一种利那洛肽的合成和纯化方法与流程

1.本发明属于医药合成领域，具体涉及一种利那洛肽的合成和纯化方法。


背景技术：

2.利那洛肽（linaclotide）是首个鸟苷酸环化酶（gc）激动剂类药物，口服进入人体后通过与肠道中的鸟苷酸环化酶c型受体（gc-c）结合，使细胞内和细胞外环鸟苷酸（cgmp）浓度升高, 刺激肠液分泌，加快胃肠道移行，从而增加排便频率。2012年，利那洛肽被美国食品和药物管理局（fda）批准可以用于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症（ibs-c），由于其独一无二的作用机制，很有希望成为一种不但可以治疗便秘，还可以治疗腹胀、腹痛和其它临床症状的治疗药物。利那洛肽为含有三对二硫键的十四肽，其肽链中的二硫键连接方式为cys1-cys6，cys2-cys10，cys5-cys13。目前，对利那洛肽的合成主要以自由氧化法形成三对二硫键为主，选择性氧化合成利那洛肽的研究很少。


技术实现要素：

3.利那洛肽线性主链n端到c端的氨基酸顺序如下：nh
2-cys
1-cys
2-glu
3-tyr
4-cys
5-cys
6-asn
7-pro
8-ala
9-cys
10-thr
11-gly
12-cys
13-tyr
14-cooh；二硫键分别位于cys1-6、cys2-10、cys5-13。
4.利那洛肽氨基酸的偶联单体的使用顺序：fmoc-tyr(otbu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-tyr(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(stbu)-oh。
5.本发明的目的在于提供一种收率高、可得到高纯度利那洛肽的利那洛肽的合成方法。
6.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种利那洛肽的合成方法，包括：将含有fmoc-tyr(otbu)-oh的利那洛肽氨基酸活化偶联液和载体树脂反应，得到fmoc-tyr(otbu)-树脂；fmoc-tyr(otbu)-树脂按利那洛肽氨基酸顺序依次偶联相应氨基酸，得到利那洛肽线性肽树脂；利那洛肽线性肽树脂经第一组氧化体系氧化环化形成首个二硫键后，经裂解反应，再经第二组氧化体系氧化环化形成剩余二硫键，经沉淀得到利那洛肽粗肽；第二组氧化体系中使用了gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺。
7.优选地，利那洛肽氨基酸活化偶联液中含有hbtu、hobt、dmap和dic。
8.优选地，载体树脂为wang树脂或ctc树脂。
9.优选地，首个二硫键位于cys1-6位。
10.优选地，载体树脂经预处理液溶胀，所述预处理液为dmf。
11.优选地，第一组氧化体系为n-氯代琥珀酰亚胺溶液，溶剂为dmf。
12.优选地，第二组氧化体系中n-氯代琥珀酰亚胺溶于乙腈溶液。
13.优选地，cys1及cys6的单体为fmoc-cys(stbu)-oh。
14.优选地，cys2及cys10的单体为fmoc-cys(trt)-oh。
15.优选地，cys5及cys13的单体为fmoc-cys(mmt)-oh。fmoc-cys(mmt)-oh的使用成本较高，与其他保护基团的配合使用，在氧化体系氧化环化过程中提高产率。
16.优选地，利那洛肽氨基酸活化偶联液配制中，将fmoc-tyr(otbu)-oh、hbtu、hobt、dmap加入复合溶剂中，0-5℃的温度下加入dic活化5-30 min，得到利那洛肽氨基酸活化偶联液。
17.更优选地，复合溶剂为dmf与dcm的混合液，复合溶剂中dmf的含量为30-70 wt%。
18.更优选地，利那洛肽氨基酸活化偶联液中fmoc-tyr(otbu)-oh的含量为3-9 wt%。
19.更优选地，利那洛肽氨基酸活化偶联液中hbtu的含量为2.7-8.1 wt%。
20.更优选地，利那洛肽氨基酸活化偶联液中hobt的含量为0.9-3.8 wt%。
21.更优选地，利那洛肽氨基酸活化偶联液中dmap的含量为0.08-0.32 wt%。
22.更优选地，利那洛肽氨基酸活化偶联液dic的含量为1.2-5.2 wt%。
23.优选地，利那洛肽首个氨基酸与树脂的偶联中，将wang树脂加入固相反应柱中，预处理液溶胀0.5-2 h，将利那洛肽氨基酸活化偶联液加入固相反应柱中，在20-40℃的温度下反应1-5 h，反应完成后加入乙酸酐-吡啶混合液进行封闭12 h以上，依次用dmf、dcm洗涤树脂3次以上，每次0.5 min以上，得到fmoc-tyr(tbu)-wang树脂。
24.更优选地，预处理液为dmf，利那洛肽氨基酸活化偶联液的使用量为wang树脂的100-1000 wt%。
25.更优选地，乙酸酐-吡啶混合液中乙酸酐的含量为40-70 wt%。
26.更优选地，预处理液为含有双乙酰乙醇胺和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的dmf溶液，预处理液中双乙酰乙醇胺的含量为0.2-2.4 wt%，预处理液中2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的含量为0.3-1.8 wt%。双乙酰乙醇胺和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟于预处理液中的使用，可以提高对树脂的处理效果，并最终提高得到利那洛肽的总收率。
27.优选地，fmoc的脱除中，fmoc-tyr(tbu)-wang树脂用dmf溶胀0.5-2 h，加入哌啶溶液，反应10-30 min，脱除fmoc保护基团，茚三酮检测保证反应完全。
28.更优选地，哌啶溶液的溶剂为dmf，哌啶溶液中哌啶的质量分数为15-25 wt%。
