一类含咔唑基咪唑盐类化合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及药物化学技术领域，尤其是一种含咔唑基咪唑盐类化合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.近年来，植物细菌性病害严重影响了农作物的生长与生产，每年对中国的农业造成巨大的经济损失。据统计，全世界细菌性病害有500多种，而中国发现的细菌性作物病害种类超过200种，其中主要病害占病害种类的25％～33％，且年发生面积达1.2亿亩次。例如：水稻黄单胞菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)引起水稻白叶枯病，是一种全球性的病害，也是十大细菌性病害之一。水稻白叶枯病，在幼苗初期症状不明显，高温下两周内则快速形成短条状、小而狭的病斑，随后叶片枯黄凋萎，能造成水稻减产20％～30％，严重的可达50％～60％，甚至颗粒无收。即使部分感病的水稻最终结出稻谷，但种子不饱满，严重的影响了水稻的产量和品质。更值得注意的是，水稻黄单胞菌能在土壤中存活，因此水稻白叶枯病容易连年发生；地毯草黄单胞柑橘致病变种(xanthomonas axonopodis pv.citri，xac)引起柑橘溃疡病，是一种世界性病害，也是中国柑橘产区重要病害之一。该病能引起树木根部的局部腐烂，造成吸肥能力下降，同时引起叶片缺素，前期常表现出缺素的假象，后期则影响成熟期果的转色和僵果，严重影响了柑橘的产量和品质。同时柑橘溃疡病菌的寄主广泛，传播快，发病率高，发病果园的损失率一般在10％～20％，严重可达30％以上。此外，现有防治细菌性病害的商品药剂严重缺乏，且防治效果难以满足现代农业的需求，由此，研发新型、高效的抗细菌性病害的药剂迫在眉睫。
3.季铵盐类化合物主要通过破环细胞膜使胞内物质外泄导致细菌死亡，并因其广谱的抗菌活性以及不易产生抗药性等特点被广泛应用于医疗、工业、农业和食品包装等行业。另外，季铵盐类化合物具有易合成、易修饰、酶降解稳定性高等优点引起了众多科研工作者的兴趣。同时咔唑是一种重要的含氮杂环基团，因其独特的生理生化性质被广泛应用于医药、农药和新型材料等。为了探索高活性的抗菌化合物，本发明以咔唑和咪唑为基本原料设计合成了一系列咔唑基咪唑盐类化合物。同时通过对目标化合物的植物毒性测试和大量的文献报道发现季铵盐类化合物虽然具有优异的抗菌活性，但是其对生物体具有较高的生物毒性，并因此制约了具有高活性的季铵盐类化合物的发展与应用。为此，本发明希望引入cb[7]与客体季铵盐通过主客体相互作用形成复合物降低药物毒性，再通过引入客体金刚烷胺，利用分子间的竞争作用可控的将药物缓慢的释放，从而恢复药物的抗菌活性。本发明希望这种利用超分子药物可控释放策略能为某些因对生物体具有较高毒性但具有优异生物活性的药物的应用提供一定的参考依据。超分子药物可控释放策略研究进展，咔唑和咪唑盐(季铵盐)类衍生物的生物活性研究进展如下：
[0004]
2021年，xue等[xue，y.j.；li，m.y.；jin，x.j.；zheng，c.j.；piao，h.r.design，synthesis and evaluation of carbazole derivatives as potential antimicrobial agents[j].j.enzym.inhib.med.chem.，2021，36，295-306.]设计并合成了一系列含氨基
胍、氨基脲、氨基硫脲或异烟碱基团的新型咔唑衍生物，并对其抗菌性能进行了评价。测试结果表明大多数化合物对多种细菌菌株表现出较强的抑制活性，其中化合物8f作为最有潜力的临床药物，对多种菌株的mic为0.5-2μg/ml，且其对三种菌株的细胞毒性最小；化合物9d具有较好的抑菌效果。
[0005]
