从妥尔油沥青中提取植物甾醇和甾烷醇的制作方法

1.本公开涉及一种从妥尔油沥青中提取植物甾醇和甾烷醇的方法
技术背景
2.植物甾醇和甾烷醇几乎可以在所有植物中找到，通常以提取物的形式出售。在这种提取物中，β-谷甾醇是主要的亚成分之一，并且在组成上与胆固醇β-谷甾醇或其衍生物非常相似，人服用β-谷甾醇，会有减低胆固醇的功效。
3.因此，从植物中回收β-谷甾醇的想法，对于开发有助于降低血液胆固醇水平的药物制剂和/或营养产品的生产原料很有意义。为了从植物中获得β-谷甾醇，需要通过不同的方式，包括蒸馏、提取和/或结晶，来分离植物甾醇。这些方式通常产生甾醇浓缩物，其中会包含β-谷甾醇，同时也包含α-谷甾醇、菜油甾醇、豆固醇、菜籽固醇、β-谷甾醇、菜油甾烷醇、氧化胆甾醇、三萜醇以及其它成分，例如脂肪醇。在分离β-谷甾醇的过程中，还必须除去其他成分，如纤维、木质素物质和无机盐。
4.植物甾醇的一个很好的来源是粗妥尔油，它是木浆制造所用的硫酸盐制浆法的副产品。粗妥尔油精馏后再得到残余妥尔油沥青，将妥尔油沥青进行处理后可以得到一种甾醇浓缩物。妥尔油沥青由脂肪酸和松香酸的酯类物质、脂肪酸和松香酸的低聚物和氧化衍生物、高沸点中性物质(如烃类、醇类，包括植物甾醇等)和木质素组成。
5.专利号为us 6465665的专利中，描述了一种从妥尔油沥青中获得的中性物质混合物中回收甾醇的持续流程。中性物质的混合物是用石油醚皂化萃取妥尔油沥青后得到的。该方法可回收甾醇含量达41.8％的中性物质。回收中性物质之后，通过精馏塔对其进行蒸馏，以获得第一馏分长链脂肪醇和第二馏分甾醇和酯类。对第二馏分进行第二次蒸馏以分离甾醇和酯类物质。然后将甾醇部分溶解到基本上是液态的碳氢化合物中，也可以与醇和/或水一起溶解。然后将溶液冷却，形成沉淀，从母液中分离出来。母液蒸发形成残留物，在蒸馏前把残留物加入到中性物质的混合物中。总之，根据所述方法从妥尔油沥青中回收的甾醇的收率为94.7％，甾醇的纯度高于95％。然而，所属专利的方法没有描述获得β-谷甾醇或甚至包含高含量β-谷甾醇的混合物的方法。
6.专利号为us 3965085的专利中，描述了一种精炼肥皂的方法。该方法通过使用将低分子量的酮类(如丙酮和/或丁酮)与不溶于水的溶剂如液态烃相结合的提取方法，来分离不可皂化的中性物质。所述不可皂化的中性物质会严重损害粗妥尔油的品质。低分子量的酮类确实可以防止肥皂溶液中乳液的形成，并且即使在酸性条件下也易于除去。在提取过程中，有机相含有不皂化物，水相含有脂肪酸盐和松香酸盐。然后可以分离有机相和水相，从而可以回收到中性物质含量低至1.6％的精制妥尔油。对有机相进行进一步处理，如蒸发和结晶，可以回收β-谷甾醇含量至少为80％的甾醇浓缩物。然而，该研究提到，甾醇浓缩物还包含菜油甾醇、脂肪醇和三萜醇。
7.专利号为wo 2019/050430的专利中，描述了一种从妥尔油沥青中提取植物甾醇的方法。该方法包括使用碱在多元醇中皂化妥尔油沥青的步骤。然后使用石蜡烃混合物作为
溶剂从碱-醇溶液中提取、收集不皂化物。通过蒸馏除去溶剂后，利用结晶的方式分离出既是三萜醇也是细胞毒素的白桦脂醇，并通过精馏浓缩出植物甾醇。因此，所述专利的方法最终提供了一种植物甾醇含量至少为65％，且多余的白桦脂醇杂质不超过0.3％的物质。尽管通过这种方法可以获得不含一种特殊成分(即白桦脂醇)的甾醇浓缩物，但是仍然没有达到妥尔油沥青中提取含量较高的β-谷甾醇的目的，因为该文件整体仅涉及植物甾醇的高度提取。应将额外的成分去除，以提高最终产品中β-谷甾醇的含量，然后将其稳定供应制成药物制剂和/或营养品。
8.专利号为us 2008/0161586的专利中，描述了一种从妥尔油沥青中回收甾醇的方法。在生成中性物质混合物后，通过蒸馏除去脂肪醇。然后使用烃溶剂、醇和水在50℃至70℃的温度下结晶非挥发性残余物。在本公开的实例中，干燥甾醇的气相色谱(gc)分析表明，提取物(甾醇和甾烷醇)的纯度为86.7％，脂肪醇(蜡)含量接近10％。在86.7％的甾醇和甾烷醇中，有6.3％的菜油甾醇、1％的麦角甾烷醇、1％的豆甾醇、69.5％的β-谷甾醇和9％的β-谷甾烷醇(豆甾烷醇)。