29.优选地，利那洛肽其他氨基酸的偶联中，按照利那洛肽的氨基酸序列，重复上述步骤进行偶联和脱除fmoc，每接完一个氨基酸以后，用茚三酮进行检测，显色反应为阴性则进入下一个偶联循环，否则重复偶联步骤，全部偶联完成后得到利那洛肽线性肽树脂。脯氨酸用溴酚蓝法检测。
30.优选地，利那洛肽线性肽首对二硫键的氧化中，将利那洛肽线性肽树脂加入脱stbu裂解液中，处理1-4 h，然后dmf洗涤3次以上，抽干，得到脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂，然后将脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂加入dmf中，再加入n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液，20-40℃搅拌6-24 h，形成第一对二硫键cys1-cys6，得到首对二硫键利那
洛肽线性肽树脂。
31.更优选地，脱stbu裂解液包括β-巯基乙醇、n-甲基吗啉、dmf。
32.更优选地，脱stbu裂解液中β-巯基乙醇的含量为16-24 wt%，脱stbu裂解液中n-甲基吗啉的含量为0.3-0.9 wt%。
33.更优选地，利那洛肽树脂的使用量为脱stbu裂解液的5-10 wt%。
34.更优选地，脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂的使用量为dmf的5-10 wt%。
35.更优选地，n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液中n-氯代琥珀酰亚胺的含量为40-60 wt%。
36.更优选地，n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液的使用量为脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂的使用量的60-90 wt%。
37.优选地，首对二硫键利那洛肽线性肽的裂解分离中，将首对二硫键利那洛肽线性肽树脂加入脱树脂裂解液中，20-40℃搅拌1-4 h，抽滤，用tfa洗涤3次以上，然后将滤液合并，减压浓缩除去50-80 wt%溶剂，加入冰乙醚沉淀，离心得到首对二硫键利那洛肽线性肽。
38.更优选地，脱树脂裂解液包括tfa、tis和水。
39.更优选地，脱树脂裂解液中tfa的含量为90-95 wt%。
40.更优选地，脱树脂裂解液中tis的含量为2-4 wt%。
41.更优选地，脱树脂裂解液的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽树脂的300 wt%以上。
42.优选地，利那洛肽其他二硫键的氧化中，将首对二硫键利那洛肽线性肽加入去离子水中得到首对二硫键利那洛肽线性肽溶液，再加入gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液，20-40℃的温度下反应6-24 h，反应结束后减压浓缩除去50-80 wt%溶剂，加入冰乙醚析出沉淀，得到利那洛肽粗肽。gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺于去离子水和乙腈的溶液中，形成氧化体系，使首对二硫键利那洛肽线性肽的其他二硫键氧化形成，经hplc分离纯化后，具有高的总收率，并且得到的利那洛肽的纯度高。
43.更优选地，首对二硫键利那洛肽线性肽溶液中首对二硫键利那洛肽线性肽的含量为0.6-1.8 wt%。
44.更优选地，gssg的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的1.2-3.6 wt%。
45.更优选地，n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的0.3-0.9 wt%。
46.更优选地，n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液中n-氯代琥珀酰亚胺的含量为40-60 wt%。
47.更优选地，n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液的添加量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的8-24 wt%。
48.一种利那洛肽的纯化方法，包括：上述的一种利那洛肽的合成方法；以及，将利那洛肽粗肽经高效液相分离纯化得到利那洛肽。
49.本发明公开了gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺在制备利那洛肽中的用途。
50.本发明由于采用了含有gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的
第二氧化体系制备利那洛肽，因而具有如下有益效果：利那洛肽的总收率高，收率为14-21%；纯化后的利那洛肽的纯度高，纯度为99%以上。因此，本发明是一种收率高、可得到高纯度利那洛肽的合成方法。
附图说明
51.图1为利那洛肽标准品hplc图；图2为利那洛肽粗肽hplc图；图3为利那洛肽总收率图。
具体实施方式
52.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：实施例1：一种利那洛肽的合成方法，利那洛肽线性主链n端到c端的氨基酸顺序如下：nh
2-cys
1-cys
2-glu
3-tyr
4-cys
5-cys
6-asn
7-pro
8-ala
9-cys
10-thr
11-gly
12-cys
13-tyr
14-cooh。
