创制矮杆直立株型的水稻种质的方法及其应用与流程

1.本技术涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以crispr/cas9基因编辑技术创制ossmg1(osmkk4)基因突变体来改变水稻株型的方法。


背景技术：

2.水稻是中国主要的粮食作物，全国60％以上的人口以稻米为主食。水稻株型是水稻重要农艺性状，矮杆直立株型有利于密植及抗倒伏。水稻籽粒形状是影响产量的重要性状之一，不同的消费者对粒型也有不同的要求。通常情况下产量性状与粒型直接相关，但小粒型水稻也有获得高产的可能性。含有小粒型基因的种质可以用于制种，包括机械化制种。例如可以将小粒型不育系和大粒型恢复系进行杂交，从而产生小粒型的有效杂交后代。可以进行机械化制种，以便于筛选并提高制种效率。
3.以cas9为代表的基因编辑技术是近年来分子育种领域的热点技术，它能够实现亲本目标性状的快速精准改良，且不涉及转基因安全问题。该技术在育种中的应用大多数是通过对目标基因进行碱基的添加或删除，从而使基因功能失活，获得相应的目标性状。目前还没有利用crispr技术编辑ossmg1(osmkk4)基因，创制矮杆直立株型的水稻种质的相关研究。


技术实现要素：

4.本技术涉及一种以crispr/cas9基因编辑技术创制ossmg1(osmkk4)基因突变体来改良水稻株型的方法。最终获得了株型矮杆直立的水稻品种。为实现上述目的，本技术采用如下技术方案。
5.在第一方面，本技术提供了创制矮杆直立株型的水稻种质的方法，其包括修饰水稻中的ossmg1(osmkk4)基因，使其功能减弱或丧失。
6.在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。
7.在一些实施方案中，所述ossmg1(osmkk4)基因包含以下序列或由以下序列组成：seq id no:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码seq id no:2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。
8.在优选的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。
9.在一些实施方案中，所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：crispr/cas9、crispr/cpf1、crispr/cas12a、talen、大范围核酸酶和zfn。优选地，所述基因编辑通过crispr/cas9进行。
10.在一些实施方案中，所述crispr/cas9包含cas9，其中所述cas9包含seq id no：5所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。
11.在一些实施方案中，所述crispr/cas9包含导向rna(sgrna)，其中所述sgrna靶向
ossmg1(osmkk4)基因。
12.在一些具体的实施方案中，所述sgrna靶向seq id no:3所示的核苷酸序列。
13.在一些具体的实施方案中，所述sgrna包含seq id no:4所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。
14.在一些实施方案中，所述修饰导致ossmg1(osmkk4)基因发生缺失、插入、取代或以上的组合。
15.在第二方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于育种或制种的用途。
16.在第三方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于改良种质资源的用途。
17.在第四方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法获得的水稻的种子制成的制品，其选自食品、饮品、饲料或工业原料。
18.在第五方面，本技术提供了能够靶向水稻ossmg1(osmkk4)基因的sgrna，其包含seq id no:4所示的核苷酸序列或由seq id no:4所示的核苷酸序列组成。
19.在第六方面，本技术提供了能够靶向水稻ossmg1(osmkk4)基因的crispr/cas9编辑载体，其包含表达cas9的第一表达盒和表达sgrna的第二表达盒，其中所述cas9包含seq id no：5所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，并且所述sgrna包含seq id no:4所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。
20.在第七方面，本技术提供了创制矮杆直立株型的水稻种质的方法，其包括通过第六方面所述的crispr/cas9编辑载体导入含有ossmg1(osmkk4)基因的水稻中。
21.在一些实施方案中，所述ossmg1(osmkk4)基因包含以下序列或由以下序列组成：seq id no:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码seq id no:2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。