9.因此，本发明的目的是提供一种从妥尔油沥青中提取植物甾醇和甾烷醇的改进方法。


技术实现要素：

10.根据第一方面，本公开提供了一种从妥尔油沥青中提取植物甾醇和甾烷醇提取物的方法，所述方法包括以下步骤:
11.a)提供一种妥尔油沥青；
12.b)通过在所述妥尔油沥青中添加基本化合物，生产出皂化的妥尔油沥青；
13.c)用一种或多种非极性芳香族溶剂提取所述皂化的妥尔油沥青，以产生包含中性物质混合物的溶液；
14.d)对所述中性物质的混合物进行蒸馏以获得馏分和底部馏分；
15.e)将所述馏分溶解在混合溶剂中，以获得溶解后的馏分，
16.所述方法的显著之处在于，还包括在结晶条件下对所述溶解的馏分进行结晶的步骤(f),以回收母液和结晶馏分，其中所述结晶馏分会形成植物甾醇和甾烷醇的提取物；所述方法的显著之处还在于步骤(e)中使用的所述混合溶剂包括一种或多种非极性溶剂、一种或多种具有酮部分的溶剂以及一种或多种一元醇和水。
17.令人惊讶之处在于：利用妥尔油沥青获得的中性物质的混合物，就可以获得植物甾醇和甾烷醇的提取物，该提取物含有更高含量的β-谷甾醇和更低含量的杂质。所述中性物质的混合物首先通过蒸馏纯化，以获得挥发性馏分。挥发性馏分溶解在溶剂混合物中，并进行结晶。根据本公开，使用的溶剂的特定混合使得所述结晶非常有效。因此，能获得含有更高含量的主要甾醇和甾烷醇的植物甾醇和甾烷醇的最终提取物。不需要的杂质如α-谷甾醇和氧化胆甾醇在所述结晶步骤中去除了。此外，在最终提取物中没有检测到三萜醇(例如白桦脂醇)。最后，本公开所述的方法可以让提取物中β-谷甾醇含量更高。
18.关于结晶步骤，已经发现要使用含有至少四种溶剂的混合物来获得所需的纯化提取物。事实上，非极性溶剂可以溶解来自所述妥尔油沥青的二萜和三萜烃以及浓缩产物。所述酮部分是一种能够溶解α-谷甾醇的物质。所述一元醇可以溶解所述甾醇。水可以引发所
述甾醇的结晶。
19.在一个优选的实施例中，用所述一种或多种非极性芳香族溶剂萃取所述皂化妥尔油沥青的步骤(c)，是在80℃至比所述一种或多种非极性芳香族溶剂的沸点低至少10℃的温度下进行的，优选地，在85℃至比所述一种或多种非极性芳香族溶剂的沸点低至少15℃的温度下进行。
20.可选地，在步骤(c)之后和步骤(d)之前进行：浓缩包含中性物质混合物的溶液。
21.本公开所述的方法可以用于来自妥尔油沥青的中性物质的任何混合物。然而，令人惊讶地发现，通过用所述一种或多种非极性芳香香族溶剂提取皂化妥尔油沥青，可以增加从妥尔油沥青获得的所述中性物质混合物的量。
22.优选地，步骤(c)中使用的所述一种或多种非极性芳香族溶剂选自甲苯和/或二甲苯；更优选地，步骤(c)中使用的所述非极性芳香族溶剂是甲苯。
23.在一个优选的实施例中，步骤(d)中的蒸馏包括一个或多个蒸馏子步骤，因此步骤(d)的蒸馏包括:
24.d1)对所述中性物质的混合物进行第一次蒸馏，以获得第一馏分和第一底部馏分；
25.d2)对所述第一底部馏分进行第二次蒸馏，以获得第二馏分和第二底部馏分；
26.d3)可选的，对所述第二底部馏分和另外的底部馏分进行一次或多次进一步蒸馏，以获得另外的一种或多种的馏分和另外一种或多种的底部馏分；
27.其中在步骤(e)中溶解在混合溶剂中的所述馏分是所述第二馏分，或者是所述第二馏分与所述第一馏分和/或来自所述一种或多种馏分的至少另外一种馏分的混合物。
28.优选地，其中步骤(d)中的蒸馏包括一个或多个蒸馏子步骤，该方法的特征在于一个或多个蒸馏子步骤是一个或多个使用精馏塔的精馏步骤。
29.优选地，以下参数详细说明了一个或多个精馏步骤：
[0030]-回流比在1/1和2/1之间。
[0031]-精馏温度在240℃和280℃之间，优选在245℃和275℃之间。
[0032]-精馏塔与回流冷凝器耦合；优选地，所述回流冷凝器的温度在110℃和170℃之间。优选地，以下一种或多种实施例可用于更好地说明步骤(e)中使用的所述混合溶剂:
[0033]-步骤(e)中使用的所述混合溶剂包括一种或多种选自戊烷、异戊烷和/或己烷的非极性溶剂；优选地，所述非极性溶剂是或包括己烷.