53.利那洛肽氨基酸活化偶联液配制：将fmoc-tyr(otbu)-oh、hbtu、hobt、dmap加入复合溶剂中，5℃的温度下加入dic活化10 min，得到利那洛肽氨基酸活化偶联液。复合溶剂为dmf与dcm的混合液，复合溶剂中dmf的含量为50 wt%；利那洛肽氨基酸活化偶联液中fmoc-tyr(otbu)-oh的含量为6 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液中hbtu的含量为5.4 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液中hobt的含量为1.8 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液中dmap的含量为0.16 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液dic的含量为2.6 wt%。
54.利那洛肽首个氨基酸与树脂的偶联：将wang树脂加入固相反应柱中，预处理液溶胀1 h，将利那洛肽氨基酸活化偶联液加入固相反应柱中，在30℃的温度下反应3 h，反应完成后加入乙酸酐-吡啶混合液进行封闭12 h，依次用dmf、dcm洗涤树脂3次，每次1 min，得到fmoc-tyr(otbu)-wang树脂。预处理液为dmf，利那洛肽氨基酸活化偶联液的使用量为wang树脂的500 wt%；乙酸酐-吡啶混合液中乙酸酐的含量为60 wt%。
55.fmoc的脱除：fmoc-tyr(otbu)-wang树脂用dmf溶胀1 h，加入哌啶溶液，反应20 min，脱除fmoc保护基团，茚三酮检测保证反应完全。哌啶溶液的溶剂为dmf，哌啶溶液中哌啶的质量分数为20 wt%。
56.利那洛肽其他氨基酸的偶联添加顺序：fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-tyr(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(stbu)-oh。
57.利那洛肽其他氨基酸的偶联：按照利那洛肽的氨基酸序列，重复上述步骤进行偶联和脱除fmoc，每接完一个氨基酸以后，用茚三酮进行检测，显色反应为阴性则进入下一个偶联循环，否则重复偶联步骤，全部偶联完成后得到利那洛肽线性肽树脂。脯氨酸用溴酚蓝法检测。
58.利那洛肽线性肽首对二硫键的氧化：将利那洛肽线性肽树脂加入脱stbu裂解液
中，处理3 h，然后dmf洗涤3次，抽干，得到脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂，然后将脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂加入dmf中，再加入n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液，30℃搅拌12 h，形成第一对二硫键cys
1-cys6，得到首对二硫键利那洛肽线性肽树脂。脱stbu裂解液包括β-巯基乙醇、n-甲基吗啉、dmf，脱stbu裂解液中β-巯基乙醇的含量为21 wt%，脱stbu裂解液中n-甲基吗啉的含量为0.6 wt%，利那洛肽树脂的使用量为脱stbu裂解液的8 wt%，脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂的使用量为dmf的8 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液中n-氯代琥珀酰亚胺的含量为50 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液的使用量为脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂的使用量的80 wt%。
59.首对二硫键利那洛肽线性肽的裂解分离：将首对二硫键利那洛肽线性肽树脂加入脱树脂裂解液中，30℃搅拌2 h，抽滤，用tfa洗涤3次，然后将滤液合并，减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚沉淀，离心得到首对二硫键利那洛肽线性肽。脱树脂裂解液包括tfa、tis和水，脱树脂裂解液中tfa的含量为92 wt%，脱树脂裂解液中tis的含量为4 wt%。脱树脂裂解液的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽树脂的300 wt%。
60.利那洛肽其他二硫键的氧化：将首对二硫键利那洛肽线性肽加入去离子水中得到首对二硫键利那洛肽线性肽溶液，再加入gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液，30℃的温度下反应24 h，反应结束后减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚析出沉淀，得到利那洛肽粗肽。首对二硫键利那洛肽线性肽溶液中首对二硫键利那洛肽线性肽的含量为1.2 wt%，gssg的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的2.4 wt%，n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的0.39 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液中n-氯代琥珀酰亚胺的含量为50 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液的添加量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的12 wt%。
61.实施例2：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例1相比，不同之处仅在于，利那洛肽其他二硫键的氧化中，n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的0.46 wt%。