22.在一些实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。
23.在第八方面，本技术提供了一种矮杆直立株型的水稻，其由第一方面所述的方法产生。
24.在一些实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。
25.在一些实施方案中，所述水稻品种还可以具有粒型变小和/或产量增加等特点。
26.本技术提出了一种基因编辑技术的巧妙运用，利用其定向打靶功能来实现基因突变，并筛选出特定突变类型。在一些实施方案中，该方法简单易行、成本低、并且效率高。在一些实施方案中，本技术利用基因编辑技术对ossmg1(osmkk4)基因功能的定点编辑，成功地获得了矮杆直立株型的水稻品种，优选地，该水稻品种还可以具有粒型变小和/或产量增加等特点。此外，该项技术也为利用crispr/cas9基因编辑技术快速改良水稻品种的株型、粒型、产量、制种等方面提供一种有效的策略。
附图说明
27.图1显示了野生型籼稻x12的ossmg1(osmkk4)基因的序列和编辑株系的ossmg1
(osmkk4)基因的序列，其中ossmg1：野生型籼稻x12的ossmg1；446a006012a和446a006036a：编辑株系；下划线表示pam序列；三角形表示插入序列。
28.图2显示了野生型籼稻x12和编辑株系ossmg1(osmkk4)基因编码的氨基酸序列，其中ossmg1：野生型籼稻x12的ossmg1；446a006012a和446a006036a：编辑株系；下划线表示改变的氨基酸。
29.图3显示了ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型籼稻x12的籽粒比较，其中wt：野生型籼稻x12；446a006012a和446a006036a：编辑株系。图3中的上图为稻谷的照片，下图为米粒的照片。
30.图4显示了ossmg1(osmkk4)基因编辑载体的图谱。
31.图5显示了ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系的株型比较，其中wt：野生型籼稻x12；446a006012a：编辑株系。
32.详细描述
33.提供以下定义和方法以更好地界定本技术以及在本技术实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，本技术的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
34.定义
35.本文使用的术语“基因编辑(gene editing)”或“基因组编辑(genome edting)”，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑指能够对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定dna片段的修饰。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(dsb)，诱导生物体通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)来修复dsb，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。
36.本文使用的术语“crispr/cas9”是指使用rna引导链靶向内切核酸酶切割位点的内切核酸酶。参见，jinek等人，science 337:816-821(2013)；cong等人，science(2013年1月3日)；和mali等人，science(2013年1月3日)。目前发现的crispr/cas9系统有三种不同类型即i型、ii型和iii型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中ii型的组成较为简单，以cas9蛋白以及向导rna(grna)为核心组成，也是目前研究得最深入的类型。当细菌抵御噬菌体等外源dna入侵时，在前导区的调控下，crispr被转录为长的rna前体(pre-crrna)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crrna，最终识别并结合到与其互补的外源dna序列上发挥剪切作用。crispr/cas9的剪切位点位于crrna互补序列下游临近的pam区(protospacer adjacent motif)的5
’-
gg-n18-ngg-3’特征区域中的ngg位点，而这种特征的序列在每128bp的随机dna序列中就重复出现一次。
37.本文使用的术语“crispr/cpf1”是一类新型的crispr-cas系统。目前得到广泛应用的crispr/cas9系统经常会发生脱靶效应。作为crispr/cas9系统的一种潜在的对手，crispr-cpf1系统作为基因编辑的新工具，进一步扩大了基因编辑靶位点的选择范围，同时几乎没有脱靶效应。cpf1是一种新型crispr效应蛋白，具有许多与cas9不同的特性，有利于克服crispr/cas9应用中的一些限制。
38.本文使用的术语“crispr/cas12a”也是一类新型的crispr-cas系统。相较于cas9蛋白来说，cas12a蛋白更具准确度，同时也更安全。crispr/cas9工作时，cas9蛋白识别pam序列(rna编写的遗传密码)，通过grna解开部分双螺旋，在这个过程中，cas9蛋白一旦找到