[0034]-步骤(e)中使用的所述混合溶剂包括一种或多种具有选自丙酮和/或丁酮的酮部分的溶剂；优选地，具有酮部分的溶剂是或包括丙酮。
[0035]-步骤(e)中使用的所述混合溶剂包括一种或多种选自甲醇、乙醇和/或丙醇的一元醇；优选地，一元醇是或包含甲醇。
[0036]
在一个优选的实施例中，所述混合溶剂包括:
[0037]
■
基于所述混合溶剂的总重量，10至60重量百分比的一种或多种非极性溶剂，优选15至55重量百分比，更优选地，20至50重量百分比，甚至更优选地，25至45重量百分比；
[0038]
■
基于所述混合溶剂的总重量，23至40重量百分比的一种或多种具有酮部分的溶剂，优选24至39重量百分比，更优选地，25至38重量百分比，甚至更优选地，26至37重量百分比；
[0039]
■
基于所述混合溶剂的总重量，0.5至2.5重量百分比的水，优选0.6至2.4重量百
分比，更优选地，0.7至2.3重量百分比，甚至更优选地，0.8至2.2重量百分比；
[0040]
■
基于所述混合溶剂的总重量，2至20重量百分比的一种或多种一元醇，优选3至18重量百分比，更优选地，4至17重量百分比，甚至更优选地，5至16重量百分比。在一个优选的实施例中，步骤(e)中所述混合溶剂和所述馏分之间的质量比在1.0和2.0之间；优选地，质量比在1.1至1.7之间；更优选在1.2至1.5的范围内；甚至更优选在1.2至1.4之间，或者在1.2至1.3的范围内。
[0041]
以下一个或多个实施例可更好地说明所述方法的步骤(f):
[0042]-步骤(f)的所述结晶条件包括15℃至25℃的结晶温度和/或至少一小时的结晶时间，优选至少两小时。
[0043]-步骤(f)还包括对所述母液进行额外结晶的步骤，以回收额外的植物甾醇和甾烷醇提取物，所述额外结晶在与步骤(f)相同的结晶条件下进行；优选地，将所述额外的植物甾醇和甾烷醇提取物加到在步骤(f)中回收的所述植物甾醇和甾烷醇提取物中。
[0044]-该方法还包括一项附加步骤：干燥所述植物甾醇和甾烷醇提取物，优选在至少100℃的温度下干燥至少1小时。
[0045]-当所述馏分包含通过气相色谱法-火焰离子化检测器分析确定，基于所述馏分总重量小于或等于2.5重量百分比的α-谷甾醇时，实施步骤(f)，其中α-谷甾醇优选小于或等于2.4重量百分比，更优选小于或等于1.7重量百分比。
[0046]-当所述馏分包含通过气相色谱法-火焰离子化检测器分析确定，基于所述馏分总重量至少20百分比的甾醇时，实施步骤(f)，其中甾醇优选至少25百分比。
[0047]
在一个优选的实施例中，所述方法进一步包括步骤(g)，即在10℃和15℃之间的温度下，用步骤(f)中使用的所述混合溶剂洗涤所述植物甾醇和甾烷醇的提取物，和/或另外的对所述植物甾醇和甾烷醇提取物进行干燥的步骤，优选地，在至少100℃的温度下干燥至少1小时。
[0048]
根据第二方面，本公开提供了一种从妥尔油沥青中获得的植物甾醇和甾烷醇的提取物，所述提取物的显著之处在于通过气相色谱法-火焰离子化检测器分析确定，所述植物甾醇和甾烷醇的提取物包含基于所述植物甾醇提取物总重量的至少65重量百分比的β-谷甾醇和甾烷醇，以及包含氧化胆甾醇、α-谷甾醇和白桦脂醇，其中任意一个含量都小于基于所述植物甾醇和甾烷醇提取物总重量的0.01重量百分比。
附图说明
[0049]
图1是在进行结晶步骤之前的样品的色谱图。
[0050]
图2是结晶步骤后样品的色谱图。
[0051]
详细说明
[0052]
对于本公开，给出了以下定义:
[0053]
这里使用的术语“包括”(“comprising”、“comprises”、“comprised of”)与“包含”(“including”、“includes”、“containing”、“contains”)同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的构件、元素或方法步骤。术语“包括”也包括术语“由...组成”。
[0054]
通过端点列举的数值范围包括所有整数，并且在适当的情况下，包括该范围内的
分数(例如，1至5在涉及例如几个元素时可以包括1、2、3、4、5，并且在涉及例如测量值时也可以包括1.5、2、2.75和3.80)。端点的列举也包括列举的端点值本身(例如从1.0到5.0包括1.0和5.0)。本文列举的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。