62.实施例3：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例1相比，不同之处仅在于，利那洛肽其他二硫键的氧化中，n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的0.72 wt%。
63.实施例4：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例3相比，不同之处仅在于，利那洛肽其他二硫键的氧化：将首对二硫键利那洛肽线性肽加入去离子水中得到首对二硫键利那洛肽线性肽溶液，再加入gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液，30℃的温度下反应12 h，反应结束后减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚析出沉淀，得到利那洛肽粗肽。
64.实施例5：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例3相比，不同之处仅在于，利那洛肽其他二硫键的氧化：将首对二硫键利那洛肽线性肽加入去离子水中得到首对二硫键利那洛肽线性肽溶液，再加入
gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液，30℃的温度下反应18 h，反应结束后减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚析出沉淀，得到利那洛肽粗肽。
65.实施例6：一种利那洛肽的合成方法，利那洛肽线性主链n端到c端的氨基酸顺序如下：nh
2-cys
1-cys
2-glu
3-tyr
4-cys
5-cys
6-asn
7-pro
8-ala
9-cys
10-thr
11-gly
12-cys
13-tyr
14-cooh。
66.利那洛肽氨基酸活化偶联液配制：将fmoc-tyr(otbu)-oh、hbtu、hobt、dmap加入复合溶剂中，5℃的温度下加入dic活化10 min，得到利那洛肽氨基酸活化偶联液。复合溶剂为dmf与dcm的混合液，复合溶剂中dmf的含量为50 wt%；利那洛肽氨基酸活化偶联液中fmoc-tyr(otbu)-oh的含量为6 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液中hbtu的含量为5.4 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液中hobt的含量为1.8 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液中dmap的含量为0.16 wt%，利那洛肽氨基酸活化偶联液中dic的含量为2.6 wt%。
67.利那洛肽首个氨基酸与树脂的偶联：将wang树脂加入固相反应柱中，预处理液溶胀1 h，将利那洛肽氨基酸活化偶联液加入固相反应柱中，在30℃的温度下反应3 h，反应完成后加入乙酸酐-吡啶混合液进行封闭12 h，依次用dmf、dcm洗涤树脂3次，每次1 min，得到fmoc-tyr(otbu)-wang树脂。预处理液为含有双乙酰乙醇胺和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的dmf溶液，预处理液中双乙酰乙醇胺的含量为0.5 wt%，预处理液中2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的含量为0.6 wt%；利那洛肽氨基酸活化偶联液的使用量为wang树脂的500 wt%；乙酸酐-吡啶混合液中乙酸酐的含量为60 wt%。
68.fmoc的脱除：fmoc-tyr(otbu)-wang树脂用dmf溶胀1 h，加入哌啶溶液，反应20 min，脱除fmoc保护基团，茚三酮检测保证反应完全。哌啶溶液的溶剂为dmf，哌啶溶液中哌啶的质量分数为20 wt%。
69.利那洛肽其他氨基酸的偶联添加顺序：fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-tyr(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(stbu)-oh。
70.利那洛肽其他氨基酸的偶联：按照利那洛肽的氨基酸序列，重复上述步骤进行偶联和脱除fmoc，每接完一个氨基酸以后，用茚三酮进行检测，显色反应为阴性则进入下一个偶联循环，否则重复偶联步骤，全部偶联完成后得到利那洛肽线性肽树脂。脯氨酸用溴酚蓝法检测。
71.利那洛肽线性肽首对二硫键的氧化：将利那洛肽线性肽树脂加入脱stbu裂解液中，处理3 h，然后dmf洗涤3次，抽干，得到脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂，然后将脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂加入dmf中，再加入n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液，30℃搅拌12 h，形成第一对二硫键cys
1-cys6，得到首对二硫键利那洛肽线性肽树脂。脱stbu裂解液包括β-巯基乙醇、n-甲基吗啉、dmf，脱stbu裂解液中β-巯基乙醇的含量为21 wt%，脱stbu裂解液中n-甲基吗啉的含量为0.6 wt%，利那洛肽树脂的使用量为脱stbu裂解液的8 wt%，脱去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂的使用量为dmf的8 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液中n-氯代琥珀酰亚胺的含量为50 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的dmf溶液的使用量为脱