匹配较好的序列时，便会紧密贴合在该段dna上，而在这个过程中，也许会出现一些错配的现象，但这种结合是不可逆的。而在这一方面，cas12a就显得机智许多，它在寻找“靶标”时，会对沿途的dna序列进行单碱基的识别，如若发现有匹配不好的碱基，便会离开重新寻找，在寻找到pam序列时，cas12a蛋白会与pam序列形成一种半封闭的r-环(r-loop)，当识别到正确的序列时，才会完全结合成封闭的r-环，所以这种结合是可逆的，这也体现出了它更安全的一面。
39.本文使用的术语“转录激活子样效应器核苷酶”或“tal效应器核苷酶”或“talen”是指一类通过使tal效应器dna结合结构域与dna切割结构域融合而产生的人工限制内切核酸酶。
40.本文使用的术语“锌指核酸酶(zfn)”由一个dna识别域以及一个dna剪切域组成。dna识别域为3～4个zf串联结构，每个zf约含30个氨基酸，被1个锌离子所固定，可识别并结合1个特异的三联体碱基，dna剪切域由非特异性核酸内切酶fok i羧基端的96个氨基酸残基组成。每个fok i单体与1个zfp相连构成1个zfn，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时(6～8bp)，2个单体zfn相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导dna定点剪切。
41.本文使用的术语“大范围核酸酶(meganuclease)”是指能够识别14-40碱基长度的核酸序列的归巢核酸内切酶。一些大范围核酸酶可以容忍小的归巢位点序列差异，大的识别区域仍然能够保证这些酶的高度特异性，而这反过来又可保持低水平的基因组内非特异性裂解和较低的毒性。大范围核酸酶由自我剪接rna内含子或自我剪接蛋白内含子序列的移动序列内的开放阅读框架编码。
42.本文使用的术语“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽的情况下，指相同或具有相同核苷酸或氨基酸的指定百分比(即在指定区域内，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两条或更多条序列或亚序列，如利用blast或blast 2.0序列比较算法以默认参数或通过手工比对和可视检查(参阅如ncbi网站等)所测量的。
43.本文使用的术语“育种”是指采用物理、化学、生物等方法改变作物品种的遗传特性，培育出高产、抗病、优质等特点的新品种；而本文使用的术语“制种”是指生产已经培育成功的作物种子。就本技术而言，育种是指采用本领域已知的各种方法，培育出株型矮杆直立、粒型小且短和/或产量高产的水稻新品种，而制种是指生产(包括机械化生产)通过育种获得的新品种的种子。
具体实施方式
44.本技术提出了一种以crispr/cas9基因编辑技术创制ossmg1(osmkk4)基因缺失突变体，从而改良水稻株型的方法，其适应于所有含有功能型ossmg1(osmkk4)基因的水稻品种中，包括以下步骤：
45.(1)拟改良水稻品种ossmg1(osmkk4)基因的序列分析，选择合适位点设计靶标；
46.(2)构建编辑载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将编辑载体导入愈伤组织细胞，并再生成水稻株系；
47.(3)对ossmg1(osmkk4)基因编辑株系的基因型检测和分析、性状分析，考察株型情况。
48.(4)经过传代分离、鉴定筛选，得到编辑纯合或杂合且非转基因的矮杆直立表型水稻种质。
49.此外，还可以对矮杆直立表型的水稻种质进行筛选，以选择小粒表型和/或产量增加的水稻种质。
50.本技术的创制矮杆直立株型的水稻种质的方法，具体包括以下步骤：
51.(1)水稻中ossmg1(osmkk4)基因的检测；
52.(2)针对水稻中ossmg1(osmkk4)基因的crispr/cas9编辑载体的构建；
53.(3)将籼稻x12的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将编辑载体导入，鉴定编辑株系中ossmg1(osmkk4)基因的编辑情况，获得不同编辑类型的ossmg1(osmkk4)等位基因。经过传代分离、鉴定筛选，得到编辑纯合或杂合且非转基因的株系，最终获得矮杆直立株型的改良株系。
54.本技术具体涉及如下技术方案。
55.在第一方面，本技术提供了创制矮杆直立株型的水稻种质的方法，其包括修饰水稻中的ossmg1(osmkk4)基因，使其功能减弱或丧失。
56.在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。
57.在一些实施方案中，所述ossmg1(osmkk4)基因包含以下序列或由以下序列组成：seq id no:1所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码seq id no:2所示的氨基酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。