2021年，xie等[xie，y.p.；ansari，m.f.；zhang，s.l.；zhou，c.h.novel carbazole-oxadiazoles as potential staphylococcus aureus germicides[j].pestic.biochem.phys.2021，175，104849.]报道了一系列咔唑基噁二唑衍生物并测试了其抗金黄色葡萄球菌的生物活性。测试结果表明：含3，6-二溴咔唑基的噁二唑衍生物(化合物13a)对多种革兰氏阳性菌具有较好的抑菌活性，尤其是金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌atcc 29213，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌atcc 25923(mics＝0.6-4.6nmol/ml)，优于诺氟沙星。进一步评价表明，3，6-二溴咔唑衍生物13a具有较强的干扰细菌生物膜和干扰dna的能力，且药物无耐药性趋势和较低的溶血毒性。通过各种实验证明活性化合物13a可以作为农药抗生素的候选药物。
[0006]
2021年，crncevic等[crncevic，d.；krce，l.；mastelic，l.；maravic，a.；soldo，b.；aviani，i.；primozic，i.；odzak，r.；sprung，m.the mode of antibacterial action of quaternary n-benzylimidazole salts against emerging opportunistic pathogens[j].bioogr.chem.2021，112，104938.]报道了一系列具有抗菌活性的n-苄基咪唑盐类衍生物。
[0007]
尤其是化合物bni-14(含n-十四烷基基团)主要作用于细菌的生物膜，甚至在极低的mic浓度下依然能影响细菌的生长和分裂。同时，化合物bni-14对生物体的毒性较低。
[0008]
2019年，wei等[wei，l.j.；li，q.；chen，y.；zhang，j.j.；mi，y.q.；dong，f.；lei，c.q.；guo，z.y.enhanced antioxidant and antifungal activity of chitosan derivatives bearing 6-o-imidazole-based quaternary ammonium salts[j].carbohyd.polym.2019，206，493-503.]报道了一系列含6-o-咪唑基团季铵盐的壳聚糖衍生物，通过生物活性测试发现多数衍生物，特别是含有长链烷基和氨基酸基团的衍生物，在1.0mg/ml浓度下对灰霉病的抑制指数大于85％。
[0009]
2017年，bai等[bai，h.t.；fu，x.c.；huang，z.h.；lv，f.t.；liu，l.b.；zhang，x.；wang，s.supramolecular germicide switches through host-guest interactions for decelerating emergence of drug-resistant pathogens[j].chemistryselect 2017，2，7940-7945.]为了解决药物的耐药性问题提出了一种新型的超分子策略。他们通过主客体相互作用使含季铵盐基团的客体分子封装到主体分子(cb[7])中降低了药物对生物体的刺激从而减少药物的耐药性，再在需要释放药物的生物活性时引入竞争性客体分子(金刚烷胺)将药物释放。通过以上方式实现了药物分子活性位点的可控释放，有效的防治耐药性细菌的出现。


技术实现要素：

[0010]
本发明的目的之一提供了一种含咔唑基咪唑盐类化合物或其立体异构体、或其溶剂化物。
[0011]
本发明的另一目的在提供了制备上述化合物或其立体异构体、或其盐或其溶剂化
物的中间体化合物及其制备方法。
[0012]
本发明还有一目的是提供了一种含有上述化合物或其立体异构体、或其盐或其溶剂化物的组合物。
[0013]
本发明还有一目的是提供了上述化合物或其立体异构体、或其盐或其溶剂化物，或所述组合物的用途。
[0014]
本发明另一目的是提供了利用上述化合物或其立体异构体、或其盐或其溶剂化物，或所述组合物防治农业病虫害的方法。
[0015]
为实现上述目的，本发明采用了下述技术方案：
[0016]
一种含咔唑基咪唑盐类化合物或其立体异构体、或其溶剂化物，该化合物具有如通式(i)所示的结构：
[0017][0018]
其中
[0019]
r独立的选自氢、氘、卤素、任意取代或未取代的烷基、任意取代或未取代的烯基、任意取代或未取代的炔基、任意取代或未取代的烷氧基、任意取代或未取代的环烷基、任意取代或未取代的芳基、任意取代或未取代的杂芳基中的一个或多个；或r为任意取代的5-10元环或含杂原子的环，所述杂原子为n、o、s中的一个或多个；x为各种卤素；n代表各种烷基链的个数。
