维斯假丝酵母发酵生产长链二元酸的方法、产品与菌种与流程

1.本发明属于生物化工领域，涉及一种维斯假丝酵母发酵生产长链二元酸的方法及产品与菌种。


背景技术：

2.长链二元酸是指碳原子数在c6-c24的二羧酸，通常应用较多的包括10～18个碳原子的直链二羧酸。其中，十二碳二元酸(1,10-dodecanedioic，dda)又称dc12主要应用于合成工程塑料、长链尼龙等制品。生产长链二羧酸的主要方法包括植物油催化法、化学合成法以及生物发酵法。催化植物油、化学合成法由于成本原料等原因已被市场所淘汰。例如，dc12使用化学合成方法需要至少9个复杂的反应步骤,生产时需要防火、防爆和防毒装置。而生物发酵法常温常压下就能生产，且具备成本优势。
3.虽然多种微生物特别是假丝酵母可以通过生物发酵法发酵生产十二碳二元酸的方法，但是由于原料烷烃吸收问题，菌种密度较低，变相延长了整个发酵周期，使得生产效率不高，一直以来是困扰二元酸工业的难题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够在较短时间获得多种长链二元酸产品的菌种及方法。虽然很多微生物如细菌、霉菌、酵母菌，都有一定氧化烷烃生产二羧酸的能力，酵母菌是所有微生物中氧化烷烃产二羧酸能力最强的，能够转化烷烃生产长链二羧酸的酵母包括：假丝酵母属(candida)、红酵母属(rhodotorula)、拟球酵母属(torulapsis)、隐球酵母属(cryptococcus)、内孢霉属(endomyces)、丝孢酵母属(trichosporon)、毕赤氏酵母属(pichia)、白地霉(geotrichum candidum)、酒香酵母属(brettanomyces)、酵母属(saccharomyces)、拟内孢霉属(endomycopsis)。其中，假丝酵母属中许多种类，如热带假丝酵母、解脂假丝酵母、维斯假丝酵母等，是转化烷烃制取二羧酸的优质菌种，目前工业上应用较多包括热带假丝酵母与维斯假丝酵母，其利用烷烃的能力是所有假丝酵母属中最强的，也是工业上生产长链二羧酸的菌种。
5.假丝酵母转换烷烃通常经过两个步骤：
6.iα氧化反应过程：即通过细胞吸收烷烃后，烷烃末端甲基率先在微粒体中被由细胞色素p450酶和细胞色素组成的还原酶氧化成羟基，在细胞质中羟基被醇脱氢酶和醛脱氢酶依次氧化成醛基和羧基，以生成一元酸；以及
7.iiω氧化反应过程：一元酸继续进行ω氧化得到ω羟基酸，然后最终被氧化为二羧酸；其次，一元酸也可继续进入微体内进行β氧化，最终被代谢成二氧化碳和水。以上两种代谢途径取决于菌株的ω和β氧化能力的强弱。ω氧化能力强，发酵得到的二羧酸产量就大，β氧化能力强菌株消耗的烷烃就多，最终产物二羧酸的积累量就少。此外，进行ω氧化生产的二羧酸在胞内积累过多时也会进入β代谢过程，最终被代谢消耗。因此，在实际生产过程中既要有效使得细胞容易吸收烷烃，并且将二羧酸产物可以有效分泌到胞外，同时减少
不必要的β代谢过程。
8.基于上述发现，本发明通过在含烷烃(生产使用废弃石蜡油)废渣中使用形态观察结合人工筛选的方法，筛选出一株维斯假丝酵母(保藏编号cctcc m 2021097，保藏日期2021年1月8日，保藏地点：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，其一方面能实现多种二元酸产品的发酵生产，另一方面，该菌株细胞通透性更佳，可以在发酵初期进行烷烃发酵，无需种子罐发酵，可以大大减少了初期接种发酵培养时间。
9.维斯假丝酵母(cctcc m 2021097)的培养特征如下：
10.原料包括碳源的混合物，包含一种或多种选自糖、纤维素、烷烃、脂肪酸、三酰甘油、石蜡等或它们的组合的碳源。
11.氮源可自无机(例如，(nh4)2so4)或有机来源(例如，脲或谷氨酸)供应。除合适的碳源和氮源外，培养基还可含有适合微生物培养的适当矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素、金属离子(例如，mn
2
、co
2
、zn
2
、mg
2
)和其他组分。或使用酵母复合培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖肉汤(ypd))或其他可商品化制备的通用酵母培养基中培养维斯假丝酵母。
12.本发明的一个实施方案中，可以选择麦芽汁琼脂培养基，例如ypd培养基：10g/l酵母膏；20g/l蛋白胨；20g/l葡萄糖，自然ph。主要用于菌种的活化和保藏。
13.液体发酵培养基包括：碳源10-90g/l，磷酸钠4～15g/l，最好为6～10g/l，酵母膏3～8g/l，玉米浆3～8g/l，尿素0.5-1.5g/l，nacl 0.5-1g/l，kcl 1-10g/l，消泡剂0.5-1.5g/l。
14.发明所述的发酵转化烷烃生产长链二元酸的方法是以维斯假丝酵母(cctcc m 2021097)为发酵菌种，在以添加正烷烃的发酵培养基中同步发酵，生产α，ω-长链二元酸，所述步骤包括：
15.直接将维斯假丝酵母(cctcc m 2021097)的平面培养物种子接入ph值为5.5～9.0的发酵培养基。所述混合液24～29℃发酵20～40小时，然后将生产的长链二元酸进行分离纯化。更优选地，所述混合液在ph 6.0～7.5下24～29℃下发酵生产24～36小时，然后将生产的长链二元酸进行分离纯化。更优选地，在培养初期通过补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞40％(v/v)。
16.优选地，本发明还包括将发酵液中产物长链二元酸分离回收阶段优选地，本发明还包括将的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集dc12钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集dc12钠盐和dc12，用水或有机溶剂进行重结晶，得到dc12白色结晶。
17.本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
18.用本发明的维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)菌株和发酵方法，可在工业化发酵罐，从nc12发酵生产dc12时，仅培养40小时以内即可以实现产酸162g/l。发酵40h结束，产酸速率超过4.05g/h
·
l。此外，一元酸的含量小于0.0001％，特别适合高性能尼龙、增塑剂以及润滑油等下游应用。
具体实施方式
19.为使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本公开实施例中，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本公开
2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养8h进行活化。
42.3、发酵培养阶段：
43.将固体培养基接种于装5l发酵培养基的10l发酵罐中，初始ph6.0，温度27℃，通气量1∶1，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸89g/l，培养36h时产酸130g/l，36h后产酸量维持不变。发酵40h结束，产酸速率为3.25g/h
·
l。
44.其中，dc12回收方法为有机溶剂回收法，发酵结束后，用6n的hcl调节ph至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到dc12白色结晶，用中性乙醇溶解后，用标准naoh溶液滴定，计算出发酵液中dc12纯度99.61％，其中一元酸含量0.0002％。
45.实施例2：
46.发酵合成长链二元酸(dc12)发酵罐(50l)的过程如下：
47.1、培养基配制
48.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
49.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
50.2、种子培养阶段