58.本文所用的术语“活性变体序列”指基本上相似的序列。对于核苷酸序列，活性变体序列包括由于遗传密码子简并性而编码相同功能的蛋白质的那些序列。诸如天然存在的等位基因变体可以使用公知的分子生物学技术例如聚合酶链式反应(pcr)和杂交技术来鉴定。例如，在本技术中，与籼稻x12的ossmg1(osmkk4)基因具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的同一性并且也编码功能性ossmg1(osmkk4)蛋白的来自其他水稻品种的基因，包括在本技术定义的“活性变体序列”中。同一性的确定是通过本文描述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。核苷酸的活性变体序列与该核苷酸序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4,3,2或甚至1个核苷酸。
59.对于蛋白质序列，术语“活性变体序列”包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通过缺失(所谓的截短)天然蛋白n末端和/或c末端的一个或多个氨基酸或将一个或多个氨基酸添加至所述天然蛋白的n末端和/或c末端；在天然蛋白的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸。因而，就蛋白质而言，术语“活性变体序列”包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性，例如具有ossmg1(osmkk4)蛋白功能的足够数目的连续氨基酸残基。这样的功能相
对天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者可以是不变的，只要保留了ossmg1(osmkk4)蛋白功能。同一性的确定是通过本文描述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。蛋白的活性变体序列与该蛋白的差异可以少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4,3,2或甚至1个氨基酸残基。
60.在优选的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。
61.在一些实施方案中，所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：crispr/cas9、crispr/cpf1、crispr/cas12a、talen、大范围核酸酶和zfn。优选地，所述基因编辑通过crispr/cas9进行。
62.在一些实施方案中，所述crispr/cas9包含cas9，其中所述cas9包含seq id no：5所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。
63.在一些实施方案中，所述crispr/cas9包含导向rna(sgrna)，其中所述sgrna靶向ossmg1(osmkk4)基因。
64.在一些具体的实施方案中，所述sgrna靶向seq id no:3所示的核苷酸序列。
65.在一些具体的实施方案中，所述sgrna包含seq id no:4所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。
66.在一些实施方案中，所述修饰导致ossmg1(osmkk4)基因发生缺失、插入、取代或以上的组合。
67.在一些具体的实施方案中，修饰的结果仅仅使得ossmg1(osmkk4)基因功能丧失。
68.在第二方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于育种或制种的用途。在具体的实施方案中，制种可以为机械化制种。
69.在第三方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于改良种质资源的用途。
70.在第四方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法获得的水稻的种子制成的制品，其选自食品、饮品、饲料或工业原料。
71.在第五方面，本技术提供了能够靶向水稻ossmg1(osmkk4)基因的sgrna，其包含seq id no:4所示的核苷酸序列或由seq id no:4所示的核苷酸序列组成。
72.在第六方面，本技术提供了能够靶向水稻ossmg1(osmkk4)基因的crispr/cas9编辑载体，其包含表达cas9的第一表达盒和表达sgrna的第二表达盒，其中所述cas9包含seq id no：5所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，并且所述sgrna包含seq id no:4所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。
73.在第七方面，本技术提供了创制矮杆直立株型的水稻种质的方法，其包括通过第六方面所述的crispr/cas9编辑载体导入含有ossmg1(osmkk4)基因的水稻中。
74.在一些实施方案中，所述ossmg1(osmkk4)基因包含以下序列或由以下序列组成：
transformation in rice.nature protocols,2006,6:2 796-2 802)。具体流程包括，水稻愈伤组织与农杆菌共培养3天后，将愈伤组织于250mg/l carbenicillin的ddh2o中浸泡30min，去除多余的农杆菌后置于含250mg/l carbenicillin的筛选培养基上筛选3轮，然后将抗性愈伤转移至再生培养基上培养，待分化出2～3cm的小苗后，将其转移至生根培养基中继续培养2周。