[0020]
其特征在于：r独立的选自氢、氘、卤素、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
烷氧基、c
5-10
环烷基、c
5-10
芳基、c
5-10
杂芳基；或r为任意取代的5-10元环或含杂原子的环；
[0021]
优选地，r为独立的选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、烯丙基、3-cl-苄基、2，4-二氯苄基、2，5-二氯苄基、苄基、2-f-苄基、3-f-苄基、4-f-苄基、2-cl-苄基、3-cl-苄基、4-cl-苄基、2-cf
3-苄基、3-cf
3-苄基、4-cf
3-苄基、2-甲基-苄基、3-甲基-苄基、4-甲基-苄基、2-och
3-苄基、3-och
3-苄基、4-och
3-苄基、2-ocf
3-苄基、3-ocf
3-苄基、4-ocf
3-苄基、2，3-二氯苄基、3-no
2-苄基；x为cl、br和i；n为10。
[0022]
本发明还提供了一种制备所述的含咔唑基咪唑盐类化合物或其立体异构体、或其溶剂化物的中间体化合物：
[0023][0024]
本发明还提供了所述的含咔唑基咪唑盐类化合物或其立体异构体、或其溶剂化物的制备方法，包括下述步骤：
[0025][0026]
其中r和x如上所述。
[0027]
此处用到的术语“烷基”是包括具有特定数目碳原子的支链和直链饱和烃基。例如“c
1-10
烷基”(或亚烷基)目的是c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9和c10烷基。另外，例如“c
1-6
烷基”表示具有1到6个碳原子的烷基。烷基可为非取代或取代的，以使一个或多个其氢原子被其它化学基团取代。烷基的实施例包括但不限于甲基(me)、乙基(et)、丙基(如正丙基和异丙基)、丁基(如正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基(如正戊基、异戊基、新戊基)及其类似物。
[0028]“烯基”是既包括直链或支链结构的烃，且具有一个或多个出现在链中任何稳定点的碳-碳双键。例如“c
2-6
烯基”(或亚烯基)目的是包括c2、c3、c4、c5和c6烯基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基，2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、2-甲基-2-丙烯基、4-甲基-3-戊烯基及其类似物。
[0029]“炔基”是既包括直链或支链结构的烃，且具有一个或多个出现在链中任何稳定点的碳-碳叁键。例如“c
2-6
炔基”(或亚炔基)目的是包括c2、c3、c4、c5和c6炔基；如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基及其类似物。
[0030]
此处用到的术语“取代的”指的是在指定原子或基团上的任意一个或多个氢原子以选择的指定基团取代，前提是不超过指定原子的一般化合价。如果没有其它说明，取代基命名至中心结构。例如，可以理解的是当(环烷基)烷基是可能的取代基，该取代基至中心结构的连接点是在烷基部分中。此处使用的环双键是形成于两个临近环原子之间的双键(如c＝c、c＝n或n＝n)。当提到取代时，特别是多取代时，指的是多个取代基在指定基团上的各个位置上取代，如二氯苯基指的是1，2-二氯苯基、1，3-二氯苯基和1，4-二氯苯基。
[0031]
取代基和或变量的组合是允许的，仅当这些组合产生稳定的化合物或有用的合成中间体。稳定的化合物或稳定结构暗示所述化合物以有用的纯度从反应混合物分离出来时是足够稳定的，随之配制形成有效的治疗试剂。优选地，目前所述化合物不包含n-卤素、s(o)2h或s(o)h基。
[0032]
术语“芳基”指的是在环部分具有6到12个碳原子的单环或双环芳香烃基，如苯基和萘基，每个可被取代的。
[0033]
术语“卤素”或“卤素原子”指的是氯、溴、氟和碘。
[0034]
术语“卤代烷基”指的是具有一个或多个卤素取代基的取代烷基。例如“卤代烷基”包括单、双和三氟甲基；即便卤代烷基中的卤代被明确为氟、氯、溴、碘，同样指的是具有一
个或多个氟、氯、溴、碘取代基的取代烷基。
[0035]