[0055]
在一个或多个实施例中，特定的特征、结构、特性或实施例可以以任何合适的方式进行组合，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0056]
本公开提供了一种从妥尔油沥青中提供植物甾醇和甾烷醇提取物的方法，该方法包括以下步骤：
[0057]
a)提供一种妥尔油沥青；
[0058]
b)通过在妥尔油沥青中添加基本化合物，生产出皂化的妥尔油沥青；
[0059]
c)用一种或多种非极性芳香族溶剂提取皂化的妥尔油沥青，以产生包含中性物质混合物的溶液；
[0060]
d)对中性物质的混合物进行蒸馏以获得馏分和底部馏分；
[0061]
e)将馏分溶解在混合溶剂中，以获得溶解的馏分。
[0062]
所述方法的显著之处在于，所述方法还包括在结晶条件下对溶解的馏分进行结晶的步骤(f),以回收母液和结晶馏分，其中结晶馏分即为植物甾醇和甾烷醇的提取物；所述方法的显著之处还在于步骤(e)中使用的混合溶剂包括一种或多种非极性溶剂、一种或多种具有酮部分的溶剂以及一种或多种一元醇和水。
[0063]
从妥尔油沥青生产中性物质混合物
[0064]
通过对粗妥尔油进行精馏获得妥尔油沥青。首先将妥尔油沥青与溶解在水中的一种或多种碱性成分(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铯，优选氢氧化钠)混合进行皂化，同时加热混合物，优选回流的方式。因此，皂化步骤的温度可以在100℃和200℃之间，优选在110℃和190℃之间，更优选在120℃和180℃之间。
[0065]
所述反应可以在带有回流冷凝器的普通玻璃器皿中进行。优选使用迪安-斯塔克裝置，因为该设备可以去除反应器中的水。在反应过程中除去水有助于促进热力学平衡以形成产物，即皂化的妥尔油沥青。
[0066]
反应时间为至少一小时，优选至少两小时，更优选至少三小时。可以通过跟踪在反应过程中去除水的过程(并考虑溶解碱性成分所需的水量)来监测反应，并还可以通过迪安-斯达克装置收集水。
[0067]
反应完成后，在室温下冷却反应介质，即可获得皂化的妥尔油沥青。可以使用任何分液漏斗。优选地，可以通过使用索氏提取装置进行连续提取。
[0068]
提取温度优选在80℃和比提取溶剂的沸点低至少10℃的温度范围内。更优选地，提取温度在85℃和比提取溶剂的沸点低至少15℃的温度之间。提取温度至少为80℃,最多为270℃。
[0069]
已经使用了芳香族非极性溶剂，例如甲苯和/或二甲苯，所述芳香族非极性溶剂能够让来自妥尔油沥青的中性物质混合物的产率为至少45％。其中所述芳香族非极性溶剂优选使用甲苯。
[0070]
也可以使用其他溶剂，例如石蜡族溶剂、环烷烃溶剂和/或萜烯烃。石蜡族溶剂优选选自己烷、庚烷、辛烷、癸烷、十二烷、十三烷、十一烷、石油醚(如nefras-c2)或它们的混合物。环烷烃溶剂优选为十氢化萘。萜烯烃溶剂优选选自不含蒎烯的松节油和/或氢化萜烯
烃。这些溶剂能够让来自妥尔油沥青的中性物质混合物的产率达到至少30％和至多44％。
[0071]
一种妥尔油沥青中性物质的混合物，包括主要的植物甾醇(β-谷甾醇、菜油甾醇)和植物甾醇族群(谷甾烷醇、菜油甾烷醇)。还存在高达5％质量百分比的α-谷甾醇(也称为柠檬甾烷二醇)。所述妥尔油沥青中性物质的混合物还包含脂肪醇，例如脱氢-4-松香醇(dehydro-4-abietol)；pimara-7,15-dien-3-ol；二十二醇和/或二十四醇。其中在妥尔油沥青的中性物质混合物中也发现了其他成分如豆甾烷-3，5-二烯(stigmastan-3,5-diene)；
△
5-燕麦甾烯醇(5-avenasterols)；24-甲基环阿糖醇(24-methylcycloartanol)；白桦酸甲酯(methyl betulate)；白桦脂醇和/或氧化胆甾醇。
[0072]
通过一次或多次精馏分离β-谷甾醇
[0073]
为了获得含有高含量的β-谷甾醇的高纯度植物甾醇提取物，需要提纯中性物质的混合物。
[0074]
所述提纯的第一步通过至少一次蒸馏，优选至少一次精馏来进行。
[0075]
精馏是蒸馏的一种实施方式，其用途包括原油的分馏。如果再次蒸馏在蒸馏过程中获得的馏出物，则获得具有更高浓度的挥发性成分的新馏出物。随着该过程的重复，蒸馏物中挥发性成分的浓度每次都增加。实际上，这种多级蒸馏过程是在精馏塔中以逆流蒸馏(精馏)的形式进行的。精馏塔设置有输入管线和输出管线。待分离的液体混合物(即进料)在输入管线处供给到塔的底部，并在此加热到沸点。产生的蒸汽在塔内向上移动，在顶部(输出管线中)排出，并通过回流冷凝器冷凝。部分冷凝液作为塔顶产品被带走。剩余部分流回精馏塔，并作为液相向下移动。