92.实施例3t0代ossmg1(osmkk4)基因编辑水稻的筛选和鉴定
93.将实施例2中的再生植株送至温室种植，取再生的t0代小苗叶片，通过ctab法提取植物基因组dna作为模板。dna样品用荧光定量pcr方法进行阳性检测。荧光定量pcr方法选择筛选标记基因cp4作为目标基因和水稻actin1基因作为内参基因，于荧光定量pcr仪上进行扩增和荧光值检测，根据rq值筛选出转基因阳性的植株(cp4基因rq值》0.1，结果未示出)。用于扩增筛选标记基因cp4的引物序列为csp356：cagcacaggttaagtctg(seq id no：6)和csp357：gtctgtctcaacggtaag(seq id no：7)；用于扩增actin1基因的引物序列为csp106：tgctatgtacgtcgccatccag(seq id no：8)和csp107：aatgagtaaccacgctccgtca(seq id no：9)。
94.用ossmg1(osmkk4)基因靶位点特异性检测引物(正向引物为5’端含有fam荧光修饰的csp7033：5
’-
cgaattcggtcggctccg-3’(seq id no：10)；反向引物csp6982：5
’-
ggttggatggcttgatgtcg-3’(seq id no：11))和q5超保真dna聚合酶进行pcr扩增。待反应结束后，利用琼脂糖电泳检测pcr扩增成功与否。之后利用abi3730xl测序仪进行毛细管电泳，之后用软件分析扩增片段的碱基长度。
95.结果显示全部29株t0代水稻的ossmg1(osmkk4)基因在靶标区域发生长度变化，突变率为100％，变化主要以若干个碱基的插入或缺失为主，最长的缺失为26bp。均是我们的目标编辑结果。另外，所有发生编辑的株系中，两个拷贝ossmg1(osmkk4)基因都被成功编辑。这些数据表明，编辑载体能够高效地编辑ossmg1(osmkk4)基因。
96.实施例4t1代ossmg1(osmkk4)基因编辑纯合非转基因水稻的筛选和鉴定
97.将实施例3中鉴定的29株阳性水稻株系移入温室进行移栽种植，收取其自交t1代种子。将各株系的t1代种子(每株系约100粒)，进行发芽、育苗，提取幼苗的dna进行转基因成分检测及编辑位点pcr检测，去掉含有转基因成分、没有编辑或者编辑位点杂合的株系，保留不携带转基因成分，并且编辑位点纯合的株系。从编号为446a006a的株系的自交t1代种子的水稻苗中鉴定到两株目标株系，将其分别命名为446a006012a和446a006032a。转基因成分检测方法请参见《基因编辑后代材料gmo检测流程》，其是根据中国国家标准农业部953号公告6-2007号公告gb/t 19495—2004转基因产品检测标准要求进行。为确认446a006012a和446a006032a编辑株系中ossmg1(osmkk4)基因编辑情况，对其靶位点区域进行pcr扩增和测序。结果显示，446a006012a和446a006032a株系插入了1bp核苷酸(图1)。
98.实施例5编辑株系的籽粒表型鉴定
99.将446a006012a和446a006032a自交的t2代纯合编辑的种子及对照种子(wt)进行表型拍照(图3)。从图中可以看出，无论是稻谷还是米粒，粒长方面，编辑材料都明显小于对照。从整体上看，编辑材料的籽粒明显小于对照。用近红外仪对籽粒稻谷的长、宽进行测量，并算出长宽比(表1)。
100.表1 ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系的稻谷谷粒长、宽及长宽比
101.材料长均值(mm)宽均值(mm)长宽比wt9.212.493.70446a006012a7.362.423.04446a006032a7.302.482.94
102.由于粒型明显变小，编辑稻谷的千粒重也明显变小(表2)。
103.表2 ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系的稻谷千粒重
104.材料千粒重(g)wt22.99446a006012a16.57446a006032a17.15
105.实施例6编辑株系的株型表型鉴定
106.将446a006012a自交的t2代纯合编辑株系及对照株系(wt)进行表型拍照(图5)。从图中可以看出株高指标，编辑材料都明显小于对照。株型上，编辑材料更加直立。测量成熟后材料株高、穗长数据，也表明了编辑材料的株高、穗长明显低于对照(表3和4)。
107.表3 ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系株高
108.材料株高(cm)wt91.5446a006012a76.7446a006032a77.2
109.表4 ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系穗长
110.材料穗长(cm)wt22.1446a006012a17.8446a006032a18.1
111.实施例7编辑株系的株型产量数据
112.在446a006012a和446a006032a自交的t2代纯合编辑株系及对照(wt)收获后，测量每株平均有效穗数、每株平均结实粒数。每株编辑株系的穗数和结实粒数明显大于对照(表5、表6)。由于每株编辑株系的有效穗数和结实粒数远大于对照，虽然编辑株系千粒重较低，但平均单株产量仍大于对照(表7)(平均单株产量＝千粒重*每株平均结实粒数/1000)。