如果没有其它说明，本发明的化合物理解为包括游离态和其盐。术语“盐”表示以无机和/或有机酸和碱形成酸式和/或碱式盐。另外，术语“盐可包括两性离子(内盐)，如当式i化合物含有碱性片段如胺或吡啶或咪唑环，和酸式片段如羧酸。药物上可接受的(即非毒性、生理学上可接受的)盐是优选的，如可接受的金属和胺盐，其中阳离子没有显著贡献毒性或盐的生物活性。然而，其它盐可是有用的，如在制备过程中采用分离或纯化步骤，因此也包含于本发明范围中。
[0036]
优选地，c
1-c
10
烷基指的是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基及其同分异构体；c
1-c
10
烷氧基指的是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基、癸氧基及其同分异构体；c
2-c5烯基指的是乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基及其同分异构体。
[0037]
当提到取代基为烯基、炔基、烷基、卤素、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基、羟基、氨基、巯基、膦基时，或这些取代基具体的为某个具体的烯基、炔基、烷基、卤素、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基、羟基、氨基、巯基、膦基时，指的是一个到三个上述取代基。如甲基苯基指的是一个到三个甲基取代的苯基。
[0038]
通过采用上述技术方案，本发明设计、合成一系列含咔唑基咪唑盐类化合物，且发现该化合物对致病病原细菌具有良好的抑制作用，针对病原细菌[如水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)和柑橘溃疡病菌(xanthomonas axonopodis pv.citri，xac)等均具有良好的抑制效果，为新农药的研发和创制提供重要的科学基础。同时，本发明专利还设计了一种超分子药物可控释放“开关”，在不需要的时候“关闭”药物分子的活性位点，降低药物对生物体的药物毒性，在需要的时候“打开”药物分子的活性位点，恢复药物的抗菌活性。这种超分子药物可控释放策略可以为高活高毒的药物分子的利用提供了一种可行性的方案与指导。
附图说明
[0039]
图1是超分子药物可控释放的平板实验结果；
[0040]
图2是不同试样在水稻植株上七天后的毒理实验，其中化合物10(a)，cb[7](b)，ad(c)，ad@cb[7](d)，10@cb[7](e和g)和10@cb[7] ad(f和h)，其a-f的药物浓度为200μg/ml，a和h的药物浓度为400μg/ml，i为空白组。
实施例
[0041]
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售相应纯度产品产品。
[0042]
实施例1：中间体9-(10-溴癸基)-9h-咔唑的制备
[0043]
将咔唑(6.0mmol)和k2co3(17.9mmol)加入含有10ml甲醇的50ml圆底烧瓶中，待咔唑完全溶解后再加入1，10-二溴癸烷(7.2mmol)，加热至60℃反应10小时停止反应，待反应体系温度恢复至室温后，用乙酸乙酯和饱和氯化铵萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥、
脱溶后得到混合物通过柱层析分离提纯得到透明液体9-(10-溴癸基)-9h-咔唑，产率为33.3％。其核磁数据为：1h nmr(cdcl3，500mhz)δ8.12(2h，d，j＝10.0hz，carbazole-4，5)，7.48(2h，t，j＝7.5hz，carbazole-2，7)，7.42(2h，d，j＝10.0hz，carbazole-1，8)，7.25(2h，t，j＝7.5hz，carbazole-3，6)，4.30(2h，t，j＝7.5hz，ch
2-n)，3.40(2h，t，j＝7.5hz，ch2br)，1.85-1.56(4h，m，2ch2)，1.26-1.42(12h，m，6ch2)；
13
c nmr(cdcl3，125mhz)δ140.5，125.7，122.9，120.4，118.8，108.8，43.2，34.2，32.9，29.5，29.4，29.1，28.8，28.2，27.4.