去stbu保护基的利那洛肽线性肽树脂的使用量的80 wt%。
72.首对二硫键利那洛肽线性肽的裂解分离：将首对二硫键利那洛肽线性肽树脂加入脱树脂裂解液中，30℃搅拌2 h，抽滤，用tfa洗涤3次，然后将滤液合并，减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚沉淀，离心得到首对二硫键利那洛肽线性肽。脱树脂裂解液包括tfa、tis和水，脱树脂裂解液中tfa的含量为92 wt%，脱树脂裂解液中tis的含量为4 wt%。脱树脂裂解液的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽树脂的300 wt%。
73.利那洛肽其他二硫键的氧化：将首对二硫键利那洛肽线性肽加入去离子水中得到首对二硫键利那洛肽线性肽溶液，再加入gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液，30℃的温度下反应24 h，反应结束后减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚析出沉淀，得到利那洛肽粗肽。首对二硫键利那洛肽线性肽溶液中首对二硫键利那洛肽线性肽的含量为1.2 wt%，gssg的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的2.4 wt%，n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸的使用量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的0.6 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液中n-氯代琥珀酰亚胺的含量为50 wt%，n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液的添加量为首对二硫键利那洛肽线性肽溶液的12 wt%。
74.实施例7：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例6相比，不同之处仅在于，利那洛肽首个氨基酸与树脂的偶联中，预处理液为含有双乙酰乙醇胺和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的dmf溶液，预处理液中双乙酰乙醇胺的含量为1.9 wt%，预处理液中2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的含量为1.2 wt%。
75.实施例8：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例6相比，不同之处仅在于，利那洛肽首个氨基酸与树脂的偶联中，预处理液为含有双乙酰乙醇胺和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的dmf溶液，预处理液中双乙酰乙醇胺的含量为1.6 wt%，预处理液中2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的含量为0.8 wt%。
76.实施例9：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例7相比，不同之处仅在于，利那洛肽其他二硫键的氧化：将首对二硫键利那洛肽线性肽加入去离子水中得到首对二硫键利那洛肽线性肽溶液，再加入gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液，30℃的温度下反应12 h，反应结束后减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚析出沉淀，得到利那洛肽粗肽。
77.实施例10：一种利那洛肽的合成方法，本实施例与实施例7相比，不同之处仅在于，利那洛肽其他二硫键的氧化：将首对二硫键利那洛肽线性肽加入去离子水中得到首对二硫键利那洛肽线性肽溶液，再加入gssg、n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸和n-氯代琥珀酰亚胺的乙腈溶液，30℃的温度下反应18 h，反应结束后减压浓缩除去60 wt%溶剂，加入冰乙醚析出沉淀，得到利那洛肽粗肽。
78.实施例11：
一种利那洛肽的纯化方法，利那洛肽粗肽：将实施例1得到的利那洛肽粗肽溶于去离子水中得到利那洛肽粗肽溶液，高效液相分离，冻干，得到利那洛肽纯品。利那洛肽粗肽溶液中利那洛肽粗肽的含量为2.7 wt%。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.13%。
79.高效液相条件，流动相a：水（含体积分数为0.1%的tfa）；流动相b：乙腈（含体积分数为0.1%的tfa）；流动相梯度：流动相a为50%-85%（体积分数），30 min；流速：2 ml/min；检测波长220 nm。
80.以利那洛肽标准品出峰位置，确定纯化后利那洛肽的收集，旋转蒸发除去乙腈，冻干得到多肽纯品。
81.实施例12：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例2。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.28%。
82.实施例13：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例3。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.19%。
83.实施例14：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例4。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.32%。