51.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
52.3、发酵产酸阶段：
53.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装35l液体发酵培养基的50l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸99.1g/l，培养36h时产酸162g/l。发酵40h结束，产酸速率为4.05g/h
·
l。
54.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc12产品。dc12纯度达到99.87％，其中一元酸的含量0.0001％。
55.实施例3：
56.发酵合成长链二元酸(dc13)的过程如下：
57.1、培养基配制
58.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
59.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
60.2、种子培养阶段
61.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。
62.3、发酵阶段：
63.将获得的培养物以2％重量的接种量接种于装189l发酵培养基的500l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正
十三烷，使发酵液中正十三烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸90.5g/l，培养36h时产酸152g/l。发酵40h结束，产酸速率为3.8g/h
·
l。
64.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc13，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc13产品。dc13纯度达到99.85％，其中一元酸的含量0.002％。
65.实施例2：
66.发酵合成长链二元酸(dc12)发酵罐(50l)的过程如下：
67.1、培养基配制
68.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
69.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
70.2、种子培养阶段
71.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
72.3、发酵产酸阶段：
73.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装35l液体发酵培养基的50l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸99.1g/l，培养36h时产酸162g/l。发酵40h结束，产酸速率为4.05g/h
·
l。
74.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc12产品。dc12纯度达到99.87％，其中一元酸的含量0.0001％。
75.实施例2：
76.发酵合成长链二元酸(dc12)发酵罐(50l)的过程如下：
77.1、培养基配制
78.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
79.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
80.2、种子培养阶段
81.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
82.3、发酵产酸阶段：
83.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装35l液体发酵培养基的50l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸99.1g/l，培养36h时产酸162g/l。发酵40h结束，产酸速率为4.05g/h
·
l。
84.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，
合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc12产品。dc12纯度达到99.87％，其中一元酸的含量0.0001％。
85.实施例3：
86.发酵合成长链二元酸(dc11)发酵罐(50l)的过程如下：
87.1、培养基配制
88.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
89.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
90.2、种子培养阶段
91.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
92.3、发酵产酸阶段：
93.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装35l液体发酵培养基的50l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸92.1g/l，培养36h时产酸168g/l。发酵40h结束，产酸速率为4.2g/h
·
l。
94.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc11，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc12产品。dc11纯度达到99.87％，其中一元酸的含量0.0001％。
95.实施例4：
96.发酵合成长链二元酸(dc10)发酵罐(50l)的过程如下：
97.1、培养基配制
98.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
99.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
100.2、种子培养阶段
101.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
102.3、发酵产酸阶段：
103.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装35l液体发酵培养基的50l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸89.1g/l，培养36h时产酸142g/l。发酵40h结束，产酸速率为3.55g/h
·
l。
104.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc10，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc10产品。dc10纯度达到99.97％，其中一元酸的含量0.0004％。
105.实施例5：
106.发酵合成长链二元酸(dc14)发酵罐(50l)的过程如下：
107.1、培养基配制
108.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
109.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
110.2、种子培养阶段
111.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
112.3、发酵产酸阶段：
113.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装35l液体发酵培养基的50l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸93.1g/l，培养36h时产酸122g/l。发酵40h结束，产酸速率为3.05g/h