[0044]
实施例2：中间体9-(10-(1h-咪唑-1-基)癸基)-9h-咔唑的制备
[0045]
将咪唑(10.1mmol)和60％的氢化钠(30.0mmol)加入到含50ml干燥四氢呋喃的圆底烧瓶中在冰浴下反应30分钟后，再加入9-(10-溴癸基)-9h-咔唑(9.1mmol)转为常温反应18小时后停止反应。混合物用乙酸乙酯和饱和水萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥、脱溶后得到混合物通过柱层析分离提纯得到浅黄色液体9-(10-(1h-咪唑-1-基)癸基)-9h-咔唑，产率为87.4％。其核磁数据为：1h nmr(500mhz，cdcl3)δ8.10(2h，d，j＝7.6hz，carbazole-4，5)，7.51-7.43(3h，m，carbazole-2，7&imidazole-h)，7.40(2h，d，j＝8.1hz，carbazole-1，8)，7.23(2h，t，j＝7.5hz，carbazole-3，6)，7.05(1h，s，imidazole-h)，6.88(1h，s，imidazole-h)，4.29(2h，t，j＝7.2hz，n-ch2)，3.88(2h，t，j＝7.1hz，ch2n-imidazole)，1.91-1.81(2h，m，nch2ch2)，1.75-1.70(2h，m，ch2ch2n-imidazole)，1.42-1.18(12h，m，6ch2)；
13
c nmr(cdcl3，126mhz)δ140.5，137.2，129.4，125.7，122.9，120.4，118.9，118.8，108.7，47.1，43.1，31.1，29.5，29.4，29.3，29.1，27.4，26.6.
[0046]
实施例3：1-(10-(9h-咔唑-9-基)癸基)-3-甲基-1h-咪唑-3-碘化物的制备
[0047]
称取9-(10-(1h-咪唑-1-基)癸基)-9h-咔唑(0.8mmol)和碘化钾(8.0mmol)溶解在含10ml乙腈的耐压瓶中，在70℃下反应10小时停止反应。通过真空冷凝脱溶得到的混合物利用柱层析分离提纯得到目标化合物9-(10-(9h-咔唑-9-基)癸基)-3-甲基-1h-咪唑-3-碘化物，黄色油状物，产率80.5％。
[0048]
实施例4：1-(10-(9h-咔唑-9-基)癸基)-3-(4-甲基苄基)-1h-咪唑-3-氯化物的制备
[0049]
称取9-(10-(1h-咪唑-1-基)癸基)-9h-咔唑(0.4mmol)和4-甲基苄氯(4.0mmol)溶解在含10ml乙腈的耐压瓶中，在70℃下反应10小时停止反应。通过真空冷凝脱溶得到的混合物利用柱层析分离提纯得到目标化合物9-(10-(9h-咔唑-9-基)癸基)-3-(4-甲基苄基)-1h-咪唑-3-氯化物，白色固体，产率86.4％，熔点：74.5-76.5℃。
[0050]
其它目标化合物，采用相应的原料或取代基，参照上述实施例步骤合成。
[0051]
合成的含咔唑基咪唑盐类化合物的结构及核磁共振氢谱和碳谱数据如表1所示，部分化合物的理化性质如表2所示。
[0052]
表1 化合物的核磁共振氢谱和碳谱数据
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058][0059]
表2 目标化合物的理化性质
[0060][0061]
[0062]
实施例5：复合物10@cb[7]的制备
[0063]
挑选具有一定代表性的高活性的目标化合物10(2mm)加入到1ml的去离子水中，然后加入当量的cb[7](摩尔比＝1∶1)充分混合均匀、超声后得到主客体复合物10@cb[7]溶液。
[0064]
实施例6：复合物10@cb[7]加ad的制备
[0065]
称取相同摩尔量的ad加入到复合物10@cb[7]溶液中(摩尔比＝1∶1)，然后通过超声、混匀得到化合物10和ad@cb[7]的混合溶液。通过以上方式可以释放出活性化合物10。