84.实施例15：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例5。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.26%。
85.实施例16：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例6。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.18%。
86.实施例17：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例7。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.24%。
87.实施例18：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实
施例8。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.17%。
88.实施例19：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例9。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.33%。
89.实施例20：一种利那洛肽的纯化方法，本实施例与实施例11相比，不同之处仅在于，本实施例所用利那洛肽粗肽来自实施例10。本实施例得到利那洛肽纯品的纯度为99.25%。
90.对比例1：一种利那洛肽的合成方法，本对比例与实施例3相比，不同之处仅在于，利那洛肽其他二硫键的氧化中未使用n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸。
91.对比例2：一种利那洛肽的合成方法，本对比例与实施例7相比，不同之处仅在于，预处理液中未含有2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟。
92.对比例3：一种利那洛肽的合成方法，本对比例与实施例7相比，不同之处仅在于，预处理液中未含有双乙酰乙醇胺。
93.试验例1：高效液相条件，流动相a：水（含体积分数为0.1%的tfa）；流动相b：乙腈（含体积分数为0.1%的tfa）；流动相梯度：流动相b为15%-50%（体积分数），35 min；流速为1 ml/min；柱温：40℃；检测波长220 nm。
94.利那洛肽标准品的高效液相色谱检测。
95.实施例1-10得到的利那洛肽粗肽的高效液相色谱检测及分离。
96.利那洛肽收率的计算：按照产物的hplc在220 nm的色谱峰面积进行计算。
97.利那洛肽标准品的高效液相色谱图如图1所示，表明按本发明方法处理利那洛肽标准品的出峰时间为15.226 min。
98.本发明实施例1方法制备得到的利那洛肽粗肽的高效液相色谱图如图2所示，表明按本发明方法在15.107 min位置出峰的物质为利那洛肽，本发明方法成功得到利那洛肽。
99.本发明合成方法得到的利那洛肽的总收率如图3所示，其中，a为实施例1，b为实施例2，c为实施例3，d为实施例6，e为实施例7，f为对比例1，g为对比例2，h为对比例3；其中，实施例3制备得到的利那洛肽总收率为17.21%，对比例1制备得到的利那洛肽总收率为9.26%，实施例3与对比例1相比，表明n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸的使用，大大提高了利那洛肽总收率，表明n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸与gssg、n-氯代琥珀酰亚胺联用时，具有意想不到的效果；实施例3与实施例1-2相比，表明随着n-乙酰基-3-巯基-d-缬氨酸的使用量的增加，利那洛肽的总收率随之提高；实施例6-7与实施例3相比，表明采用本发明方法制备利那洛肽时，在对wang树脂进行溶胀预处理时，使用含有双乙酰乙醇胺和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮
肟的dmf溶液作为预处理液对wang树脂进行预处理，可以进一步提高利那洛肽的总收率；实施例7与对比例2相比，表明当使用含有双乙酰乙醇胺的dmf溶液作为预处理液对wang树脂进行预处理，相对于dmf作为预处理液对wang树脂预处理而得到的利那洛肽的总收率基本没有变化，含有2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟和双乙酰乙醇胺的dmf溶液的使用优于含有双乙酰乙醇胺的dmf溶液，实施例7与对比例3相比，表明当使用含有2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的dmf溶液作为预处理液对wang树脂进行预处理，相对于dmf作为预处理液对wang树脂预处理而得到的利那洛肽的总收率同样相当于没有变化，含有2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟和双乙酰乙醇胺的dmf溶液的使用优于含有2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟的dmf溶液，实施例7与对比例2-3之间相比，可以发现当预处理液中含有双乙酰乙醇胺与2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮肟时，对wang树脂的预处理，可以提高利那洛肽的总收率，具有意想不到的效果。
100.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。