[0076]
精馏温度，即精馏塔内部的温度，适宜在240℃和280℃之间，优选在245℃和275℃之间，更优选在250℃和270℃之间，甚至更优选在255℃和265℃之间。
[0077]
塔底部的温度适宜在250℃和285℃之间，优选在255℃和280℃之间，更优选在260℃和275℃之间，甚至更优选在255℃和270℃之间。
[0078]
回流冷凝器的温度适宜在110℃和170℃之间，优选在115℃和165℃之间，更优选在120℃和160℃之间，甚至更优选在125℃和155℃之间
[0079]
冷凝物的温度适宜在150℃和210℃之间，优选在155℃和205℃之间，更优选在160℃和200℃之间，甚至更优选在165℃和195℃之间。
[0080]
塔顶压力适宜在0.05毫巴和0.35毫巴之间。
[0081]
塔底压力适宜在2毫巴和6毫巴之间。
[0082]
通常，为了增加馏分中主要甾醇的量，将第一次精馏后得到的底部馏分进行另一个蒸馏或精馏步骤。以这种方式，可以获得基于馏分总重量的25至55重量百分比的甾醇馏分。在挥发性馏分中提取妥尔油沥青中性物质中的甾醇，其回收率至少等于80％。这种馏分通常还包含基于馏分的总重量的0.5至1.7重量百分比的α-谷甾醇。同时，α-谷甾醇以基于非挥发性底部馏分总重量的1至4重量百分比的浓度，积累在非挥发性底部馏分中，而非挥发性底部馏分中的其它甾醇的浓度为基于非挥发性底部馏分总重量的7至30重量百分比。
[0083]
通过结晶β-谷甾醇去除杂质
[0084]
精馏过程提供了一种馏分，该馏分包含大量的主要甾醇(菜油甾醇和β-谷甾醇),但也包含着如α-谷甾醇、氧化胆固醇和白桦脂醇之类的杂质。
[0085]
因此，实施结晶过程以除去上述杂质。
[0086]
当馏分包含少量α-谷甾醇时有利于进行结晶。所述少量α-谷甾醇的量可以是小于或等于2.5重量百分比的馏分的总重量，并通过气相色谱法-火焰离子化α-谷甾醇检测器(gc-fid)分析测定。α-谷甾醇优选小于2.4重量百分比，更优选小于2.0重量百分比，甚至更优选小于1.7重量百分比。
[0087]
当馏分包含大量甾醇时也有利于进行结晶。所述大量甾醇的量可以是基于馏分总重量的至少20重量百分比，并通过气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)分析测定，甾醇的量优选至少21重量百分比，更优选至少22重量百分比，甚至更优选至少25百分比。
[0088]
以下情况更有利于进行结晶：当馏分包含少量的α-谷甾醇，例如小于或等于2重量百分比时，以及包含高含量的甾醇，例如至少20重量百分比时，其中重量百分比是基于馏分的总重量而言，并通过气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)分析确定。
[0089]
馏分首先溶解在混合溶剂中，该混合溶剂是至少四种不同类型溶剂的混合物，并且包括
[0090]-一种或多种非极性溶剂，
[0091]-一种或多种具有酮部分的溶剂，
[0092]-一种或多种一元醇，
[0093]-以及水。
[0094]
每一种溶剂都是为了特定的目的而添加的，并且混合溶剂的溶解能力不同于混合物中的每一种单独成分。
[0095]
特别是非极性溶剂和烷烃，对妥尔油沥青中的二萜和三萜烃以及缩合产物(树脂)表现出很高的溶解能力。烷烃的链越长，其溶解能力越高。非极性溶剂可以选自正戊烷、异戊烷和/或己烷，优选己烷，且己烷由于其适当的沸点，是最佳选择。
[0096]
一元醇由于其化学亲和力，是甾醇的优良溶剂。可以加水来调节醇的溶解能力。一种或多种一元醇可以选自甲醇、乙醇和/或丙醇，其中优选甲醇。
[0097]
具有酮部分的溶剂是丙酮和/或丁酮，优选丙酮。(酮类用于分离α-谷甾醇，因为它们增加了α-谷甾醇的溶解度)。
[0098]
此外，如专利号为us 6465665的专利所述，通过加入水，甾醇可以重新结晶，所述专利内容在此引入作为参考。
[0099]
混合溶剂适宜包含基于混合溶剂的总重量的10至60重量百分比的非极性溶剂，23至40重量百分比的具有酮部分的溶剂，0.5至2.5重量百分比的水和23至40重量百分比的一种或多种一元醇。
[0100]