[0066]
药理实施例1：
[0067]
ec
50
(median effective concentration)是评价植物病原菌对化合物敏感性的重要指标，同时也是对目标化合物作用机制研究时，化合物浓度设置的重要参数。在浓度梯度实验中，采用二倍稀释法设定合适的5个浓度，最后将药剂对植物病原菌的抑制率、药剂浓度换算成对数值，通过spss软件回归分析得到毒力曲线，计算出ec
50
。
[0068]
采用浊度法测试目标化合物对植物病原菌的有效中浓度ec
50
，试验对象为水稻白叶枯病菌(xoo)和柑橘溃疡病菌(xac)。dmso溶解在培养基中作为空白对照。将水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病原菌在m210固体培养基)放到nb培养基中，在28℃、180rpm恒温摇床中振荡培养到对数生长期备用；将柑橘溃疡病菌(在m210固体培养基上)放到nb培养基中，在28℃、180rpm恒温摇床中振荡培养到对数生长期备用。将药剂(化合物)配置成不同浓度(例：20，10，5，2.5，1.25μg/ml)的含毒nb液体培养基5ml加入到试管中，分别加入40μl含有植病细菌的nb液体培养基，在28-30℃、180rpm恒温摇床中振荡，其水稻白叶枯病原菌培养36h，柑橘溃疡病菌培养48h。将各个浓度的菌液在分光光度计上测定od
595
值，并且另外测定对应浓度的含毒无菌nb液体培养基的od
595
值，目标化合物的实验结果如表3所示。
[0069]
校正od值＝含菌培养基od值-无菌培养基od值
[0070]
抑制率％＝[(校正后对照培养基菌液od值-校正含毒培养基od值)/校正后对照培养基菌液od值]
×
100
[0071]
表3 含咔唑基咪唑盐类化合物对水稻白叶枯病菌和柑橘溃疡病菌的ec
50
[0072][0073]
从表3中可以看出，在离体抗菌试验中，目标化合物对植物致病病原菌(如水稻白叶枯病菌和柑橘溃疡病菌)表现出了优异的生物活性，其抗菌活性皆在1μg/ml左右，远远低于商品对照药——叶枯唑(39.0μg/ml和56.5μg/ml)和噻菌铜(62.3μg/ml和69.8μg/ml)。以上结果表明含咔唑基咪唑盐类化合物可用于制备抗植物致病病原细菌农药。
[0074]
药理实施例2：
[0075]
基于目标化合物的抗菌活性以及理化性质，选择目标化合物10为特征分子进行超分子药物可控释放实验。
[0076]
(1)药物可控释放离体平板实验(抗水稻白叶枯病菌)
[0077]
利用平板法验证超分子药物可控释放策略。具体方法如下：a.将水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病原菌在m210固体培养基)放到nb培养基中，在28℃、180rpm恒温摇床中振荡培养到对数生长期，然后离心(7200rpm，4℃，2min)去除培养基，剩下的水稻白叶枯病菌用pbs(ph＝7.2，浓度为10mm)重悬离心两次后，在用pbs重悬菌液(od
595
＝1.0)备用；b.取100μl上述备用的菌液到400μl的药液(化合物10、金刚烷胺(ad)、cb[7]、ad@cb[7]和10@cb[7]、空白)中在28℃、180rpm恒温摇床中振荡培养9h，另外的一组分(10@cb[7])培育20分钟后，加入等摩尔量的ad，然后培育9h；c.将上述培养好的不同组分的菌液逐步稀释20万倍，取100μl接种于固体nb培养基后，在28℃的培养箱培养3天，三天后数菌落的个数计算抑制率。
[0078]
抑制率％＝[(空白平板的菌落个数-含药平板的菌落个数)/空白平板的菌落个
数]
×
100
[0079]
如图1所示，根据结果可知：在20μm下化合物10的抗菌活性为100％，而金刚烷胺(ad)、cb[7]和ad@cb[7]在此浓度下皆无抗菌活性。超分子复合物10@cb[7]的抗菌能力降至30％左右，但是当加入ad通过分子竞争作用将化合物10的活性位点从cb[7]中释放出来时，其抗菌能力明显恢复至100％左右。这一实验结果表明：本设计提出的超分子药物可控释放策略是可行的。