113.表5 ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系的每株平均有效穗数
114.材料平均有效穗数wt18.3446a006012a41.0446a006032a41.7
115.表6 ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系的每株平均结实粒数
116.材料平均每株结实粒数wt1306446a006012a2841
446a006032a3796
117.表7 ossmg1(osmkk4)基因编辑株系与野生型株系的平均单株产量
118.材料平均单株产量(g)wt32.16446a006012a47.68446a006032a48.15
119.从上述结果中可以看出，本技术利用crispr/cas9基因编辑技术获得了ossmg1(osmkk4)基因突变体。与talen和zfn技术相比，crispr/cas9基因编辑技术操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作，是一种快速获得矮杆直立、小粒高产水稻品种或种质资源的生物育种方法。
120.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本技术的技术方案作了详尽的描述，但在这些技术方案的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本技术精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本技术要求保护的范围。
121.序列表
122.seq id no：1：水稻ossmg1(osmkk4)基因的核苷酸序列
123.atgcgaccgggcgggccgccgagcttgcgggcggggctgcagcagcagcagcagcagcagccggggacgccggggaggtcgcggcgccggccggatctcacgctgccgctgccgcagcgggacctcacgtcgctcgcggtgccgctgccgctgccgctgccgccgtcgtcggcgccgtcgtcgacgtcgtcgtccgggtcgtcctcgctcggcggcgtgcccaccccgccgaattcggtcggctccgcgccgccggccccgccgccgctgtcggagctggagcgcgtccgccgcatcgggagcggcgcgggcgggacggtgtggatggtgcggcaccgccccacggggcggccgtacgcgctcaaggtgctctacgggaaccacgacgacgccgtgcggcggcagatcacgcgcgagatcgcgatcctccgcaccgccgagcacccggccgtcgtgcggtgccacggcatgtacgagcaggccggcgagctccagatcctgctcgagtacatggacgggggatccctcgagggccgccgcatcgcctccgaggccttcctcgccgacgtcgcgcgccaggtgctctccgggatcgcctacctccaccgccgccacatcgtccaccgcgacatcaagccatccaacctcctcatcgactccggccgccgcgtcaagatcgccgacttcggcgtcggccgcatcctcaaccagaccatggacccctgcaactcctccgtcgggaccatcgcctacatgagccccgagcgcatcaacaccgacctcaacgacggcgcctacgacggctacgccggcgacatctggagcttcggcctgagcattctcgagttctacatgggcaggttccccctcggggagaatctcggcaagcagggagactgggccgccctcatgtgcgcgatttgctactccgactcgccggcgccgccgcccaacgcctcgccggagttcaagagcttcatcagctgctgcctccagaagaacccggcgcggcggccatcggcggcgcagcttctccaacatcggttcgtcgccgggccacagcagcagcagcagccgcagccgcagcccctcgcaccgcctccgtcatga
124.seq id no：2：水稻ossmg1(osmkk4)基因编码的氨基酸序列
125.mrpggppslraglqqqqqqqpgtpgrsrrrpdltlplpqrdltslavplplplppssapsstsssgssslggvptppnsvgsappappplselervrrigsgaggtvwmvrhrptgrpyalkvlygnhddavrrqitreiailrtaehpavvrchgmyeqagelqilleymdggslegrriaseafladvarqvlsgiaylhrrhivhrdikpsnllidsgrrvkiadfgvgrilnqtmdpcnssvgtiaymsperintdlndgaydgyagdiwsfglsilefymgrfplgenlgkqgdwaalmcaicysdspapppnaspefksfiscclqknparrpsaaqllqhrfvagpqqqqqpqpqplappps
126.seq id no：3：水稻ossmg1(osmkk4)基因中的靶序列
127.cgagcacccggccgtcgtg
128.seq id no：4：sgrna的核苷酸序列
129.cgagcacccggccgtcgtggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct
130.seq id no：5：cas9的核苷酸序列
131.atgccgaagaagcgccgccgcgtggacaagaagtactccatcggcctcgacatcggcaccaactccgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccgtccaagaagttcaaggtgctcggcaacaccgaccgccactccatcaagaagaacctcatcggcgccctcctcttcgactccggcgagaccgccgaggccacccgcctcaagcgcaccgcccgccgccgctacacccgccgcaagaaccgcatctgctacctccaggagatcttctccaacgagatggccaaggtggacgactccttcttccaccgcctcgaggagtccttcctcgtggaggaggacaagaagcacgagcgccacccgatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtacccgaccatctaccacctccgcaagaagctcgtggactccaccgacaaggccgacctccgcctcatctacctcgccctcgcccacatgatcaagttccgcggccacttcctcatcgagggcgacctcaacccggacaactccgacgtggacaagctcttcatccagctcgtgcagacctacaaccagctcttcgaggagaacccgatcaacgcctccggcgtggacgccaaggccatcctctccgcccgcctctccaagtcccgccgcctcgagaacctcatcgcccagctcccgggcgagaagaagaacggcctcttcggcaacctcatcgccctctccctcggcctcaccccgaacttcaagtccaacttcgacctcgccgaggacgccaagctccagctctccaaggacacctacgacgacgacctcgacaacctcctcgcccagatcggcgaccagtacgccgacctcttcctcgccgccaagaacctctccgacgccatcctcctctccgacatcctccgcgtgaacaccgagatcaccaaggccccgctctccgcctccatgatcaagcgctacgacgagcaccaccaggacctcaccctcctcaaggccctcgtgcgccagcagctcccggagaagtacaaggagatcttcttcgaccagtccaagaacggctacgccggctacatcgacggcggcgcctcccaggaggagttctacaagttcatcaagccgatcctcgagaagatggacggcaccgaggagctcctcgtgaagctcaaccgcgaggacctcctccgcaagcagcgcaccttcgacaacggctccatcccgcaccagatccacctcggcgagctccacgccatcctccgccgccaggaggacttctacccgttcctcaaggacaaccgcgagaagatcgagaagatcctcaccttccgcatcccgtactacgtgggcccgctcgcccgcggcaactcccgcttcgcctggatgacccgcaagtccgaggagaccatcaccccgtggaacttcgaggaggtggtggacaagggcgcctccgcccagtccttcatcgagcgcatgaccaacttcgacaagaacctcccgaacgagaaggtgctcccgaagcactccctcctctacgagtacttcaccgtgtacaacgagctcaccaaggtgaagtacgtgaccgagggcatgcgcaagccggccttcctctccggcgagcagaagaaggccatcgtggacctcctcttcaagaccaaccgcaaggtgaccgtgaagcagctcaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgactccgtggagatctccggcgtggaggaccgcttcaacgcctccctcggcacctaccacgacctcctcaagatcatcaaggacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtgctcaccctcaccctcttcgaggaccgcgagatgatcgaggagcgcctcaagacctacgcccacctcttcgacgacaaggtgatgaagcagctcaagcgccgccgctacaccggctggggccgcctctcccgcaagctcatcaacggcatccgcgacaagcagtccggcaagaccatcctcgacttcctcaagtccgacggcttcgccaaccgcaacttcatgcagctcatccacgacgactccctcaccttcaaggaggacatccagaaggcccaggtgtccggccagggcgactccctccacgagcacatcgccaacctcgccggctccccggccatcaagaagggcatcctccagaccgtgaaggtggtggacgagctcgtgaaggtgatgggccgccacaagccggagaacatcgtgatcgagatggcccgcgagaaccagaccacccagaagggccagaagaactcccgcgagcgcatgaagcgcatcgaggagggcatcaaggagctcggctcccagatcctcaaggagcacccggtggagaacacccagctccagaacgagaagctctacctctactacctccagaacggccgcgacatgtacgtggaccaggagctcgacatcaaccgcctctccgactacgacgtggaccacatcgtgccgcagtccttcctcaaggacgactccatcgacaacaaggtgctcacccgctccgacaagaaccgcggcaagtccgacaacgtgccgtccgaggaggtggtgaag
aagatgaagaactactggcgccagctcctcaacgccaagctcatcacccagcgcaagttcgacaacctcaccaaggccgagcgcggcggcctctccgagctcgacaaggccggcttcatcaagcgccagctcgtggagacccgccagatcaccaagcacgtggcccagatcctcgactcccgcatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctcatccgcgaggtgaaggtgatcaccctcaagtccaagctcgtgtccgacttccgcaaggacttccagttctacaaggtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctcaacgccgtggtgggcaccgccctcatcaagaagtacccgaagctcgagtccgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcgcaagatgatcgccaagtccgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctcgccaacggcgagatccgcaagcgcccgctcatcgagaccaacggcgagaccggcgagatcgtgtgggacaagggccgcgacttcgccaccgtgcgcaaggtgctctccatgccgcaggtgaacatcgtgaagaagaccgaggtgcagaccggcggcttctccaaggagtccatcctcccgaagcgcaactccgacaagctcatcgcccgcaagaaggactgggacccgaagaagtacggcggcttcgactccccgaccgtggcctactccgtgctcgtggtggccaaggtggagaagggcaagtccaagaagctcaagtccgtgaaggagctcctcggcatcaccatcatggagcgctcctccttcgagaagaacccgatcgacttcctcgaggccaagggctacaaggaggtgaagaaggacctcatcatcaagctcccgaagtactccctcttcgagctcgagaacggccgcaagcgcatgctcgcctccgccggcgagctccagaagggcaacgagctcgccctcccgtccaagtacgtgaacttcctctacctcgcctcccactacgagaagctcaagggctccccggaggacaacgagcagaagcagctcttcgtggagcagcacaagcactacctcgacgagatcatcgagcagatctccgagttctccaagcgcgtgatcctcgccgacgccaacctcgacaaggtgctctccgcctacaacaagcaccgcgacaagccgatccgcgagcaggccgagaacatcatccacctcttcaccctcaccaacctcggcgccccggccgccttcaagtacttcgacaccaccatcgaccgcaagcgctacacctccaccaaggaggtgctcgacgccaccctcatccaccagtccatcaccggcctctacgagacccgcatcgacctctcccagctcggcggcgacccgaagaagcgccgccgcgtgtga
132.seq id no：6：用于扩增筛选标记基因cp4的正向引物序列
133.cagcacaggttaagtctg
134.seq id no：7：用于扩增筛选标记基因cp4的反向引物序列
135.gtctgtctcaacggtaag
136.seq id no：8：用于扩增actin1基因的正向引物序列
137.tgctatgtacgtcgccatccag
138.seq id no：9：用于扩增actin1基因的反向引物序列
139.aatgagtaaccacgctccgtca
140.seq id no：10：用于扩增ossmg1(osmkk4)基因编辑位点的正向引物
141.cgaattcggtcggctccg
142.seq id no：11：用于扩增ossmg1(osmkk4)基因编辑位点的反向引物
143.ggttggatggcttgatgtcg