混合溶剂和馏分之间的质量比在1和2之间，优选质量比为1.25。
[0101]
在结晶过程中，全部馏分必须溶解在混合溶剂中。加热和/或搅拌溶液能增加溶剂的溶解能力。因此，温度可以升高到35℃和60℃之间的溶解温度，优选40℃和55℃之间。
[0102]
一旦全部馏分溶解，停止搅拌并将溶液冷却至15℃至25℃之间，优选冷却至20℃。结晶过程由此开始并持续至少一小时，优选至少两小时。值得一提的是，在混合溶剂存在下进行的室温下结晶温度(15℃至25℃)可以获得不含三萜醇和白桦脂醇的植物甾醇和甾烷醇提取物。这是令人惊讶的结果，因为从专利号为wo 2019/050430中的专利中发现，低于50℃的温度通常导致白桦脂醇和植物甾醇共同结晶。
[0103]
一旦母液中所有的晶体形成，那么这些晶体可以通过过滤进行回收。任选地，可以
在5℃和10℃之间的温度下用混合溶剂洗涤晶体。
[0104]
所述母液也可以回收。在旋转薄膜蒸发器中蒸发其体积的25％和50％之后，浓缩后的母液被冷却到15℃和25℃之间的温度，优选冷却到20℃，以开始新的结晶过程。然后收集晶体，并且可以任选地将晶体在5℃和10℃之间的温度下用混合溶剂洗涤。
[0105]
之后，可以将两部分晶体在例如烘箱或固化室中进行干燥，优选在至少100℃的温度下，更优选在至少110℃的温度下。干燥过程优选可以持续至少1小时，更优选持续至少2小时。所述晶体也可以在减压下(即真空下)干燥以加速干燥过程。
[0106]
洗涤晶体时采用低温(5℃和10℃之间)可以防止收集的晶体重新溶解。然而，由于不可能完全避免任何再溶解，则可以对滤液进行提纯。因此，可以将两种滤液混合并冷却至15℃至25℃之间，优选冷却至20℃，以开始新的结晶过程。
[0107]
这种进行方式允许最大限度地回收植物甾醇和甾烷醇的提取物。植物甾醇和甾烷醇的提取物是结晶的，含有大量的β-谷甾醇，不仅不含如α-谷甾醇之类的杂质，也不含氧化胆甾醇和白桦脂醇。
[0108]
测试和测定方法
[0109]
在蒸馏技术中(也包括精馏)，回流是从上升的蒸汽中冷凝出来液体，并将所述液体返回到烧瓶中。由此可知，“回流比”是沸腾速率和排出速率之间的比值。换句话说，回流比是返回蒸馏塔的回流量与接收器中收集的回流量(作为馏出物)之间的比率。因此，如果5份回流返回蒸馏塔，1份作为馏出物收集，则回流比为5/1。在所有回流都作为馏出物收集的情况下，回流比为零。如果没有收集到馏出物，则不构成回流比，而被称为“全回流”或“平衡”。回流比越高，蒸馏塔中蒸汽/液体接触越多，馏出物的收集速度将越慢。
[0110]
为了确定通过本公开所述的方法获得的提取物或晶体产物的含量，使用了气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)和/或气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)进行分析。
[0111]
气相色谱-质谱联用仪用于辨认成分和给成分定量。所用仪器出自加拿大的一家公司，设备标号为agilent 7890b-gc/5977a-ms。气相色谱柱为5％-苯基-95％-聚甲基硅氧烷相(hp-5ms 60m
×
0.125mm
×
0.125μm)。温度程序如下:开始120℃/5min，加热5℃/min，等温350℃/10min。注射参数为1μl，温度为350℃，分流为1/10。流动相为氦气99.9995％。传输线的温度为360℃。msq程序为tic，扫描模式，28-800da，70ev。使用质谱库nist-11。该分析方法的检测极限为0.01质量百分比。
[0112]
气相色谱法-火焰离子化检测器已用于常规分析。该仪器是chromatec-5000。气相色谱柱为聚甲基硅氧烷相(se-30 30m
×
0.125mm
×
0.125μm)。温度程序如下:开始50℃/5分钟，加热5℃/min，等温350℃/10min。注射参数为1μl，温度为350℃，分流为1/10。流动相是氮气。该分析方法的检测极限也是0.01质量百分比。
[0113]
卡尔
·
费歇尔滴定法是一种使用比色滴定或容量滴定来测定样品中的微量水分析方法。
[0114]
实施例1中的甾醇回收率根据公式(1)确定：
[0115][0116]
类似地，在其他实施例中，根据公式(2)确定甾醇回收率：
[0117]
实施例
[0118]
通过查看以下实施例，将更好地理解本公开的实施例。
[0119]
实施例一：从妥尔油沥青中生成中性物质混合物