·
l。
114.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc14下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc14产品。dc14纯度达到99.87％，其中一元酸的含量0.0001％。
115.实施例6：
116.发酵合成长链二元酸(dc18)发酵罐(5l)的过程如下：
117.1、培养基配制
118.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
119.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
120.2、种子培养阶段
121.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
122.3、发酵产酸阶段：
123.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装3l液体发酵培养基的5l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸78.1g/l，培养36h时产酸150g/l。发酵40h结束，产酸速率为3.75g/h
·
l。
124.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc18，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc12产品。dc18纯度达到99.67％，其中一元酸的含量0.0003％。
125.实施例7：
126.发酵合成长链二元酸(dc13)发酵罐(50l)的过程如下：
127.1、培养基配制
128.①
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
129.②
发酵培养基:葡萄糖35g/l，磷酸氢二钠8g/l，酵母膏3g/l，玉米浆5g/l，尿素1.5g/l，nacl 0.5g/l，kcl 1g/l，吐温1.5g/l。
130.2、种子培养阶段
131.取一环维斯假丝酵母(candida viswanathii cctcc m 2021097)涂布在20
×
180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养10h。收集斜面上活化的种子培养物。
132.3、发酵产酸阶段：
133.将获得的种子培养物2％重量的接种量接种于装35l液体发酵培养基的50l发酵罐中，初始ph 7.0，温度28℃，通气量1∶0.7，发酵罐转速120转/分，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20％(v/v)，培养24h产酸96.7g/l，培养36h时产酸138g/l。发酵40h结束，产酸速率为3.45g/h
·
l。
134.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc13，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc13产品。dc13纯度达到99.76％，其中一元酸的含量0.0002％。
135.对比例1：
136.该对比例使用热带假丝酵母uh-2-48，保藏号为cgmcc no.0239菌株(参见专利zl 95117436.3)，其他方法同实施例1即：
137.(1)、取一接种环热带假丝酵母uh-2-48菌体，涂布在15
×
180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。
138.(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有kh2po
4 8g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，ph5.0。
139.(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6n naoh调一次ph至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含kh2po
4 10g/l，蔗糖20/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nc12 200ml/l，自来水配置，ph7.2。在110℃下灭菌30分钟。
140.发酵结束后，用6n的hcl调节ph至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到dc12白色粉末，用15ml中型乙醇溶解后，用标准naoh溶液滴定，计算出发酵液中dc12含量为67.7g/l，纯度98.11％，其中一元酸的含量为大于2.2％。
141.通过比较发现本发明的实施例1获得产品周期明显缩短。
142.对比例2：
143.该对比例使用热带假丝酵母uh-2-48，保藏号为cgmcc no.0239菌株(参见专利zl 95117436.3)，其他方法同实施例2即：
144.(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。
145.(2)把3000ml培养两天，od(
×
30，620nm)为0.81ph 3.8，健壮，热带假丝酵母uh-2-48无杂菌种液接入装有700l种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm2，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。
146.(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700l种液接入装有6.5m3种子培养基，经过121
℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.7，培养40～24小时，作为发酵的种子。
147.(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的无杂菌种液种液，接入装有33m3发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m3发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.5，开始时，nc
12
4m3，30小时内，体系ph控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生20.1g/ldc
12
，然后体系ph在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到108g/l，70小时后每天补加一定量nc
12
，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达133g/l，发酵到163小时结束，产酸量达143g/l，发酵速率0.88g/h
·
l。
148.发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc
12
，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色粉末状dc
12
产品。dc
12
纯度达到96.35％，其中一元酸的含量大于1.5％。
149.通过比较发现本发明的实施例2的获得产品晶体更大，产品体积更小，同时产酸速率明显提高。
150.需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
151.以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。