cm处剪下，然后剪碎放入装有180μl组织裂解液tl的1.5ml离心管中，加入20μl的蛋白酶k(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀，从而得到裂解物；
[0034]
s3：将裂解物放置在55℃水浴过夜直到组织消化完全，然后加入200μl结合液cb，
立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟，待其自然冷却后加入100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，得到混合物；
[0035]
s4：用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱ac中，将吸附柱放入收集管中以13000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，加入200μl抑制物去除液ir，以12000rpm离心30秒，倒掉废液，加入700μl漂洗液wb，以12000rpm离心30秒，倒掉废液，加入500μl漂洗液wb，以12000rpm离心30秒，倒掉废液；
[0036]
s5：将吸附柱ac放回空收集管中，以13000rpm离心2分钟，去除漂洗液，然后取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液eb，然后室温放置3-5分钟，洗脱缓冲液在使用前，可以放入65-70℃的水中进行预热；
[0037]
s6：然后以12,000rpm离心1分钟，然后丢弃吸附柱ac，保留含dna溶液的收集管，用美国nanodrop nd-2000超微量核酸蛋白测定仪对dna进行浓度测定，提取到的基因组dna放于-20℃保存，用作后续pcr的模板；
[0038]
s7：z鸸鹋的性别是由z和w两条性染色体的组合形式来决定，雄性为zz型，雌性为zw型。通过分析ncbi数据库2020年公开的鸸鹋z染色体序列(cm027974.1)和w染色体序列(cm027973.1)，找到了一段z和w染色体的差异短序列，设计3条引物emu-sd1、emu-sd2和emu-sd3来区分雌雄，三条引物及差异序列区域如图1所示，引物emu-sd2对应的区域仅存在于w染色体上，为雌性鸸鹋所特有。我们在引物2(emu-sd2)区域的上游和下游各选取了一个z、w序列相同区作为引物1和引物3的设计区，三条引物序列如图2所示；
[0039]
s8：然后进行pcr分反应，pcr反应体系(50μl)如下：
[0040][0041][0042]
pcr反应条件如下：
[0043][0044]
引物退火温度的选择：根据引物碱基序列，计算出3条引物的tm值为58.5℃、53.8℃和47.0℃，我们以已知性别的两只成年雄雌鸸鹋的基因组为模板，尝试了42℃和51℃两种退火温度，发现51℃扩增结果好，此外，对16只性别未知的鸸鹋基因组进行了pcr扩增。
[0045]
s9：将pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离，0.5xtbe电泳缓冲液，150v，电泳40min，dna染料为na-red，紫外下拍照后将电泳条带与dl2000 dna ladder对比，
①
不同退火温度下pcr产物电泳结果，我们以已知性别的2只鸸鹋的基因组为模板，以51℃和42℃两种退火温度分别扩增，当退火温度为51℃时，电泳结果显示雌性样本f51的扩增产物为2条带(166bp、428bp)，雄性的为1条带(409bp)，雌性比雄性多一条166bp的条带，出现条带的位置和数量与理论相符，条带都很清晰，51℃可以作为性别鉴定的退火温度。当退火为42℃时，雌性样本只有166bp的条带，缺少428bp的条带，而雄性样本条带很淡，如图3所示，所以42℃不是性别鉴定的合适退火温度。
[0046]
②
从16只性别未知的鸸鹋雏鸟羽毛中提取基因组dna，利用上述三条引物进行pcr扩增和电泳，出现166bp雌性特异性条带的为雌性鸸鹋，因此样品1、3、4、5、9、12、13和15为雌性鸸鹋样本；而样本2、6、7、8、10、11、14和16缺少166bp雌性特异性条带，包含1条409bp左右的扩增条带，为雄性鸸鹋样本，如图4所示。
[0047]
同时经过pcr电泳鉴定的16只鸸鹋长至18月龄时，通过翻肛法确定鸸鹋的性别，将翻肛法结果与pcr检测结果逐一对比，结果显示通过pcr进行性别鉴定的结果与翻肛法得到的结果完全一致，准确率100％。
[0048]
且利用上述三条引物对雌性鸸鹋和雄性鸸鹋样本的基因组扩增，电泳后对各条带切胶回收后送测序，测序结果如下：
[0049]
①
雌性片段w1：(agctgctttgctactgctttatcct)
[0050]
cctctccactgcaatcaggtttatctcattttttcatgtgaccatgaggactctgggacgctcttacagacctgtgtcccatcagtgcacggatgtccaactgctgaagccagatgcaaaggagtactgagacactcattacagcagaaacaaaaagccaatattaaaggcaaaactagagaatgctcaatgaaaataaacagatccgttaaggcacatagaagcatatacagtatacctaagccagctttttacttttctcttttaaaataatcattaagatatctatatcgcaattttgaataaaatttgttgaaatttttcatgtttgagtttaaaaacattttcacttaaactcaaagataaagtgatcat(gttttacctgagtaattaattccta)
[0051]
②
雌性片段w2：(agctgctttgctactgctttatcct)
[0052]
cctctccactgcaatcaggtttatctcattttttcatgtgaccatgaggactctgggacgctcttacagacctgtgtcccatcagtgcacggatgtccaactgctgaagccagatg(gttttacctgagtaattaattccta)
[0053]
③
雄性片段z1：(agctgctttgctactgctttatcct)
[0054]
cctctccactgcaatcaggtttatctcattttttcatgtgaccatgaggactctgggatgctcttacagacctgtgtcccatcagtgcacagatgtccaactgctgaagccagatgaagctcattacagcagaaacaaaaagccaatattaaaggcaaaactagagaatgctcagtgaagacaaatggatctgttaaagcacatagaagcatatacagtatacctaagccagctttttacttttctcttttaaaataagcattaagatatctatatagcaattttgaataaaatttgttgaaaattttcatgtttgagtttataaacattttcacttaaacttgaggataaagtgatcat(gttttacctgagtaattaattccta)
[0055]
括号内为引物区
[0056]
通过分析最新公布的鸸鹋基因组中z与w染色体序列差异，设计了一组性别鉴定引物，通过pcr和电泳来鉴定鸸鹋的性别，用于鉴定的样本是少量的羽毛、而非血液和肉，所以对鸸鹋没有伤害，同时也减少了在抓捕取样过程鸸鹋对人的攻击，是一种无创鉴定技，通过优化基因组dna提取方法和pcr退火温度，实现了羽毛中微量dna的提取和pcr扩增，性别鉴
定引物的特异性好，用于性别鉴定的电泳条带清晰明亮，是一种准确可靠的鉴定技术。
[0057]
以上，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。