[0120]
妥尔油沥青的皂化
[0121]
将装有顶置桨式搅拌器的由非腐蚀性材料制成的反应器，用带有迪安-斯塔克装置头的夹套加热，其中装入2500g妥尔油沥青，并加入溶解在500g水中的375g氢氧化钠。所述妥尔油沥青含有六种主要可转化甾醇(通过gc-ms实验测定)总量的9.3质量百分比。皂化反应在130-135℃下进行3小时，使用迪安-斯塔克装置头分离反应过程中放出的水。应该注意的是，在皂化过程中，反应混合物的体积有相当大的增加。在所述过程结束时，反应混合物通过底部排入铝模具中，瞬间形成了2800克固体皂化沥青。费歇尔滴定法可以测定出，固体皂化沥青中的碱含量为基于固体皂化沥青的总重量的7.5％，水含量为8.1％。熔化温度测定为117.1℃。在该过程开始时，水一直通过dean-stark装置冷凝，1.5小时后，水收集结束，总共有40克的水通过装置头被收集。
[0122]
皂化的妥尔油沥青提取方法
[0123]
皂化妥尔油沥青的提取在150ml的玻璃制索氏提取器中进行。将2-3毫米的固体皂化妥尔油沥青小片放入放置在提取器中的纸筒中。用两倍于索氏提取器容量的溶剂填充底烧瓶，并用回流冷凝器加热至沸腾2小时。用旋转薄膜蒸发器从该提取液中撇去溶剂。
[0124]
表1报告了提取参数和提取物的组成。
[0125]
表1：皂化妥尔油沥青的提取:条件和结果。
[0126][0127]
#
由气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)分析测定。
[0128]
当使用妥尔油沥青作为原料并通过皂化步骤、萃取步骤和浓缩步骤进行处理时，使用甲苯作为萃取溶剂，可以使在中性物质的混合物中甾醇回收率更高。与专利us 6465665中的实施例1中描述的已知结果相比，当使用甲苯作为提取溶剂时，甾醇回收率高11.1％。
[0129]
实施例二：通过一次或多次精馏分离β-谷甾醇
[0130]
首先提供一种从妥尔油沥青获得的中性物质的混合物。这种混合物可以包含基于中性物质混合物的总重量，至多5质量百分比的α-谷甾醇。这种中性物质的混合物可以是实施例1的混合物(参见表1中的组成)或其他一种混合物。对于实施例2，中性物质混合物的组成在表2“进料物质”一栏给出。
[0131]
将混合物连续进料到内径为50mm、高度为450mm的玻璃精馏塔中。该玻璃精馏塔还装有电加热设施以补偿热损失，顶部有一个回流冷凝器和一个粘液分离器。还提供了容积为1升的非挥发性产品收集器以及真空系统。
[0132]
第一批进料
[0133]
将第一批包含从妥尔油沥青获得的中性物质混合物进料送入精馏塔。精馏后，第一馏分含有少量的主要甾醇(7.2重量百分比)，因为甾醇主要集中在非挥发性底部馏分中(26.2重量百分比)。检测到的两种主要甾醇是菜油甾醇和β-谷甾醇。在第一次精馏的馏分中没有检测到α-谷甾醇的存在。第一次精馏的结果和条件见表2。
[0134]
表2:对第一批包含从妥尔油沥青获得的中性物质混合物进料进行第一次精馏。
[0135][0136][0137]
n.d.＝未测出
[0138]
挥发性馏分的精馏产率为17％，非挥发性底部馏分的精馏产率为81.6％。
[0139]
非挥发性底部馏分(参见表2中的组成)通过另一次精馏进行处理。
[0140]
与第一次精馏相比，精馏塔的温度提高了10℃(从250℃提高到260℃)。回流冷凝器的温度也升高了(从120℃升至160℃)。精馏塔的回流比从2/1降低到1/1，这意味着馏出物的收集率增加了。
[0141]
这能够获得具有更高含量的主要甾醇(44.3wt.％)，并检测出少量(1.2wt.％)的α-谷甾醇。
[0142]
第二次精馏的结果和条件见表3。
[0143]
表3：对第一次精馏的底部馏分进行第二次精馏。
[0144][0145][0146]
n.d.＝未测出
[0147]
挥发性馏分的精馏产率为35％，非挥发性底部馏分的精馏产率为65％。
[0148]
非挥发性底部馏分(参见表3中的组成)通过另一次精馏进行处理。
[0149]
与第二次精馏相比，回流冷凝器的温度降低了10℃(从160℃降至150℃)。
[0150]
也检测出少量(1.6wt.％)的α-谷甾醇。第三次精馏的结果和条件见表4。
[0151]
表4：对第二次精馏的底部馏分进行第三次精馏。
[0152][0153][0154]
n.d.＝未测出
[0155]
挥发性馏分的精馏产率为35％，非挥发性底部馏分的精馏产率为65％.