[0080]
(2)药物可控释放活体毒理实验
[0081]
配置不同组分的药液(化合物10、金刚烷胺(ad)、cb[7]、ad@cb[7]、10@cb[7]和10@cb[7] ad)和水溶液各30ml喷洒于水稻植株上(水稻品种：丰优香占，培育时间：8周)，待7天后观察植株叶片的变化。其中10@cb[7] ad组分是在先喷洒复合物10@cb[7]20分钟以后再喷洒ad。
[0082]
从植物毒理实验可以得出以下结论：含咔唑咪唑盐类化合物(化合物10)对植株具有较高的生物毒性，但是通过主客体相互作用制备的复合物10@cb[7]对植物几乎无植物毒性，同时当喷洒金刚烷胺在已进喷洒复合物10@cb[7]植株上将药物缓慢释放出来时，也降低了药物(化合物10)对植株的生物毒性(几乎无毒)。同时也证明了cb[7](b)、ad(c)和ad@cb[7]不存植物毒性。综上所述，上述实验证明可以通过超分子手段在不需要的时候封装药物的活性，降低药物对生物体的毒性，同时可以通过可控的方式缓慢的释放药物的生物活性从而降低药物的毒性。
[0083]
(3)药物可控释放活体盆栽实验
[0084]
利用剪叶法测试药物在活体中抗水稻白叶枯病菌的生物活性。具体方法如下：用消毒的剪刀蘸取含水稻白叶枯病菌(od
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＝0.8)的菌液接种于水稻植株上(水稻品种：丰优香占，培育时间：8周)。保护活性是先将100μg/ml的药液(金刚烷胺(ad)、cb[7]、ad@cb[7]、10@cb[7]、10@cb[7] ad和阳性对照药噻菌铜)均匀的喷洒于水稻叶片上，待24小时后接菌；治疗活性是先在水稻植株上接菌，待24小时后将200μg/ml的药液均匀的喷洒于水稻叶片上；其中10@cb[7] ad组分是先将复合物10@cb[7]喷洒于水稻20分钟后再喷洒ad。最后将处理好的样品放在人工气候室(温度：28℃，湿度：90％)中培育14天后，通过分级标准计算方法获得相应的防控效果。
[0085]
分级标准如下：
[0086]
首先测量每片叶子的斑点面积和整个叶子面积，然后测量整个斑点面积的百分比计算叶面积。其次，按照以下等级标准对这些叶子进行分类：1级，病斑面积不到整个叶子面积的5％。3级，病斑面积占全叶面积的6-10％；5级，病斑面积5占全叶面积的11-20％；7级，病斑面积占全叶面积的21-50％；9级，病斑面积占整个叶片面积的50％以上；目标化合物实验结果如表4所示。
[0087]
病情指数的计算方法如下：
[0088]
病情指数＝∑(每个等级的叶片数
×
相应等级)/(叶片总数
×
最高级)
[0089]
防效计算方法如下：
[0090]
防效％＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100％
[0091]
表4 10@cb[7] ad、10@cb[7]、ad@cb[7]、ad、cb[7]对水稻白叶枯病的防治效果
[0092][0093]a阴性对照组。b采用方差分析进行统计分析，假设等方差(p＞0.05)和不假设等方差(p＜0.05)。不同大写字母(a、b和c)表示各个处理组之间存在的差异显著(p＜0.05)。
[0094]
从表4中可知：化合物ad、cb[7]、ad@cb[7]、10@cb[7]对水稻白叶枯病几乎没有防治效果；而当喷洒ad将活性物质(化合物10)释放出来时，药物恢复了抗菌活性，其对水稻白叶枯病表现出良好的保护活性(42.6％)和治疗活性(35.5％)，且防治效果与商品药叶枯唑(33.4％，36.2％)相当，略高于商品药噻菌铜(36.7％，29.8％)。以上结果说明：将超分子药物可控释放策略用于解决因对生物体具有较高的毒性而无法使用的高活药物的应用问题是一种可行性的方案。