[0156]
值得注意的是，在这种情况下，即在进行了三个精馏步骤之后，挥发性馏分不含有达到检出量的脂肪醇。
[0157]
第二批进料
[0158]
表5报告了采取不同精馏条件，对从妥尔油沥青中获得的第二批中性物质进行精馏的结果。
[0159]
表5：对从妥尔油沥青中获得的第二批中性物质进行精馏。
[0160][0161][0162]
n.d.＝未测出
[0163]
挥发性馏分的精馏产率为66％，非挥发性底部馏分的精馏产率为34％。
[0164]
根据公式(2)计算，挥发性馏分中,妥尔油沥青中性物质的甾醇回收率至少等于80.97％。
[0165]
在表5中描述的精馏条件下，馏分包含高含量的主要甾醇(26.5wt.％)。在馏分中检测到0.7重量百分比的α-谷甾醇。
[0166]
例三：通过结晶β-谷甾醇除去杂质
[0167]
实施例3a
[0168]
对从第二批进料中回收的挥发性馏分(见表5中的组成)的进一步处理如下:
[0169]
将玻璃反应器装上桨式搅拌器、加热夹套、回流冷凝器和1000ml计量装置。将所述玻璃反应器中装入200g原材料和248g包含己烷、一元醇、水和丙酮的混合溶剂，以形成混合物。己烷为45重量百分比，一元醇是甲醇为16重量百分比，水为2重量百分比，丙酮为37重量百分比。然后搅拌混合溶剂和原材料的混合物，并通过反应器夹套加热至45℃。继续搅拌直到内容物完全溶解。之后，停止加热和搅拌，将母液冷却至20℃。将所述溶液在20℃下放置2
小时，使β-谷甾醇结晶。结晶过程产生大的β-谷甾醇晶体，可以小心地从母液中倒出。一旦分离出母液，将结晶物质放在带有布氏烧瓶的布氏漏斗上，用真空装置除去剩余的母液。在6℃的温度下，用150g混合溶剂直接在过滤器上洗涤β-谷甾醇晶体，并收集滤液。
[0170]
将母液放入旋转薄膜蒸发器的烧瓶中，然后除去1/3体积的溶剂。剩下的部分在上述条件下用于进一步结晶β-谷甾醇晶体。使用与上述相同的程序来分离晶体。最后，在6℃的温度下，用150g混合溶剂在布氏漏斗(或过滤器)上洗涤β-谷甾醇晶体，并收集滤液。
[0171]
收集到两种滤液后，将它们混合，并在上述条件下，从中重结晶出另外的β-谷甾醇晶体。
[0172]
在这一阶段，收集该结晶的母液，在旋转薄膜蒸发器中浓缩(温度为120℃，真空压力为10毫巴),从而获得第一批残渣。
[0173]
收集额外的β-谷甾醇晶体，并在6℃下用25g混合溶剂洗涤。回收洗涤溶液，并在旋转薄膜蒸发器中浓缩(温度为120℃，真空为10毫巴),从而获得第二批残渣。
[0174]
表6报告了第一种和第二种残渣的组成。
[0175]
表6：对第二批进料精馏后，馏分结晶的第一批和第二批残渣的组成。
[0176][0177]
n.d.＝未测出；
[0178]
#
由气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)分析测定。
[0179]
第一批残渣的产率测定为71％，第二批残渣的产率确定为10.15％。
[0180]
根据公式(2)，第一批残渣和第二批残渣中的甾醇回收率分别等于37.51％和16.05％。
[0181]
残渣中包含达到可检测量的氧化胆甾醇和α-谷甾醇。从所述洗涤溶液中获得的第
二残渣中杂质的量，在逻辑上，比从由两次滤液制成的浓缩母液中获得的第一残渣中杂质的量要低得多。
[0182]
将所有的β-谷甾醇晶体一起从剩余的溶剂中取出干燥，于115℃的固化室中干燥2小时。表7报告了已经获得的β-谷甾醇晶体的组成。
[0183]
表7：对第二批进料精馏后馏分的结晶
[0184][0185]
n.d.＝未测出；
[0186]
*由气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)分析测定；
[0187]
根据公式(2)进行计算，甾醇回收率等于56.38％。
[0188]
已经测定结晶产率为18.4％，并且可检测到成分总量，如表7所示，为98.2重量百分比。本公开所述方法可以获得95重量百分比的甾醇，其中脂肪醇(蜡)仅为1.8重量百分比。
[0189]
由于本发明的方法(对妥尔油沥青的中性物质进行精馏，随后从馏分中结晶出β-谷甾醇)，最终产物是主要包含β-谷甾醇并且不含氧化胆甾醇、白桦脂醇和α-谷甾醇的晶体。此外，结晶过程的甾醇回收率至少为55％。
[0190]
从妥尔油沥青的中性物质中，即从本公开的方法使用的原料中回收甾醇，回收率至少为45％。
[0191]
实施例3b
[0192]
经过两次精馏后，下面提供与第一批进料相似的第三批进料(与表3中给出的数据相似)。
[0193]
表8报告了重结晶前馏分的内容物以及对图1色谱图的详细分析。
[0194]
图8：结晶前馏分的组成以及在图1中对应的高峰编号和保持时间的分配。
[0195][0196]
§
高峰2对应内标物胆固醇(35.599分钟)
[0197]
#
由气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)分析测定。
[0198]
如实施例3a中所述，从第三批进料中获得β-谷甾醇晶体。
[0199]
表9：第三批进料精馏后馏分的结晶，以及在图2中对应的高峰编号和保留时间的分配
[0200][0201]
n.d.＝未测出
[0202]
§
高峰2对应内标物胆固醇(35.456分钟)
[0203]
#
由气相色谱法-火焰离子化检测器(gc-fid)分析测定。
[0204]
如表9所示，检测到的成分总量为98.04重量百分比。本公开的方法可以获得96.30重量百分比的甾醇和甾烷醇，其中不含任何脂肪醇(蜡)。
[0205]
从通过比较图1和图2可以看出，在样品结晶后获得的色谱图上，编号为10、11和12的高峰已经完全消失。因此，可以得出结论，根据本发明方法获得的植物甾醇和甾烷醇提取物中包含少于植物甾醇和甾烷醇提取物总重量的0.01重量百分比的氧化胆甾醇、白桦脂醇和α-谷甾醇的每一种。